與慢性乙型肝炎病毒感染相關(guān)的IL-6基因rs2066992位點(diǎn)標(biāo)志物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及慢性乙型肝炎病毒化epatitis B virus,皿V)感染者病程進(jìn)展的個體 易感性。具體地，本發(fā)明設(shè)及與皿V慢性感染者病程進(jìn)展相關(guān)的易感基因 IL-6的rs2066992 位點(diǎn)標(biāo)志物在皿V慢性感染者病情轉(zhuǎn)歸的預(yù)警W及遺傳咨詢中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 2015年W冊更新的數(shù)據(jù)顯示，全球慢性乙型肝炎病毒化BV)感染者約2億4000萬人。 全世界更有每年超過78萬的人死于乙型肝炎的各種并發(fā)癥，包括肝硬化和肝癌。我國是病 毒性肝炎高發(fā)區(qū)，現(xiàn)有的慢性皿V感染者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎(C皿)患者約2000 萬人。一般慢性乙型肝炎是漸進(jìn)發(fā)展引起并發(fā)癥，但是部分病人并沒有經(jīng)歷明顯的慢性乙 型肝炎的過程就突然出現(xiàn)肝硬化的癥狀和體征，有些患者甚至到了失代償階段才被發(fā)現(xiàn)。 于是，對慢性乙型肝炎肝硬化科學(xué)地預(yù)警預(yù)測和早期診斷早期干預(yù)對于控制病情發(fā)展和降 低病死率至關(guān)重要。
[0003] IL-6是由184個氨基酸組成的經(jīng)典的細(xì)胞因子，它的基因位于7號染色體上?；?6 有2個受體：化-6受體（化-6R)和即130。化-6R有巧巾形式，膜型化-6R和可溶性化-6R(sIk 6R)。比-6通過膜型比-6R介導(dǎo)的是經(jīng)典的信號通路，通過S比-6R介導(dǎo)的是反式信號通路。對 于健康人來說，血漿水平的化-6幾乎測不至Ij。但是，在慢性炎癥性疾病中，比如慢性乙型肝 炎，可W檢測到異常分泌的血漿化-6水平。有研究顯示，化-6水平在慢性乙型肝炎(CHB)病 人中比在健康人中顯著升高，并且相比C皿病人，比-6水平在晚期肝病(肝硬化或者肝癌)病 人中表達(dá)的更顯著。而該基因的多態(tài)性可能改變其表達(dá)或者結(jié)合活性，從而影響肝損傷和 疾病嚴(yán)重程度。因此，比-6基因多態(tài)性分析對于C皿患者病情轉(zhuǎn)歸的判斷和預(yù)警具有重要價 值，特別是對于慢性乙型肝炎進(jìn)展為肝硬化的預(yù)警更有不可替代的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決W上問題，本發(fā)明提供了一種與慢性乙型肝炎病情轉(zhuǎn)歸，尤其是與乙型 肝炎肝硬化轉(zhuǎn)歸相關(guān)的IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)標(biāo)志物及其檢測試劑和檢測方法。
[0005] 與慢性乙型肝炎病情轉(zhuǎn)歸相關(guān)的IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)標(biāo)志物，化-6基因的 rs2066992位點(diǎn)表現(xiàn)為TT基因型或T等位基因。
[0006] 與乙型肝炎向肝硬化轉(zhuǎn)移相關(guān)的IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)標(biāo)志物，化-6基因的 rs2066992位點(diǎn)表現(xiàn)為TT基因型或T等位基因。
[0007] 與乙型肝炎肝硬化相關(guān)的IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)標(biāo)志物，比-6基因的rs2066992 位點(diǎn)表現(xiàn)為TT基因型或T等位基因。
[000引一種試劑，用于檢測IL-6基因的rs2066992位點(diǎn)標(biāo)志物的試劑。
[0009] 另外，本發(fā)明還提供了一種檢測IL-6基因 SNP位點(diǎn)rs2066992標(biāo)志物的化qman探針 法，包括如下步驟：
[0010] 1)于ABI公司購買用于檢測IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)的引物和化qman探針，并對樣 本基因組DNA在Roche LC480 Π PCR儀上進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，所述化qman探針被兩種巧光 染料Vic、Fam雙標(biāo)記，該探針分別是針對雙等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探針才 能擴(kuò)增出各自對應(yīng)的基因型；
[OCm] 2)按下列條件進(jìn)行反應(yīng):起始95°C預(yù)熱lOmin，然后95°C變性10s，60°C退火和延伸 30s，循環(huán)45次;產(chǎn)物在Roche LC480 Π 型巧光定量PCR儀上掃描讀取數(shù)據(jù)，分析得出研究對 象的基因型。
[0012] 用于檢測IL-6基因的rs2066992位點(diǎn)表現(xiàn)為TT基因型或T等位基因的試劑在制備 用于皿V慢性感染者病情轉(zhuǎn)歸的診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0013] 用于檢測IL-6基因的rs2066992位點(diǎn)表現(xiàn)為TT基因型或T等位基因的試劑在制備 用于乙型肝炎感染人群疾病向肝硬化發(fā)展診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0014] 用于檢測IL-6基因的rs2066992位點(diǎn)表現(xiàn)為TT基因型或T等位基因的試劑在制備 用于乙型肝炎肝硬化的診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0015] 發(fā)明人首先對IL-6基因 SNP位點(diǎn)進(jìn)行了篩選。先通過查詢大量相關(guān)文獻(xiàn)或記錄，篩 選出可能和疾病之間存在關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)；然后在第二代化pMap數(shù)據(jù)庫中，WMA於5 %為入 選標(biāo)準(zhǔn)，篩選了 rs2066992位點(diǎn)。因此本發(fā)明鑒定了與慢性乙型肝炎病情轉(zhuǎn)歸相關(guān)的IL-6基 因的SNP位點(diǎn)。
[0016] 本發(fā)明還提供了 一種檢測與慢性乙型肝炎病情轉(zhuǎn)歸相關(guān)的IL-6基因 SNP位點(diǎn) rs2066992 的 Taqman 探針法。
[0017] 如上所述，本發(fā)明采用了一種檢測與慢性乙型肝炎病情轉(zhuǎn)歸相關(guān)的IL-6基因 SNP 位點(diǎn)的方法，該方法為化qman探針法，具體地說，包括了如下步驟：
[001引 1.針對比-6基因 rs2066992位點(diǎn)，于ABI公司購買引物和探針，并對樣本基因組DNA 在Roche LC480 Π PCR儀上進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增。Taqman探針被進(jìn)行過雙標(biāo)記，其分別是針 對雙等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探針才能擴(kuò)增出各自對應(yīng)的基因型；而運(yùn)兩種 探針分別被兩種巧光染料Vic, Fam標(biāo)記。
[0019] 2.按下列條件進(jìn)行反應(yīng):起始95°C預(yù)熱lOmin，然后95°C變性10s，60°C退火和延伸 30s，循環(huán)45次。產(chǎn)物在Roche LC480 Π 型巧光定量PCR儀上掃描讀取數(shù)據(jù)，分析得出研究對 象的基因型。
[0020]另一方面，本發(fā)明還提供了與乙型肝炎肝硬化轉(zhuǎn)歸相關(guān)的IL-6基因的SNP位點(diǎn)，即 IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)及其在慢性皿V感染人群預(yù)警中的應(yīng)用。例如，由于本發(fā)明證實(shí)了 IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)TT基因型和T等位基因與乙肝的病程進(jìn)展存在關(guān)聯(lián)，因此，在皿V慢 性感染人群的預(yù)警中，就需要對所咨詢的對象進(jìn)行IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)基因型、等位基 因分析，W判斷該對象是否攜帶易感TT基因型或T等位基因。在總體人群中，與GG、TG基因型 或G等位基因慢乙肝相比，rs2066992位點(diǎn)TT基因型或T等位基因慢乙肝病程進(jìn)展更為迅速， 最終更易發(fā)生肝硬化。對具有TT基因型或T等位基因慢乙肝患者，則可對之進(jìn)行科學(xué)的干 預(yù)，例如建議其盡早進(jìn)行治療性預(yù)防等措施，運(yùn)樣可針對性地降低運(yùn)些易感人群發(fā)生乙肝 肝硬化的風(fēng)險。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 該實(shí)施例采用了一種檢測與慢性乙型肝炎病情轉(zhuǎn)歸相關(guān)的IL-6基因 SNP位點(diǎn)的方 法。
[0024] 一、基因組DNA的提取
[00巧]采用美國Qiagen公司QIAamp DNA Blood Mini試劑盒，并按說明書方法提取全血 DNA。
[0026] 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：提前一天將血液樣品轉(zhuǎn)移至4°C冰箱，讓血液融化。打開金屬浴并調(diào) 到56°C，準(zhǔn)備好離屯、管，口罩，餐巾紙，廚房用紙，酒精噴壺，廢紙婆，廢液缸等。（參照qiagen 試劑盒）
[0027] 1.向1.5ml離屯、管中加入20ul蛋白酶;如需去除RNA，再向管內(nèi)加入4 ulRNA酶。
[0028] 2.在1.5ml離屯、管中加入200ul樣品；吸取血液時請不要碰觸管壁，W免污染移液 器。
[0029] 3.加入200ul緩沖液AL，充分顛倒混勻，振蕩15s。
[0030] 4.56Γ溫浴化左右。
[0031] 5.加入200ul無水乙醇，充分混勻15s(不可劇烈振蕩），此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀， 簡短離屯、W去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0032] 6.將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱中（吸附柱放入收集管中）， 800化pm離屯、Imin，倒掉廢液，將吸附柱放入新的收集管中。
[0033] 7.向吸附柱中加入500ul緩沖液AW1，800化pm離屯、Imin，倒掉廢液，將吸附柱放入 新的收集管中。
[0034] 8.向吸