此夕卜，可將多種類型的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞(例如內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞的混合物)引入器官或組織基質(zhì)的脈管系統(tǒng)。
[0109]可以以已知或估計的密度或者以較低密度接種內(nèi)皮細(xì)胞，并且允許體外或體內(nèi)增殖以達(dá)到匯合水平。關(guān)于那些細(xì)胞將達(dá)到的群密度，不同類型的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞可能具有不同的趨勢，以及類似地，不同的器官或組織基質(zhì)可以以不同的密度再內(nèi)皮化。僅通過舉例，可以向器官或組織基質(zhì)引入至少約100 (例如，至少約13、104、105、16、107、19或101°)個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞或干細(xì)胞。
[0110]可以將其它細(xì)胞類型與內(nèi)皮細(xì)胞或胰島細(xì)胞一起引入細(xì)胞外基質(zhì)，例如，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可能有助于穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞的基質(zhì)或者接種患者的胰島細(xì)胞的致敏作用，從而避免未受保護(hù)的胰島細(xì)胞或β細(xì)胞的免疫排斥。
[0111]為了確定再內(nèi)皮化的移植物是否獲得了足夠的內(nèi)皮細(xì)胞群，可通過在一定時間之后監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)基中的氨基酸、關(guān)鍵水溶性維生素、葡萄糖/乳糖以及微量元素的消耗或積累來測量內(nèi)皮細(xì)胞的密度。
[0112]可將胰島細(xì)胞和/或β細(xì)胞或者干細(xì)胞或祖細(xì)胞注射和/或灌注至完全再內(nèi)皮化的肝臟移植物。向脫細(xì)胞化的基質(zhì)中引入胰島細(xì)胞或β細(xì)胞之后的再內(nèi)皮化可通過將內(nèi)皮細(xì)胞灌注或注射至基質(zhì)(例如脈管系統(tǒng)基質(zhì))來完成，然后培養(yǎng)確定的時間，其中可監(jiān)測增殖速度、生長速度或內(nèi)皮細(xì)胞的密度，從而確定植移植物何時準(zhǔn)備好移植。
[0113]為了向再內(nèi)皮化的移植物引入胰島細(xì)胞或β細(xì)胞，將細(xì)胞注射或灌注至肝臟移植物，同時在以向注射的細(xì)胞提供足夠濃度的營養(yǎng)素的壓力下連續(xù)灌注。對于向哺乳動物體內(nèi)引入胰島細(xì)胞或β細(xì)胞，哺乳動物可接受至少10，000個胰島細(xì)胞“等同物”/千克體重。
[0114]為了確定移植有上文所述的細(xì)胞或如上文所述離體產(chǎn)生的移植物的哺乳動物中接種的胰島細(xì)胞或β細(xì)胞的功能，對應(yīng)答葡萄糖負(fù)荷產(chǎn)生的全部胰島素進(jìn)行測量。此外，可以測量產(chǎn)生的C-肽和尿素作為移植物內(nèi)的胰島細(xì)胞或β細(xì)胞的函數(shù)。
[0115]可將移植物移植至身體的任何位置，例如，對于肝臟移植物，具有肝靜脈或門靜脈被吻合到動脈供應(yīng)且產(chǎn)生的肝靜脈或門靜脈被吻合到靜脈?？蛇x地，肝動脈可以被吻合到動脈供應(yīng)，而肝靜脈和門靜脈被吻合到靜脈。在一個實施方案中，將移植物吻合到肝臟。
[0116]在一個實施方案中，在向基質(zhì)離體注射或灌注胰島細(xì)胞、β細(xì)胞或胰島樣細(xì)胞之前約I至2周，將灌注脫細(xì)胞化的肝臟、肝葉或其一部分離體再內(nèi)皮化，例如經(jīng)由注射或灌注，持續(xù)約I至6周，并且將獲得的移植物植入宿主哺乳動物。其它細(xì)胞，例如間充質(zhì)干細(xì)胞，可包含于用于將脫細(xì)胞化的肝臟、肝葉或其一部分再內(nèi)皮化的細(xì)胞中，或者包含于胰島細(xì)胞、β細(xì)胞或胰島樣細(xì)胞中，或者向移植的宿主提供免疫致敏性。在一個實施方案中，在移植以及在體內(nèi)將胰島細(xì)胞、β細(xì)胞或胰島樣細(xì)胞注射至移植的再內(nèi)皮化的移植物之前，離體將灌注脫細(xì)胞化的肝臟、肝葉或其一部分再內(nèi)皮化。在一個實施方案中，將灌注脫細(xì)胞化的肝臟、肝葉或其一部分植入宿主，然后將移植物再內(nèi)皮化，在約I至6周之后，向再血管化的移植物注射或灌注胰島細(xì)胞、β細(xì)胞或胰島樣細(xì)胞。例如離體或在體內(nèi)，在將胰島細(xì)胞、β細(xì)胞或胰島素樣細(xì)胞引入移植物之后約I至2周，測試移植物的胰島素產(chǎn)生。
[0117]在一個實施方案中，在離體注射或灌注內(nèi)皮細(xì)胞之前，例如經(jīng)由注射或灌注，向灌注脫細(xì)胞化的肝臟、肝葉或其一部分離體引入胰島細(xì)胞、β細(xì)胞或胰島樣細(xì)胞，并且將獲得的再細(xì)胞化且再內(nèi)皮化的移植物植入宿主哺乳動物。在一個實施方案中，在移植以及隨后在體內(nèi)向移植物注射或灌注內(nèi)皮細(xì)胞之前，例如，經(jīng)由注射或灌注，將胰島細(xì)胞、β細(xì)胞或胰島樣細(xì)胞離體引入灌注脫細(xì)胞化的肝臟、肝葉或其一部分。在一個實施方案中，將灌注脫細(xì)胞化的肝臟、肝葉或其一部分植入宿主，例如經(jīng)由注射或灌注，然后向移植物植入胰島細(xì)胞、β細(xì)胞或胰島樣細(xì)胞，接著植入內(nèi)皮細(xì)胞。
[0118]在將胰島細(xì)胞、β細(xì)胞、胰島素樣細(xì)胞或者能夠分化為那些細(xì)胞的細(xì)胞引進(jìn)基質(zhì)之后，可以例如離體或在體內(nèi)測試移植物的胰島素、胰淀素、胰高血糖素、生長抑素、胰多肽和/或饑餓激素的產(chǎn)生。
[0119]在一個實施方案中，可利用脫細(xì)胞化的脈管系統(tǒng)細(xì)胞外基質(zhì)來接種細(xì)胞。例如，可使用肝動脈或靜脈或者二者向灌注脫細(xì)胞化的肝臟引入細(xì)胞。
[0120]獲得的產(chǎn)生再內(nèi)皮化的胰島素的移植物可能允許具有胰島素缺乏的哺乳動物中血液葡萄糖的控制，例如，作為自身免疫病的結(jié)果，如其中胰島素相對不足的I型糖尿病或
II型糖尿病。
[0121]將所有出版物、專利和專利申請以引用的方式并入本文。雖然在前述說明書中，本發(fā)明所述涉及其某些優(yōu)選實施方案，并且為了闡明的目的闡述了許多細(xì)節(jié)，但是本發(fā)明易受另外的實施方案的影響，且在不脫離本發(fā)明的基本原則的情況下，本文的某些細(xì)節(jié)可能會發(fā)生大的改變，這對本領(lǐng)域那些技術(shù)人員是顯而易見的。
【主權(quán)項】
1.制備包含哺乳動物肝臟、肝葉或其一部分的再細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)的移植物的方法，其包括: 選擇哺乳動物肝臟、肝葉或其一部分的灌注脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)，以及包含第一哺乳動物細(xì)胞群和第二哺乳動物細(xì)胞群的兩種細(xì)胞群，所述第一哺乳動物細(xì)胞群包含內(nèi)皮細(xì)胞或能夠分化為內(nèi)皮細(xì)胞的干細(xì)胞或祖細(xì)胞，所述第二哺乳動物細(xì)胞群包含胰島細(xì)胞、β細(xì)胞、胰島素樣細(xì)胞或者能夠分化為胰島細(xì)胞或β細(xì)胞的干細(xì)胞或祖細(xì)胞；以及 在一定條件下，使所述灌注脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)與所述兩種細(xì)胞群相接觸一段時間，所述條件和接觸時間能提供所述灌注脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)的脈管系統(tǒng)的再內(nèi)皮化，以及用胰島細(xì)胞、β細(xì)胞或胰島素樣細(xì)胞使所述灌注脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)再細(xì)胞化，或者在所述灌注脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)中使干細(xì)胞或祖細(xì)胞再細(xì)胞化并分化和功能成熟為胰島細(xì)胞、β細(xì)胞或胰島素樣細(xì)胞。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述選擇的灌注脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)是肝臟的灌注脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述選擇的灌注脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)是肝葉的灌注脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述選擇的灌注脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)是肝葉的灌注脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)的>8cm3的部分。5.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述第一群和第二群中的細(xì)胞與所述脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)是異種的。6.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述第一群和第二群中的細(xì)胞與所述脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)是同種異體的。7.如權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述第一群、第二群或者二者中的細(xì)胞包含iPS細(xì)胞。8.如權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述灌注脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)包含完整的血管網(wǎng)絡(luò)。9.如權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述條件包括用介質(zhì)灌注所述基質(zhì)。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述介質(zhì)含有選擇用于提供細(xì)胞特定分化的分化通路的激活劑或抑制劑，包括激活素A、視黃酸、bFGF、氯氮平-N-氧化物、磷酸肌醇-3-激酶抑制劑、煙酰胺或它們的組合。11.如權(quán)利要求1至10中任一項所述的方法，其中通過注射或灌注或者它們的組合，使所述第一細(xì)胞群與所述細(xì)胞外基質(zhì)相接觸。12.如權(quán)利要求1至10中任一項所述的方法，其中通過注射或灌注或者它們的組合，使所述第二細(xì)胞群與所述細(xì)胞外基質(zhì)相接觸。13.如權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其中所述第一群、第二群或者二者包含原代細(xì)胞。14.如權(quán)利要求1至13中任一項所述的方法，其中所述第二群包含多種不同的細(xì)胞類型。15.如權(quán)利要求1至14中任一項所述的方法，其中所述第一群、第二群或者二者包含人胚胎干細(xì)胞。16.如權(quán)利要求1至14中任一項所述的方法，其中所述胰島素產(chǎn)生細(xì)胞被包封。17.如權(quán)利要求1至5或7至16中任一項所述的方法，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)來自非人的哺乳動物，并且與人細(xì)胞定殖。18.如權(quán)利要求1至17中任一項所述的方法，其還包括在哺乳動物中植入所述細(xì)胞外基質(zhì)。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中在使所述細(xì)胞外基質(zhì)與所述第一群、所述第二群或者二者相接觸之前，在哺乳動物中植入所述細(xì)胞外基質(zhì)。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中將所述第一群、第二群或者二者中的細(xì)胞注射入所述哺乳動物。21.如權(quán)利要求18所述的方法，其中在使所述細(xì)胞外基質(zhì)與所述第一群相接觸之后且與所述第二群相接觸之前，在哺乳動物中植入所述細(xì)胞外基質(zhì)。22.如權(quán)利要求17所述的方法，其中在使所述細(xì)胞外基質(zhì)與所述第二群相接觸之后且與所述第一群相接觸之前，在哺乳動物中植入所述細(xì)胞外基質(zhì)。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中在使所述細(xì)胞外基質(zhì)與所述第一群和所述第二群相接觸之后，在哺乳動物中植入所述細(xì)胞外基質(zhì)。24.通過權(quán)利要求1至23中任一項所述的方法制備的再細(xì)胞化的基質(zhì)。25.在胰島素控制缺乏或降低的哺乳動物中增強(qiáng)胰島素控制的方法，其包括: 提供具有哺乳動物細(xì)胞群的哺乳動物肝臟、肝葉或其一部分的再內(nèi)皮化的細(xì)胞外基質(zhì)，其中所述哺乳動物細(xì)胞群包含胰島細(xì)胞、β細(xì)胞、胰島樣細(xì)胞或者能夠分化為胰島細(xì)胞或β細(xì)胞的干細(xì)胞或祖細(xì)胞，所述細(xì)胞外基質(zhì)通過向所述哺乳動物肝臟、肝葉或其一部分的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)中引入哺乳動物內(nèi)皮細(xì)胞或者能夠分化為哺乳動物內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞以及所述群制備；以及 向胰島素控制缺乏或降低的哺乳動物中引入具有所述細(xì)胞群的再內(nèi)皮化的基質(zhì)，所述細(xì)胞群包含胰島細(xì)胞、β細(xì)胞、胰島樣細(xì)胞或者能夠分化為胰島細(xì)胞或β細(xì)胞的干細(xì)胞或祖細(xì)胞，從而在哺乳動物中提供血液葡萄糖控制。26.在胰島素控制缺乏或降低的哺乳動物中增強(qiáng)胰島素控制的方法，其包括: 提供哺乳動物肝臟、肝葉或其一部分的再內(nèi)皮化的細(xì)胞外基質(zhì)，其通過向哺乳動物肝臟、肝葉或其一部分的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)引入哺乳動物內(nèi)皮細(xì)胞或者能夠分化為哺乳動物內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞制備； 向胰島素控制缺乏或降低的哺乳動物弓I入所述再內(nèi)皮化的基質(zhì)；以及以在所述哺乳動物中提供血液葡萄糖控制的有效量，向所述具有再內(nèi)皮化的基質(zhì)的哺乳動物中引入包含胰島細(xì)胞、β細(xì)胞、胰島樣細(xì)胞或者能夠分化為胰島細(xì)胞或β細(xì)胞的干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群。27.在胰島素控制缺乏或降低的哺乳動物中增強(qiáng)胰島素控制的方法，其包括: 提供胰島素控制缺乏或降低的且具有植入的哺乳動物肝臟、肝葉或其一部分的再內(nèi)皮化的基質(zhì)的哺乳動物，所述再內(nèi)皮化的基質(zhì)通過向哺乳動物肝臟、肝葉或其一部分的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)中引入哺乳動物內(nèi)皮細(xì)胞制備；以及 以在所述哺乳動物中提供血液葡萄糖控制的有效量，向所述哺乳動物中引入包含胰島細(xì)胞、β細(xì)胞、胰島樣細(xì)胞或者能夠分化為胰島細(xì)胞的干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群。28.如權(quán)利要求25、26或27所述的方法，其中所述細(xì)胞以靜脈內(nèi)方式引入所述哺乳動 物。
【專利摘要】本發(fā)明提供制備基于灌注的包含胰島細(xì)胞的肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(胰島細(xì)胞再細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì))的方法，以及使用所述再細(xì)胞化的基質(zhì)的方法。
【IPC分類】C12N5/071
【公開號】CN105164250
【申請?zhí)枴緾N201480024592
【發(fā)明人】杰弗里·羅斯
【申請人】米羅馬特里克斯醫(yī)療公司
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2014年3月13日
【公告號】CA2907161A1, WO2014151739A1