專利名稱：一種防治鴨甲型病毒性肝炎變異株的卵黃抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽類用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種防治鴨病毒性甲型肝炎變異株的卵黃抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
鴨甲型病毒性肝炎(Duck virus hepatitis A, DHAV-A)是由鴨甲型肝炎病毒(DHAV)引起的一種雛鴨高度致死性、急性傳染病。DHAV屬小RNA病毒科，曾與鴨星狀病毒(DAstV)統(tǒng)一命名為鴨肝炎病毒(DHV)，并分為I、II、III3個(gè)血清型，均屬小RNA病毒科，后經(jīng)鑒定，將DHV- 11、0狀-111歸于星狀病毒科，且更名為048丨￥-1、048^-2。DHAV-A主要侵害1-3周齡雛鴨，發(fā)病嚴(yán)重，傳播迅速，雛鴨通常在出現(xiàn)癥狀后Ih內(nèi)死亡，10日齡內(nèi)的雛鴨感 染后死亡率可達(dá)90%以上。該病呈世界性分布，首次報(bào)道于1945年美國(guó)長(zhǎng)島，1954年在英國(guó)病鴨中分離到該病毒，德國(guó)、意大利、印度、法國(guó)、蘇聯(lián)等相繼有本病的發(fā)生。我國(guó)1963年最早報(bào)道了該病在上海地區(qū)出現(xiàn)，之后北京、福建、浙江等多個(gè)地區(qū)爆發(fā)本病，流行區(qū)域廣，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失。鴨甲型病毒性肝炎變異株首先是由印度、埃及報(bào)道，此后美國(guó)在1992年發(fā)現(xiàn)了DHAV的變異株，并命名為I a型。近年來(lái)我國(guó)不斷從病鴨中分離到鴨甲型病毒性肝炎變異株，使用現(xiàn)有的鴨病毒性肝炎疫苗、高免血清或高免卵黃抗體對(duì)變異株的治療效果均不理想，變異株的出現(xiàn)給DHAV-A的防治帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，而提供一種穩(wěn)定性好、治療效果明顯、特異性強(qiáng)、制備安全方便的防治鴨甲型病毒性肝炎變異株的卵黃抗體的制備方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是一種防治鴨病毒性甲型肝炎變異株的卵黃抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟I、制備鴨甲型病毒性肝炎變異株的高免雞蛋(I)選擇健康高產(chǎn)蛋雞隔離飼養(yǎng)，加強(qiáng)飼料營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)加喂專用抗生素制劑以預(yù)防細(xì)菌感染；(2)制備變異株滅活苗A.制水相用冷凍保存的鴨甲型病毒性肝炎變異株毒種稀釋后接種12日齡SPF鴨胚，24_72h后無(wú)菌采集死亡鴨胚尿囊液，然后對(duì)其進(jìn)行滅活程序，取滅活后的尿囊液與無(wú)菌吐溫-80進(jìn)行混合后制成水相；B.制油相取白油、司本和硬脂酸鋁，并將三種混合，攪拌均勻后，高壓滅菌后制成油相；C.制備油乳劑滅活苗將上述步驟I- (2) -A所制得的水相和步驟I- (2) -B所制得的油相進(jìn)行混勻即得;(3)免疫產(chǎn)蛋雞，制備高免雞蛋將步驟I- (2)所制備的變異株滅活苗免疫步驟I- (I)處理過(guò)的高產(chǎn)蛋雞，進(jìn)行免疫程序后收集雞蛋，即為鴨甲型病毒性肝炎變異株的高免雞蛋；2、利用步驟I制備的鴨甲型病毒性肝炎變異株的高免雞蛋制備卵黃抗體(I)分離高免雞蛋蛋黃將步驟I制備的高免雞蛋進(jìn)行消毒程序，然后送入蛋清蛋黃分離機(jī)進(jìn)行蛋黃分離；(2)提取卵黃抗體將步驟2- (I)所分離的蛋黃用TBS作為緩沖液，將卵黃液稀釋4倍后，加入35%的聚乙二醇6000，沉淀脂類，卵黃囊抗體保留在上清液中；再將40%甲醛溶液與該上清液混合，使甲醛的終濃度達(dá)到O. 1% (V/V)，對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾操作后，取濾液4°C保存?zhèn)溆茫?(3)配制、保存將步驟2- (2)所得濾液進(jìn)行鴨甲型病毒性肝炎變異株抗體效價(jià)測(cè)定，用O. 01M、PH7. 2的無(wú)菌PBS稀釋至中和抗體效價(jià)為1:512 ;然后加入終濃度為O. 01%(V/V)的吐溫80作為穩(wěn)定劑，攪拌均勻后進(jìn)行無(wú)菌定量分裝。上述鴨甲型病毒性肝炎變異株毒種為I a型。上述步驟1_(2)_A中的滅活程序是指對(duì)尿囊液用O. 1%的甲醛37°C密封滅活48h。上述步驟I- (2) -A中尿囊液與無(wú)菌吐溫-80的混合比例為30:1 (W/W)。上述步驟I- (2)-B中白油、司本和硬脂酸鋁的混合比例為94:4:2 (W/W/W)。上述步驟I- (2) -C中水相和油相的混合體積比例為1:2。上述步驟I- (3)中的免疫程序是對(duì)免疫產(chǎn)蛋雞進(jìn)行肌肉注射，劑量為2ml/只，免疫次數(shù)為3次，第I次與第2次間隔10天，第2次與第3次間隔14天，3次免疫后正常飼喂一周。上述步驟2- (I)中的消毒程序是對(duì)高免雞蛋用自來(lái)水沖洗干凈，再用O. 05%的百毒殺浸泡3-5min，然后用紗布擦干，用75%乙醇擦一遍晾干。上述步驟2- (2)中的過(guò)濾操作是先充分?jǐn)嚢杈鶆蚝竺芊?0min，再用O. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是(I)本發(fā)明制備的鴨甲型病毒性肝炎變異株卵黃抗體能針對(duì)鴨甲型病毒性肝炎變異株進(jìn)行有效的防治，解決現(xiàn)有疫苗及血清抗體、卵黃抗體對(duì)變異株治療無(wú)效的困境；(2)同時(shí)本發(fā)明采用聚乙二醇(PEG)法提取鴨甲型病毒性肝炎變異株卵黃抗體，該法安全、價(jià)格低廉，適于大規(guī)模生產(chǎn)，且制備的卵黃抗體純度高、效價(jià)高、性質(zhì)穩(wěn)定、易于保存。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。一種防治鴨病毒性甲型肝炎變異株的卵黃抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟I、制備鴨甲型病毒性肝炎變異株的高免雞蛋(I)選擇健康高產(chǎn)蛋雞隔離飼養(yǎng)，加強(qiáng)飼料營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)加喂專用抗生素制劑以預(yù)防細(xì)菌感染；(2)制備變異株滅活苗A.制水相用冷凍保存的鴨甲型病毒性肝炎變異株毒種稀釋后接種12日齡SPF鴨胚，24_72h后無(wú)菌采集死亡鴨胚尿囊液，然后對(duì)其進(jìn)行滅活程序，取滅活后的尿囊液與無(wú)菌吐溫-80 進(jìn)行混合后制成水相；B.制油相取白油、司本和硬脂酸鋁，并將三種混合，攪拌均勻后，高壓滅菌后制成油相；C.制備油乳劑滅活苗將上述步驟I- (2) -A所制得的水相和步驟I- (2) -B所制得的油相進(jìn)行混勻即得;(3)免疫產(chǎn)蛋雞，制備高免雞蛋將步驟I- (2)所制備的變異株滅活苗免疫步驟I- (I)處理過(guò)的高產(chǎn)蛋雞，進(jìn)行免疫程序后收集雞蛋，即為鴨甲型病毒性肝炎變異株的高免雞蛋；2、利用步驟I制備的鴨甲型病毒性肝炎變異株的高免雞蛋制備卵黃抗體( I)分離高免雞蛋蛋黃將步驟I制備的高免雞蛋進(jìn)行消毒程序，然后送入蛋清蛋黃分離機(jī)進(jìn)行蛋黃分離；(2)提取卵黃抗體將步驟2- (I)所分離的蛋黃用TBS作為緩沖液，將卵黃液稀釋4倍后，加入35%的聚乙二醇6000，沉淀脂類，卵黃囊抗體保留在上清液中；再將40%甲醛溶液與該上清液混合，使甲醛的終濃度達(dá)到O. 1% (V/V)，對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾操作后，取濾液4°C保存?zhèn)溆茫?3)配制、保存將步驟2- (2)所得濾液進(jìn)行鴨甲型病毒性肝炎變異株抗體效價(jià)測(cè)定，用O. 01M、PH7. 2的無(wú)菌PBS稀釋至中和抗體效價(jià)為1:512 ;然后加入終濃度為O. 01%(V/V)的吐溫80作為穩(wěn)定劑，攪拌均勻后進(jìn)行無(wú)菌定量分裝。上述鴨甲型病毒性肝炎變異株毒種為I a型。上述步驟1_(2)_A中的滅活程序是指對(duì)尿囊液用O. 1%的甲醛37°C密封滅活48h。上述步驟I- (2) -A中尿囊液與無(wú)菌吐溫-80的混合比例為30:1 (W/W)。上述步驟I- (2)-B中白油、司本和硬脂酸鋁的混合比例為94:4:2 (W/W/W)。上述步驟I- (2) -C中水相和油相的混合體積比例為1:2。上述步驟I- (3)中的免疫程序是對(duì)免疫產(chǎn)蛋雞進(jìn)行肌肉注射，劑量為2ml/只，免疫次數(shù)為3次，第I次與第2次間隔10天，第2次與第3次間隔14天，3次免疫后正常飼喂一周。上述步驟2- (I)中的消毒程序是對(duì)高免雞蛋用自來(lái)水沖洗干凈，再用O. 05%的百毒殺浸泡3-5min，然后用紗布擦干，用75%乙醇擦一遍晾干。
上述步驟2-(2)中的過(guò)濾操作是先充分?jǐn)嚢杈鶆蚝竺芊?0min，再用O. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于 本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1. 一種防治鴨病毒性甲型肝炎變異株的卵黃抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1、制備鴨甲型病毒性肝炎變異株的高免雞蛋 (1)選擇健康高產(chǎn)蛋雞隔離飼養(yǎng)，加強(qiáng)飼料營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)加喂專用抗生素制劑以預(yù)防細(xì)菌感染； (2)制備變異株滅活苗 A.制水相 用冷凍保存的鴨甲型病毒性肝炎變異株毒種稀釋后接種12日齡SPF鴨胚，24-72h后無(wú)菌采集死亡鴨胚尿囊液，然后對(duì)其進(jìn)行滅活程序，取滅活后的尿囊液與無(wú)菌吐溫-80進(jìn)行混合后制成水相； B.制油相 取白油、司本和硬脂酸鋁，并將三種混合，攪拌均勻后，高壓滅菌后制成油相； C.制備油乳劑滅活苗 將上述步驟I- (2)-A所制得的水相和步驟I- (2)-B所制得的油相進(jìn)行混勻即得； (3)免疫產(chǎn)蛋雞，制備高免雞蛋 將步驟I- (2)所制備的變異株滅活苗免疫步驟I- (I)處理過(guò)的高產(chǎn)蛋雞，進(jìn)行免疫程序后收集雞蛋，即為鴨甲型病毒性肝炎變異株的高免雞蛋； 2、利用步驟I制備的鴨甲型病毒性肝炎變異株的高免雞蛋制備卵黃抗體 (1)分離高免雞蛋蛋黃 將步驟I制備的高免雞蛋進(jìn)行消毒程序，然后送入蛋清蛋黃分離機(jī)進(jìn)行蛋黃分離； (2)提取卵黃抗體 將步驟2- (I)所分離的蛋黃用TBS作為緩沖液，將卵黃液稀釋4倍后，加入35%的聚乙二醇6000，沉淀脂類，卵黃囊抗體保留在上清液中；再將40%甲醛溶液與該上清液混合，使甲醛的終濃度達(dá)到O. 1% (V/V)，對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾操作后，取濾液4°C保存?zhèn)溆茫? (3)配制、保存 將步驟2- (2)所得濾液進(jìn)行鴨甲型病毒性肝炎變異株抗體效價(jià)測(cè)定，用O. 01M、pH7. 2的無(wú)菌PBS稀釋至中和抗體效價(jià)為1:512 ;然后加入終濃度為O. 01% (V/V)的吐溫80作為穩(wěn)定劑，攪拌均勻后進(jìn)行無(wú)菌定量分裝。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種防治鴨病毒性甲型肝炎變異株的卵黃抗體的制備方法，其特征在于所述鴨甲型病毒性肝炎變異株毒種為I a型。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種防治鴨病毒性甲型肝炎變異株的卵黃抗體的制備方法，其特征在于所述步驟I- (2) -A中的滅活程序是指對(duì)尿囊液用O. 1%的甲醛37°C密封滅活48h。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種防治鴨病毒性甲型肝炎變異株的卵黃抗體的制備方法，其特征在于所述步驟I- (2) -A中尿囊液與無(wú)菌吐溫-80的混合比例為30:1 (W/W)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種防治鴨病毒性甲型肝炎變異株的卵黃抗體的制備方法，其特征在于所述步驟I- (2)-B中白油、司本和硬脂酸鋁的混合比例為94:4:2 (W/W/W)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種防治鴨病毒性甲型肝炎變異株的卵黃抗體的制備方法，其特征在于所述步驟I- (2)-C中水相和油相的混合體積比例為1:2。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種防治鴨病毒性甲型肝炎變異株的卵黃抗體的制備方法，其特征在于所述步驟I- (3)中的免疫程序是對(duì)免疫產(chǎn)蛋雞進(jìn)行肌肉注射，劑量為2ml/只，免疫次數(shù)為3次，第I次與第2次間隔10天，第2次與第3次間隔14天，3次免疫后正常飼喂一周O
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種防治鴨病毒性甲型肝炎變異株的卵黃抗體的制備方法，其特征在于所述步驟2- (I)中的消毒程序是對(duì)高免雞蛋用自來(lái)水沖洗干凈，再用O. 05%的百毒殺浸泡3-5min，然后用紗布擦干，用75%乙醇擦一遍晾干。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種防治鴨病毒性甲型肝炎變異株的卵黃抗體的制備方法，其特征在于所述步驟2- (2)中的過(guò)濾操作是先充分?jǐn)嚢杈鶆蚝竺芊?0min，再用O. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種防治鴨病毒性甲型肝炎變異株的卵黃抗體的制備方法，先制備鴨甲型病毒性肝炎變異株的高免雞蛋，然后利用步驟1制備的鴨甲型病毒性肝炎變異株的高免雞蛋制備卵黃抗體，本發(fā)明制備的鴨甲型病毒性肝炎變異株卵黃抗體能針對(duì)鴨甲型病毒性肝炎變異株進(jìn)行有效的防治，解決現(xiàn)有疫苗及血清抗體、卵黃抗體對(duì)變異株治療無(wú)效的困境；同時(shí)本發(fā)明采用聚乙二醇(PEG)法提取鴨甲型病毒性肝炎變異株卵黃抗體，該法安全、價(jià)格低廉，適于大規(guī)模生產(chǎn)，且制備的卵黃抗體純度高、效價(jià)高、性質(zhì)穩(wěn)定、易于保存。
文檔編號(hào)C07K16/02GK102875672SQ201210375380
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者焦偉麗, 程雪嬌, 高銳, 于貴菊 申請(qǐng)人:天津市中升挑戰(zhàn)生物工程有限公司