C型肝炎病毒顆粒形成促進(jìn)劑和c型肝炎病毒顆粒的產(chǎn)生方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種促進(jìn)C型肝炎病毒（HCV:胎patitisCVirus)感染培養(yǎng)細(xì)胞中的 HCV顆粒形成的HCV顆粒形成促進(jìn)劑和HCV顆粒產(chǎn)生增強(qiáng)方法。
[0002] 本申請(qǐng)要求通過參考而援引于此的日本申請(qǐng)?zhí)卦?012-215474號(hào)作為優(yōu)先權(quán)。
【背景技術(shù)】
[0003] 自1989年克隆出HCV基因之后，使培養(yǎng)細(xì)胞感染C型肝炎患者血清中的HCV從而 制作病毒增殖細(xì)胞系的方法的建立便成為HCV研究的最大課題。
[0004] 全世界有2億HCV攜帶者，在日本國內(nèi)也有約200萬人。HCV感染者患上慢性肝炎 的概率非常高，一部分患者的慢性肝炎會(huì)進(jìn)一步發(fā)展成肝硬化、肝癌。目P，HCV是引起重癥 疾病的誘因病毒。目前，大多數(shù)C型肝炎患者大多采用同時(shí)使用干擾素（IFN)和作為抗病 毒藥的利己韋林巧ibavirin)的治療方法。但是，HCV感染者中有很多屬于IFN難W發(fā)揮 作用的類型，上述治療方法存在治療效果低運(yùn)一問題。另外，眾所周知，IFN會(huì)對(duì)患者產(chǎn)生 很強(qiáng)的副作用。因此，用于防止HCV的感染擴(kuò)大W及消滅HCV的新型治療藥和新型疫苗的 開發(fā)已成為當(dāng)務(wù)之急。
[0005] 另一方面，HCV的感染性克隆在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等級(jí)中僅在移植了黑猩猩或人類肝細(xì)胞 的嵌合體小鼠（chimeramouse)中可W增殖，但還未從患者的檢體中獲得容易感染培養(yǎng)細(xì) 胞的病毒，而且，因?yàn)閭惱韱栴}和成本方面的原因，黑猩猩的利用毫無進(jìn)展，很難對(duì)于研究 做出貢獻(xiàn)。有報(bào)告稱制作出了能夠?qū)CV的亞基因組復(fù)制到培養(yǎng)細(xì)胞中并使其增殖的HCV 亞基因組RNA復(fù)制子系統(tǒng)（非專利文獻(xiàn)1~4、專利文獻(xiàn)1、2)。由此，能夠利用培養(yǎng)細(xì)胞來 分析HCV的復(fù)制機(jī)制。上述HCV亞基因組RNA復(fù)制子是利用新霉素抗性基因W及連接在其 下游的EMCV-IRES取代位于HCV基因組RNA的5'非翻譯區(qū)中的HCVIRES下游的結(jié)構(gòu)蛋白 的編碼區(qū)而獲得的。通過將該RNA復(fù)制子導(dǎo)入人肝癌細(xì)胞化h7中，并在新霉素存在下進(jìn)行 培養(yǎng)，RNA復(fù)制子在化h7細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制，運(yùn)已得到證明。
[0006] 之后，有報(bào)告稱制成了HCV的全基因組RNA自主復(fù)制的HCV全基因組RNA復(fù)制子， 還制成了反映HCV的生命周期（從病毒吸附、侵入到形成病毒顆粒和釋放到細(xì)胞外）的感 染增殖系統(tǒng)（非專利文獻(xiàn)5~7)。為了更加高效地開發(fā)疫苗等，期待開發(fā)出能夠更加高效 地在感染細(xì)胞內(nèi)形成HCV顆粒W及將其釋放到細(xì)胞外的系統(tǒng)。 【現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)】 【非專利文獻(xiàn)】
[0007]非專利文獻(xiàn)1 :Science，285 :110-113,1999 非專利文獻(xiàn)2 :Science，290 :1972-74,2000 非專利文獻(xiàn)3 :J. Virol.，75 :12047-57,2001 非專利文獻(xiàn)4 :Gastroenterology，125 :1808-17, 2003非專利文獻(xiàn)5 :Nat. Med.，11 :791-796,2005 非專利文獻(xiàn)6 :Science，309 :623-626, 2005 非專利文獻(xiàn)7 :Proc.化tl. Acad. Sci. USA, 102 :9294-9299, 2005 【專利文獻(xiàn)】 陽00引專利文獻(xiàn)1:日本公報(bào)、特開2001-17187號(hào) 專利文獻(xiàn)2:國際公開小冊(cè)W02004/104198A1

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的課題在于提供一種能夠促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞中的HCV顆粒的形成的HCV顆粒形 成促進(jìn)劑，進(jìn)而，本發(fā)明的課題在于提供一種HCV顆粒產(chǎn)生增強(qiáng)方法。另外，本發(fā)明的課題 在于提供一種抗HCV藥物候選物質(zhì)的評(píng)價(jià)方法和HCV疫苗的制造方法。
[0010] 本發(fā)明人等為解決上述課題而進(jìn)行了認(rèn)真研究后發(fā)現(xiàn)，抑制素（statin)或其藥 學(xué)上可接受的鹽能夠有效地促進(jìn)HCV顆粒的形成，從而完成了本發(fā)明中有關(guān)HCV顆粒形成 促進(jìn)劑的發(fā)明。另外，發(fā)現(xiàn)通過在該HCV顆粒形成促進(jìn)劑和抗HCV藥物候選物質(zhì)的存在下 培養(yǎng)HCV感染細(xì)胞，能夠?qū)笻CV藥物候選物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而也完成了有關(guān)抗HCV藥物候 選物質(zhì)的評(píng)價(jià)方法的本發(fā)明。進(jìn)而，發(fā)現(xiàn)利用通過HCV顆粒產(chǎn)生增強(qiáng)方法產(chǎn)生的HCV顆粒 能夠制造HCV疫苗，從而完成了有關(guān)HCV疫苗的制造方法的本發(fā)明。 W11]旨P，本發(fā)明由W下內(nèi)容構(gòu)成。 1. 一種HCV顆粒形成促進(jìn)劑，其作為活性組分而含有抑制素或其藥學(xué)上可接受的鹽。 2. 如上述1所述的HCV顆粒形成促進(jìn)劑，其中，所述抑制素是選自由洛伐他汀、氣伐他 汀、辛伐他汀、阿托伐他汀W及普伐他汀組成的群中的一種或多種抑制素。 3. 如上述1或2所述的HCV顆粒形成促進(jìn)劑，其中，含有能夠產(chǎn)生抑制素或其藥學(xué)上可 接受的鹽的微生物的培養(yǎng)提取物。 4. 如上述3所述的HCV顆粒形成促進(jìn)劑，其中，所述微生物為曲霉屬絲狀真菌。 5. -種HCV顆粒產(chǎn)生增強(qiáng)方法，其是在上述1~4中任一項(xiàng)所述的HCV顆粒形成促進(jìn) 劑的存在下培養(yǎng)HCV感染細(xì)胞。 6. 如上述5所述的HCV顆粒產(chǎn)生增強(qiáng)方法，其中，在所述HCV感染細(xì)胞內(nèi)形成HCV蛋白 質(zhì)后，添加上述1~4中任一項(xiàng)所述的HCV顆粒形成促進(jìn)劑進(jìn)行培養(yǎng)。 7. -種肥V疫苗的制造方法，其通過使肥V失活而進(jìn)行制造，該肥V通過上述5或6所 述的HCV顆粒產(chǎn)生增強(qiáng)方法進(jìn)行產(chǎn)生。 8. -種肥V疫苗，其根據(jù)上述7所述的制造方法進(jìn)行制造。 9. 一種抗HCV藥物候選物質(zhì)的評(píng)價(jià)方法，其是在上述1~4中任一項(xiàng)所述的HCV顆粒 形成促進(jìn)劑的存在下，將HCV感染細(xì)胞與抗HCV藥物候選物質(zhì)一同進(jìn)行培養(yǎng)，從而對(duì)阻礙 HCV顆粒的形成的強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)價(jià)。 10. 如上述9所述的抗HCV藥物候選物質(zhì)的評(píng)價(jià)方法，其包括W下工序： 1) 將上述1~4中任一項(xiàng)所述的HCV顆粒形成促進(jìn)劑和抗HCV藥物候選物質(zhì)添加至 HCV感染細(xì)胞中的工序； 2) 對(duì)HCV感染細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)工序； 3) 測(cè)量出培養(yǎng)后的HCV顆粒的數(shù)量，從而對(duì)阻礙HCV顆粒的形成的強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)價(jià)的評(píng) 價(jià)工序。 (發(fā)明效果）
[0012] 通過利用本發(fā)明的HCV顆粒形成促進(jìn)劑來培養(yǎng)HCV感染細(xì)胞，能夠促進(jìn)HCV顆粒 的形成，從而提高HCV顆粒的產(chǎn)生效率。根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠增加HCV感染培養(yǎng)細(xì)胞中 的HCV顆粒的產(chǎn)生，并且能夠?qū)笻CV藥物候選物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。進(jìn)而，使用通過本發(fā)明得到 的HCV顆粒，能夠高效地產(chǎn)生HCV疫苗。
【附圖說明】
[0013] 圖1是表示作為制造本發(fā)明的HCV顆粒形成促進(jìn)劑的一例，從±曲霉的菌體提取 物進(jìn)行純化的流程的圖。其中，示出了各純化工序中的各溶液的半抑制濃度（ICJ和半數(shù) 細(xì)胞毒性濃度（CCJ。（實(shí)施例1) 圖2是表示將本發(fā)明的HCV顆粒形成促進(jìn)劑添加至培養(yǎng)細(xì)胞中時(shí)的病毒滴度的測(cè)定結(jié) 果的圖。（實(shí)施例2) 圖3是表示向HCV感染后的培養(yǎng)細(xì)胞添加HCV顆粒形成促進(jìn)劑的時(shí)期的研究結(jié)果的 圖。（實(shí)施例3) 圖4是表示向HCV感染后的培養(yǎng)細(xì)胞添加HCV顆粒形成促進(jìn)劑的時(shí)期的研究結(jié)果的 圖。（實(shí)施例4) 圖5是表示將本發(fā)明的HCV顆粒形成促進(jìn)劑添加至培養(yǎng)細(xì)胞中時(shí)在細(xì)胞內(nèi)外形成的病 毒顆粒的測(cè)定結(jié)果的圖。（實(shí)施例5) 圖6是表示將本發(fā)明的HCV顆粒形成促進(jìn)劑添加至培養(yǎng)細(xì)胞中時(shí)細(xì)胞內(nèi)的RNA拷貝數(shù) 的測(cè)定結(jié)果的圖。（實(shí)施例6) 圖7是表示通過免疫染色而確認(rèn)將本發(fā)明的HCV顆粒形成促進(jìn)劑添加至培養(yǎng)細(xì)胞中時(shí) 細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)形成能力的結(jié)果的圖。（實(shí)施例6)
【具體實(shí)施方式】
[0014] 本發(fā)明設(shè)及一種HCV顆粒形成促進(jìn)劑，其W抑制素（statin)或其藥學(xué)上可接受的 鹽作為活性組分。
[0015] 在本說明書中，抑制素是指通過阻礙HMG-CoA還原酶（3-徑基-3-甲基戊二酸 單酷輔酶A還原酶）的作用而抑制肝臟中的膽固醇的生物合成，從而被用作高膽固醇血 癥的治療藥的藥物，其包括洛伐他汀化ovastatin)、辛伐他?。⊿imvastatin)、氣伐他 汀鋼（Fluvastatinsodium)、普伐他?。≒ravastatin)、阿托伐他汀巧（Atorvastatin Calcium)、匹伐他汀巧（Pitavastatincalcium)、瑞舒伐他汀巧（Rosuvastatincalcium) 等，其中，HMG-CoA還原酶是膽固醇的生物合成途徑之一的甲徑戊酸途徑的限速酶。
[0016] 在此，洛伐他汀是指CAS編號(hào)為 75330-75-5 的（lS，3R，7S，8S，8aR)-8-[2-((2R， 4R) -4-徑基-6-氧代四氨-2H-化喃-2-基）乙基]-3, 7-二甲基-1，2, 3, 7,8,8a-六 氨-1-糞基，辛伐他汀是指CAS編號(hào)為 79902-63-9 的（1S，3R，7S，8S，8aR) -8-[2-[ (2R， 4R) -4-?基-6-氧代四氨[I比喃-2-基]乙基]-3, 7-二甲基-1，2, 3, 7,8,8a-六氨-1-糞基， 氣伐他汀鋼是指CAS編號(hào)為93957-55-2的（3R，5S，6巧-7-[3-(4-氣苯基）-1-(1-甲基乙 基）-IH-嗎I噪-2-基]-3, 5-二徑基-6-庚締酸鋼，普伐他汀是指CAS編號(hào)為81093-70-6的 (15，0私5私8曰0)-1，2,6,7,8,8曰-六氨-0，5,6 0-^徑基-2 0-甲基-8曰-[做-2-甲 基-I-氧代下氧基]-IP-糞庚締酸，阿托伐他汀巧是指CAS編號(hào)為134523-03-8的（3R， 5R)-7-[2-(4-氣苯基）-5-異丙基-3-苯基-4-[(苯氨基）幾基]-IH-化咯-1-基]-3， 5-二徑基庚締酸巧，匹伐他汀巧是指CAS編號(hào)為147511-69-1的（3R，5S，6巧-7-(2-環(huán)丙 基-4- (4-氣苯基）哇嘟-3-基）-3, 5-二徑基庚-6-締酸，瑞舒伐他汀巧是指CAS編號(hào)為 14709