灌注脫細胞化的肝臟在胰島細胞再細胞化中的用圖
【專利說明】灌注脫細胞化的肝臟在胰島細胞再細胞化中的用途
[0001]相關(guān)串請的交叉引用
[0002]本申請要求于2013年3月15日提交的美國申請序列號61/789，927的權(quán)益，將其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。
[0003]發(fā)明背景
[0004]組織工程是通過植入細胞、支架以及可溶性介質(zhì)的組合來尋求修復或再生損傷或病變的組織和器官的快速發(fā)展的領(lǐng)域。通常在2維(2D)培養(yǎng)條件下實現(xiàn)當前的干細胞分化和原代細胞培養(yǎng)。該系統(tǒng)允許特定細胞群的擴增，但是其維持功能性細胞表型以維持高密度的細胞培養(yǎng)以及長期原代或分化的細胞功能的能力有限制。例如，相比某些細胞療法所需的大量原代細胞的有限可獲得性，在保留分化為特定種系的能力的同時，干細胞的數(shù)量可以大量擴增。對于干細胞命運的控制(例如分化)，不管是在體內(nèi)還是在體外，主要都歸因于基因和分子介質(zhì)(例如生長因子和轉(zhuǎn)錄因子)。盡管干細胞和祖細胞的分化可導致細胞具有合適的種系特異或組織特異的基因表達，但是分化的細胞可能缺乏體外或體內(nèi)應用所需的功能特性。
[0005]發(fā)曰月概沐
[0006]本發(fā)明提供制備移植物的方法，所述移植物含有哺乳動物肝臟、肝葉或其一部分的再細胞化的細胞外基質(zhì)。在一個實施方案中，所述部分的總膨脹體積大于或等于約15cm3。所述方法包括選擇哺乳動物肝臟、肝葉或其一部分的灌注脫細胞化的細胞外基質(zhì)以及兩種細胞群。第一哺乳動物細胞群包括內(nèi)皮細胞或者能夠分化為內(nèi)皮細胞的干細胞或祖細胞，并且第二哺乳動物細胞群包括胰島細胞、β細胞、胰島素樣細胞或者能夠分化為胰島細胞或β細胞的干細胞或祖細胞。使灌注脫細胞化的細胞外基質(zhì)與兩種細胞群在一定條件下相接觸一段時間，所述條件和接觸時間能提供灌注脫細胞化的細胞外基質(zhì)的脈管系統(tǒng)的再內(nèi)皮化，以及用胰島細胞、β細胞或胰島素樣細胞使灌注脫細胞化的細胞外基質(zhì)再細胞化，或者在灌注脫細胞化的細胞外基質(zhì)中使干細胞或祖細胞再細胞化并分化和功能成熟為胰島細胞、β細胞或胰島素樣細胞。在一個實施方案中，第一群和第二群中的細胞與脫細胞化的細胞外基質(zhì)是異種的。在一個實施方案中，第一群和第二群中的細胞與脫細胞化的細胞外基質(zhì)是同種異體的。在一個實施方案中，第一群中的細胞、第二群中的細胞或者這兩個群中的細胞包含iPS細胞。在一個實施方案中，胰島細胞、β細胞或胰島素樣細胞被包封。在一個實施方案中，第一群中的細胞、第二群中的細胞或者這兩個群中的細胞是原代細胞。在一個實施方案中，第一群中的細胞、第二群中的細胞或者這兩個群中的細胞是胚胎干細胞。在一個實施方案中，第一群、第二群或這兩個群包含多種不同的細胞類型。在一個實施方案中，灌注脫細胞化的細胞外基質(zhì)含有完整的血管細胞外基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。在一個實施方案中，通過注射或灌注或其組合使第一群中的細胞與細胞外基質(zhì)相接觸。在一個實施方案中，通過注射或灌注或其組合使第二群中的細胞與細胞外基質(zhì)相接觸。
[0007]在一個實施方案中，所述方法包括在哺乳動物中植入細胞外基質(zhì)。在一個實施方案中，在細胞外基質(zhì)與第一群、第二群或這兩個群相接觸之前，將其植入哺乳動物中。在一個實施方案中，在細胞外基質(zhì)與第一群相接觸之后且與第二群相接觸之前，將其植入哺乳動物中。在一個實施方案中，在細胞外基質(zhì)與第二群相接觸之后且與第一群相接觸之前，將其植入哺乳動物中。在一個實施方案中，在細胞外基質(zhì)與第一群和第二群相接觸之后，將其移植進哺乳動物。
[0008]還提供了在胰島素控制缺乏或降低的哺乳動物中增強胰島素控制的方法。該方法包括提供具有哺乳動物細胞群的哺乳動物肝臟、肝葉或其一部分的再內(nèi)皮化的細胞外基質(zhì)，所述哺乳動物細胞群包含胰島細胞、β細胞、胰島樣細胞或者能夠分化為胰島細胞或β細胞的干細胞或祖細胞。可通過向哺乳動物肝臟、肝葉或其一部分的脫細胞化的細胞外基質(zhì)中引入哺乳動物內(nèi)皮細胞或者能夠分化為哺乳動物內(nèi)皮細胞的細胞來制備再內(nèi)皮化的基質(zhì)。向胰島素控制缺乏或降低的哺乳動物中引入具有細胞群的再內(nèi)皮化的基質(zhì)，以提供哺乳動物中血液葡萄糖的控制，所述細胞群包含胰島細胞、β細胞、胰島樣細胞或者能夠分化為胰島細胞或β細胞的干細胞或祖細胞。
[0009]同樣提供了在胰島素控制缺乏或降低的哺乳動物中增強胰島素控制的方法。該方法包括提供哺乳動物肝臟、肝葉或其一部分的再內(nèi)皮化的細胞外基質(zhì)，所述再內(nèi)皮化的細胞外基質(zhì)通過向哺乳動物肝臟、肝葉或其一部分的脫細胞化的細胞外基質(zhì)引入哺乳動物內(nèi)皮細胞或者能夠分化為哺乳動物內(nèi)皮細胞的細胞制備得到。向胰島素控制缺乏或降低的哺乳動物中引入再內(nèi)皮化的基質(zhì)，以及以提供哺乳動物中血液葡萄糖控制的有效量，向所述哺乳動物中引入細胞群，包含胰島細胞、β細胞、胰島樣細胞或者能夠分化為胰島細胞或β細胞的干細胞或祖細胞。
[0010]本發(fā)明還提供了在胰島素控制缺乏或降低的哺乳動物中增強胰島素控制的方法。該方法包括提供胰島素控制缺乏或降低并且具有哺乳動物肝臟、肝葉或其一部分的植入的再內(nèi)皮化的基質(zhì)的哺乳動物?？赏ㄟ^向哺乳動物肝臟、肝葉或其一部分的脫細胞化的細胞外基質(zhì)引入哺乳動物內(nèi)皮細胞來制備再內(nèi)皮化的基質(zhì)。以提供哺乳動物中血液葡萄糖控制的有效量，向哺乳動物中引入細胞群，包括胰島細胞、β細胞、胰島樣細胞或者能夠分化為胰島細胞的干細胞或祖細胞。可以用本領(lǐng)域已知的材料和方法將細胞群包封。
[0011]附圖簡要說明
[0012]圖1A顯示了灌注脫細胞化的豬肝臟的照片。
[0013]圖1B-C分別顯示了灌注脫細胞化的豬肝臟的血管和實質(zhì)基質(zhì)的掃描電子顯微鏡(SEM)照片。
[0014]圖2提供了浸入脫細胞化的大鼠肝臟的總視圖，其中在低放大倍數(shù)(左)和高放大倍數(shù)(右)下都可觀測到基質(zhì)磨損。
[0015]圖3顯示了浸入脫細胞化的大鼠肝臟(Α和B)以及灌注脫細胞化的大鼠肝臟(C和D)的SEM照片。
[0016]圖4提供了浸入脫細胞化的肝臟(Α，Η&Ε染色；Β，三色染色)和灌注脫細胞化的肝臟(C，Η&Ε染色；D，三色染色)的組織結(jié)構(gòu)。
[0017]發(fā)明詳述
[0018]本發(fā)明提供工程化的細胞和ECM，其通過物理以及分子相互作用，經(jīng)由控制那些細胞的環(huán)境而直接控制細胞行為。特別地，本發(fā)明提供工程化的具有灌注脫細胞化的肝臟ECM的器官和組織，所述灌注脫細胞化的肝臟ECM移入有包含細胞組合的細胞群，并經(jīng)歷了培養(yǎng)條件，例如包括灌注可溶性介質(zhì)，該ECM結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)條件產(chǎn)生功能性細胞。特別地，本發(fā)明提供原代細胞的生長和功能維持，包括胎兒來源的細胞，例如從胎兒細胞或新生兒細胞中獲得的器官特異的細胞(例如，定向特定種系但最終未分化的細胞)。與在體內(nèi)移植以使hES細胞分化為胰島素產(chǎn)生細胞中的用途相比，本發(fā)明提供肝臟ECM在為胰島素產(chǎn)生細胞提供結(jié)構(gòu)或者實現(xiàn)分化為功能性β細胞中的用途，所述功能性β細胞在應答葡萄糖刺激時，能夠調(diào)節(jié)胰島素。在一個實施方案中，本發(fā)明的分化的細胞具有體內(nèi)相應正常細胞的至少20%的功能。
[0019]本發(fā)明提供在該基質(zhì)中對胰島細胞、β細胞或胰島樣細胞的維持、或者干細胞或祖細胞分化和/或成熟為胰島細胞、β細胞或胰島素樣細胞或其組合有用的灌注脫細胞化的肝臟、肝葉或其一部分的細胞外基質(zhì)(ECM)以及系統(tǒng)。原代細胞是從生物體中獲得細胞，然后可能在體外培養(yǎng)，但是那些細胞不能無限增殖。分化細胞包括原代細胞和已經(jīng)體外分化的細胞，例如在本發(fā)明的灌注脫細胞化的基質(zhì)中的干細胞或祖細胞。在一個實施方案中，至少5%、10%或20%或更多的分化細胞具有功能成熟表型。組織是具有共同結(jié)構(gòu)和功能的細胞群體，例如上皮組織、結(jié)締組織、肌肉組織(骨骼肌、心肌或平滑肌)以及神經(jīng)組織，并且包括覆蓋或內(nèi)襯或連結(jié)器官的柔軟的層。器官是以結(jié)構(gòu)單元連接在一起以提供共同功能的一些組織(兩種或更多)。如本文所使用，肝臟的一部分、肝葉和肝臟包括血管化的結(jié)構(gòu)。
[0020]在一個實施方案中，本發(fā)明提供3D肝臟來源的ECM支架在維持胰島細胞、β細胞、胰島樣細胞、干細胞和/或祖細胞，以及在干細胞和祖細胞類型分化和/或成熟為胰島細胞、β細胞或胰島樣細胞中的用途。分化是這樣的過程，細胞通過該過程獲得不同于原始細胞群的新表型，例如不同的細胞基因和/或蛋白表達和/或功能。成熟進一步將細胞群的表型闡明為具有體內(nèi)細胞群中的細胞的正常成熟功能能力。在一個實施方案中，支架是灌注脫細胞化的ECM肝葉，例如一部分肝臟ECM。在另一實施方案中，支架是灌注脫細胞化的ECM肝臟?？蓪⒋祟愔Ъ茉O(shè)計用于治療的不同細胞類型的遞送系統(tǒng)。
[0021]與其它脫細胞化技術(shù)(如基于浸入的脫細胞化)相比，來自器官或組織(如肝臟或肝葉)的灌注脫細胞化的ECM保留了更多的天然微結(jié)構(gòu)，包括完整的血管和/或微血管系統(tǒng)。例如，來自肝臟或肝葉的灌注脫細胞化的ECM保留了膠原含量和其它結(jié)合和信號因子以及脈管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，因而為引入的細胞的再內(nèi)皮化提供了環(huán)境。在一個實施方案中，在合適的條件下，利用灌注脫細胞化的ECM的脈管系統(tǒng)，用介質(zhì)中的內(nèi)皮細胞灌注來自肝臟、肝葉或其一部分的灌注脫細胞化的ECM，所述合適的條件包括合適的壓力和流動，以模擬通常存在于生物體中的條件。人體尺寸的器官的正常壓力為約40至約200mm Hg，產(chǎn)生的流動速率取決于進入的灌注血管直徑。
[0022]在一個實施方案中，本發(fā)明提供由灌注脫細胞化的基質(zhì)和細胞(例如分化為特定功能性細胞類型的細胞)制備器官或組織移植物的方法。該方法包括選擇器官或組織的灌注脫細胞化的基質(zhì)，例如從非人類的哺乳動物中，以及選擇細胞群，例如異種的或同種異體的細胞，包括能夠分化為天然器官或組織中存在的細胞類型的祖細胞。在一定條件下，將選擇的灌注脫細胞化的基質(zhì)與可包含祖細胞的細胞群相接觸一段時間，以提供灌注脫細胞化的基質(zhì)的再細胞化并使細胞群中的細胞分化為功能性細胞。
[0023]在一個實施方案中，本發(fā)明提供制備包含胰島細胞的遞送系統(tǒng)的方法，所述遞送系統(tǒng)具有肝臟、肝葉或其一部分的灌注脫細胞化的基質(zhì)以及胰島細胞、β細胞或胰島樣細胞或者分化為胰島細胞、β細胞或胰島樣細胞的細胞。在一定條件下，使灌注脫細胞化的基質(zhì)與內(nèi)皮細胞群和包含胰島細胞、β細胞、胰島樣細胞、祖細胞和/或干細胞的細胞群相接觸一段時間，以提供基質(zhì)中的胰島細胞的再內(nèi)皮化并發(fā)揮功能。在一個實施方案中，干細胞為誘導多能干(iPS)細胞。在一個實施方案中，干細胞為胚胎干(ES)細胞，例如人ES細胞。在一個實施方案中，干細胞為成體干細胞。
[0024]在一個實施方案中，在本發(fā)明的方法中使用一部分肝臟或肝葉ECM。在一個實施方案中，所述部分的厚度為約5至約10_。在一個實施方案中，所述部分的厚度為約70至約10mm0
[0025]在一個實施方案中，將干細胞或祖細胞接種在灌注脫細胞化的肝臟ECM支架上，并在一定條件下培養(yǎng)一段時間以導致再內(nèi)皮化。在一個實施方案中，在一定條件下，將內(nèi)皮細胞接種在灌注脫細胞化的肝臟ECM支架上一段時間以導致再內(nèi)皮化。在另一實施方案中，將來源于ES或iPS細胞的部分分化的胰腺細胞接種在灌注脫細胞化的肝臟ECM支架上，并在一定條件下培養(yǎng)一段時間以產(chǎn)生全功能性α細胞、PP細胞、δ細胞、ε細胞和/或β細胞，例如，其中α細胞產(chǎn)生胰高血糖素，β細胞產(chǎn)生胰島素和胰淀素，δ細胞產(chǎn)生