8-20-2的雙[巧)-7-[4-(4-氣苯基）-6-異丙基-2-[甲基（甲橫酷基）氨基]喀 晚-5-基](3R，5S) -3, 5-二徑基庚-6-締酸]巧。
[0017] 本發(fā)明的抑制素可W選擇使用上述物質(zhì)中的1種或多種。其中，優(yōu)選為洛伐他汀、 氣伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀W及普伐他汀，更優(yōu)選為洛伐他汀、氣伐他汀、辛伐他汀W 及阿托伐他汀。本發(fā)明的HCV顆粒形成促進劑中所含的活性組分，可W是上述抑制素或其 藥學(xué)上可接受的鹽，也可W是它們的水合物。抑制素、其藥學(xué)上可接受的鹽W及它們的水合 物可W通過合成進行制造，也可W利用微生物產(chǎn)生。
[0018] 本發(fā)明的HCV顆粒形成促進劑，可W是作為活性組分而含有通過合成制造的抑制 素、其藥學(xué)上可接受的鹽W及/或者它們的水合物的組合物，也可W是能夠產(chǎn)生抑制素、其 藥學(xué)上可接受的鹽W及/或者它們的水合物的微生物的培養(yǎng)提取物。上述微生物的培養(yǎng)提 取物也可W直接用作本發(fā)明的HCV顆粒形成促進劑。無論在哪一種情況下，本發(fā)明的HCV 顆粒形成促進劑中所含的活性組分均為抑制素、其藥學(xué)上可接受的鹽W及/或者它們的水 合物。通過將可產(chǎn)生抑制素、其藥學(xué)上可接受的鹽W及/或者它們的水合物的微生物的培 養(yǎng)提取物直接用作本發(fā)明的HCV顆粒形成促進劑，與合成抑制素、其藥學(xué)上可接受的鹽W 及/或者它們的水合物并進行純化的情況相比，能夠更加容易地制造HCV顆粒形成促進劑， 也可W降低費用。
[0019] 作為活性組分的抑制素、其藥學(xué)上可接受的鹽W及它們的水合物，可W通過合成 進行制造，也可W從能夠生物合成的微生物的培養(yǎng)提取物中獲得。關(guān)于抑制素、其藥學(xué)上 可接受的鹽W及它們的水合物的合成方法無特別限定，可W使用目前已知的方法或今后開 發(fā)的所有合成方法。能夠產(chǎn)生抑制素、其藥學(xué)上可接受的鹽W及/或者它們的水合物的微 生物無特別限定，例如，洛伐他汀的情況下可舉出曲霉屬絲狀真菌，尤其適合使用±曲霉 (Aspergillusterreus)(參照圖 1)。
[0020] 在本發(fā)明中，藥學(xué)上可接受的鹽無特別限制，可W舉出本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的 任意的鹽、例如鋼鹽、鐘鹽、巧鹽等。除了作為活性組分而含有上述抑制素、其藥學(xué)上可接受 的鹽W及/或者它們的水合物之外，本發(fā)明的HCV顆粒形成促進劑還可W含有其他化合物。
[0021] 本發(fā)明的HCV顆粒形成促進劑的劑型無特別限定，只要能夠?qū)⒆鳛榛钚越M分的抑 制素、其藥學(xué)上可接受的鹽W及/或者它們的水合物與HCV感染細胞一同進行培養(yǎng)即可。 考慮到上述方面，除了本發(fā)明的活性組分W外，本發(fā)明的HCV顆粒形成促進劑還可W適當(dāng) 地含有本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、粘合劑、潤滑劑W及著色劑 等。本發(fā)明的HCV顆粒形成促進劑可W利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的任意的制劑調(diào)制方法 容易地進行調(diào)制。 例如，作為適合的載體的例子，可W舉出：乳糖、淀粉、薦糖、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂 酸儀、甘露醇、山梨糖醇W及交聯(lián)簇甲基纖維素鋼（croscarmellosesodium)等?；蛘撸?為適合的粘合劑，可W舉出：淀粉、明膠、或者葡萄糖、無水乳糖、自由流動乳糖、P-乳糖W 及玉米甜味劑等的天然糖；阿拉伯膠、瓜爾膠（guargum)、黃著膠（tragacanth)或海藻酸 鋼等的天然橡膠和合成橡膠；簇甲基纖維素；聚乙二醇；W及蠟等。另外，上述劑型中可使 用的潤滑劑包括油酸鋼、硬脂酸鋼、硬脂酸儀、苯甲酸鋼W及氯化鋼等。
[0022] 本發(fā)明還設(shè)及一種HCV顆粒產(chǎn)生增強方法，其通過將HCV感染細胞與上述HCV顆 粒形成促進劑一同進行培養(yǎng)，從而增強HCV顆粒的產(chǎn)生。可用于產(chǎn)生本發(fā)明的HCV顆粒的細 胞，只要是HCV允許細胞（permissivecell)即可。在此，所謂的HCV允許細胞是指能夠復(fù) 制HCV基因組RNA和/或能夠感染HCV的細胞。HCV允許細胞是源自肝細胞或淋己細胞的 細胞，但并不限于此。肝細胞具體可W舉出：原代肝細胞、化h7細胞、RCYM1RC細胞、5-15RC 細胞、胎pG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞或者293細胞等，淋己細胞可W舉出Molt4細胞、 HPB-Ma細胞或者Daudi細胞等，但并不限于此。 作為優(yōu)選的HCV允許細胞，可W舉出出化7細胞、RCYM1RC細胞、5-15RC細胞、胎pG2細 胞W及從運些細胞派生出的確立細胞株（est油Iished cell line)等。尤其優(yōu)選為從化h7 細胞派生出的細胞，運樣的細胞可W舉出例如化h7. 5細胞、化h7. 5. 1細胞或者化h7-it細 胞等。尤其適宜地使用能夠進行繼代培養(yǎng)的細胞。進而優(yōu)選為真核細胞，更加優(yōu)選為人體 細胞。運些細胞可W使用市售的細胞，也可W從細胞保藏機構(gòu)獲得后使用。也可W使用將 任意的細胞（例如癌細胞或干細胞）株化后的細胞。 作為從化h7細胞派生出的細胞株，可W舉出出uh7. 5細胞度Ii曲t KJ et al.，J. Virol.，76 :13001-13014, 2002)、Huh7. 5. 1細胞狂hong J et al.，Proc.化tl. Acad. Sci. USA, 102 :9294-9299, 2005) W及Huh7-it細胞燈U L et al.，J. Virol. Methods, 169: 380-384,2010)等。
[0023] 通過將本發(fā)明的HCV顆粒形成促進劑添加至選自上述細胞中的已感染HCV的HCV 允許細胞中，能夠促進HCV顆粒的形成，增強HCV顆粒的產(chǎn)生。具體而言，在將HCV接種至 選自上述細胞中的任意一種培養(yǎng)后的HCV允許細胞上，并使HCV吸附在細胞內(nèi)之后，在培養(yǎng) 液中加入濃度為10yg/ml~200Jig/ml、優(yōu)選為20Jig/ml~50Jig/ml的上述肥V顆粒形 成促進劑，并且培養(yǎng)24小時~72小時、優(yōu)選為36小時~72小時、更優(yōu)選為約48小時，從 而能夠促進HCV顆粒的形成，增強HCV顆粒的產(chǎn)生。
[0024] HCV感染細胞的HCV顆粒產(chǎn)生能力，可W使用周知的任意的病毒檢測法進行確認。 例如，可W根據(jù)薦糖密度梯度對HCV允許細胞的培養(yǎng)上清液進行分級，從而檢測出病毒顆 粒。已感染了HCV且復(fù)制有HCV基因組RNA的細胞可表達HCV蛋白質(zhì)。因此，只要可W培養(yǎng) HCV感染細胞，并檢測出HCV蛋白質(zhì)，便能夠推斷出該細胞中復(fù)制有HCV基因組RNA。進而， HCV蛋白質(zhì)的檢測可W按照周知的任意的蛋白質(zhì)檢測方法進行。具體而言，能夠根據(jù)Kaito M et al.，J. Gen. Virol.，75 :1755-1760,1994的方法進行檢測。 病毒顆粒產(chǎn)生能力可W通過確認培養(yǎng)上清液中的感染性病毒顆粒的數(shù)量而進行確認。 通過將含有感染性病毒顆粒的培養(yǎng)上清液接種至未受感染細胞中，在18小時~48小時后、 優(yōu)選在約24小時后固定細胞，并使用相對于HCV蛋白質(zhì)的特異抗體進行免疫染色，測量出 染色陽性細胞的數(shù)量，從而能夠確認培養(yǎng)上清液中的感染性病毒顆粒的數(shù)量。更為具體而 言，能夠通過下述方式進行確認，即：利用化ISA巧nzyme-linkedImmunosorbentAssay、酶 聯(lián)免疫吸收分析）法，使含有感染性病毒顆粒的培養(yǎng)上清液與抗HCV核屯、蛋白抗體進行反 應(yīng)，并且進行檢測。
[00巧]被復(fù)制到HCV感染細胞中的HCVRNA的分析，可W利用常用的分子生物學(xué)方法進 行分析。從細胞中提取RNA的方法可W利用目前已知的方法。具體而言，可W利用RNA印 跡（No;rthe;rnblot)法、核糖核酸酶保護測定Cribonucleaseprotectionassay)法或者 RT-PCR(實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）法等對于被復(fù)制的RNA的數(shù)量或序列進行分析。在進行RNA 的定量的情況下，可W使用RNA印跡法或定量RT-PCR法，在對RNA的序列進行分析的情況 下，可W使用序列分析法（sequenceanalysismethod)。
[0026] 利用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的HCV顆粒，具有感染HCV允許細胞的能力。在此，所謂的 HCV允許細胞是指能夠復(fù)制HCV基因組RNA和/或感染HCV的細胞。HCV允許細胞是源自 肝細胞或淋己細胞的細胞，但并不限于此。肝細胞具體可W舉出：原代肝細胞、Huh7細胞、 RCYM1RC細胞、5-15RC細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞或者293細胞等，淋己細胞 可W舉出Molt4細胞、HPB-Ma細胞或者Daudi細胞等，但并不限于此。作為優(yōu)選的HCV允許 細胞，可W舉出出化7細胞、RCYM1RC細胞、5-15RC細胞、胎pG2細胞W及從運些細胞派生出 的確立細胞株等。尤其優(yōu)選為從化h7細胞派生出的細胞，運樣的細胞可W舉出例如化h7.5 細胞、化h7.5. 1細胞或者化h7-it細胞等。
[0027] 從含有感染性病毒顆粒的培養(yǎng)上清液等含有如上所述獲得的HCV顆粒的病毒液 中純化HCV顆粒的方法無特別限定，可W使用目前已知的方法或今后開發(fā)的方法。例如，可 W通過離屯、和/或過濾器等除去細胞和細胞殘渣，并按照任意順序?qū)⒊瑸V濃縮、色譜法W 及密度梯度離屯、加W組合而進行純化、或者單獨利用運些方法進行純化。
[0028] 進而，本發(fā)明還設(shè)及將利用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的HCV顆粒作為抗原的HCV疫苗的 制造方法。進而還設(shè)及通過該方法制造的HCV疫苗。
[0029] 在本發(fā)明的HCV疫苗的制造中，優(yōu)選使用感染性失活的HCV顆粒。感染性的失活 方法只要是臨床上可使用的方法便無特別限定，可W采用目前已知的方法和今后開發(fā)的方 法。例如，可W在通過本發(fā)明制造的HCV顆粒懸浮液中添加混合例如福爾馬林、0-丙內(nèi) 醋、戊二醒等的失活劑，使其與HCV顆粒進行反應(yīng)，從而使HCV顆粒的感染性失活（A卵ai址g ariMBetal. ,Vaccine, 22:3669-3675,2004)。另外，也可W利用紫外線照射HCV顆粒，從 而使其失去感染性