專利名稱：形成異源二聚體的雜種蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有兩個(gè)共同表達(dá)的氨基酸序列并形成一個(gè)二聚體的雜種蛋白質(zhì)，該兩種氨基酸序列的每一種含有(a)至少一種選自一種同源聚體受體(homomeric recedtor)，一種異源聚體的鏈，一種配體，及它們的片段的氨基酸序列；以及(b)一種異源二聚體蛋白質(zhì)類激素的亞單位或其片段；其中(a)和(b)是直接結(jié)合的或通過(guò)一種肽連接物結(jié)合的，以及在每一個(gè)雙體中，兩個(gè)亞單位(b)是不同的并能夠聚集形成二聚復(fù)合體。發(fā)明背景蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用對(duì)于細(xì)胞和多細(xì)胞有機(jī)體的正常生理功能來(lái)說(shuō)是必不可少的。自然界中的許多蛋白質(zhì)當(dāng)與一個(gè)或多個(gè)其它蛋白質(zhì)鏈相復(fù)合時(shí)，會(huì)表現(xiàn)出新的或最適的功能。這可通過(guò)各種配體一受體結(jié)合而對(duì)細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)節(jié)來(lái)說(shuō)明。一些配體，如腫瘤壞死因子α(TNFα)，TNFβ，或人類絨毛膜促性腺激素(hCG)，是以多亞基復(fù)合體存在的。一些這種復(fù)合體含有多拷貝的同一種亞基。TNFα和TNFβ(下文統(tǒng)稱為TNF)是由3個(gè)相同的亞單位形成的同源三聚體(1-4)。其它配體是由非同種亞基組成的。如，hCG是一種異源二聚體(5-7)，受體也可以多鏈復(fù)合體的形式存在或發(fā)生功能。如，TNF的受體在聚集形成二聚體時(shí)可傳遞一個(gè)信號(hào)(8,9)。這些受體的配體促進(jìn)兩個(gè)受體鏈的聚集，從而提供一種受體活化的機(jī)制。例如，TNF介導(dǎo)的聚集激活TNF受體(10-12)。
蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的調(diào)節(jié)可以是各種疾病和病理中治療介入的有用機(jī)制?？膳c配體相互作用的可溶性結(jié)合蛋白質(zhì)可能會(huì)將配體與受體分離，從而減弱特定的受體途徑的活化?；蛘?，配體的分離可能推遲它的清除或降解，從而增長(zhǎng)它的效應(yīng)期間，并可能增強(qiáng)它在體內(nèi)的表觀活性。對(duì)于TNF，可溶性TNF受體已主要與TNF活性的抑制相聯(lián)系(13-17)。
可溶性結(jié)合蛋白質(zhì)對(duì)于治療人類疾病來(lái)說(shuō)可能有用。例如，可溶性TNF受體已顯示出在關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型中有效用(18,19)。
由于TNF對(duì)其受體具有3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(10-12)，并且該細(xì)胞表面受體的二聚體化對(duì)于生物活性來(lái)說(shuō)是足夠的(8,9)，很有可能單個(gè)可溶性受體與TNF的結(jié)合將帶來(lái)一種可能性，即可溶性受體TNF(三聚體)的這種1∶3復(fù)合體仍可結(jié)合和活化一對(duì)細(xì)胞表面TNF受體。為獲得一種抑制效應(yīng)，期望TNF三聚體上的受體結(jié)合位點(diǎn)中的兩個(gè)必須由可溶性結(jié)合蛋白質(zhì)占據(jù)或封閉。或者，該結(jié)合蛋白質(zhì)可在細(xì)胞表面上封閉適當(dāng)定向的TNF。
總而言之，人們覺(jué)得需要合成含有兩個(gè)受體(或配體)鏈的作為二聚體雜種蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。參見(jiàn)Wallach等，美國(guó)專利5478925。用于產(chǎn)生含有來(lái)自胞外受體結(jié)合區(qū)域的二聚體或多聚體雜種蛋白質(zhì)的策略為將這些蛋白質(zhì)與抗體重鏈的恒定區(qū)段相融合。
這一策略導(dǎo)致了，例如，CD4免疫粘附素的構(gòu)建(20)。它們是由與抗體的重鏈和輕鏈的恒定區(qū)段融合的CD4的前面兩個(gè)(或全部四個(gè))免疫球蛋白類區(qū)域組成的。這個(gè)創(chuàng)建雜種分子的策略被調(diào)整用于TNF的受體(10,16,21)，并導(dǎo)致了與單體可溶性結(jié)合蛋白質(zhì)相比具有較高體外活性的構(gòu)建體的產(chǎn)生。
人們普通認(rèn)為，二聚體融合蛋白質(zhì)較高的體外活性應(yīng)當(dāng)轉(zhuǎn)化為較高的體內(nèi)活性。一個(gè)研究的結(jié)果支持了這一論點(diǎn)，p75(TBP2)-Ig融合蛋白質(zhì)在保護(hù)小鼠免于產(chǎn)生靜脈內(nèi)LPS注射的不良后果上顯示出至少50倍高的活性。
但是，雖然免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)已得到廣泛應(yīng)用，這一策略具有幾個(gè)缺點(diǎn)。一個(gè)是一些免疫球蛋白Fc區(qū)域參與免疫系統(tǒng)的效應(yīng)物功能。這些功能在特定的治療情形中可能是不期望的(22)。
第二個(gè)限制與期望產(chǎn)生異源聚體融合蛋白質(zhì)，如異源聚體IL-6或Ⅰ型干擾素受體的可溶性類似物的特定情形相關(guān)。雖然有很多方法產(chǎn)生雙功能性抗體(如，通過(guò)共轉(zhuǎn)染或雜交瘤融合)，但通常情況下產(chǎn)生的同源二聚體和異源二聚體的混合物大大損害了合成的有效性(23)。最近已有幾個(gè)報(bào)道描述了使用亮氨酸拉鏈基序引導(dǎo)異源二聚體的組裝(24-26)。這好象是一個(gè)用于研究目的的有前途的方法，但所使用的這種非自身的或胞內(nèi)序列由于其抗原性而不適合于臨床上的長(zhǎng)期使用。組裝的效率和組裝后的穩(wěn)定性也可能是限制因素。
另一方面，在TNF受體的特定情況下，已發(fā)現(xiàn)對(duì)p55 TNF受體的某些修飾有利于同源二聚體化和不存在配體時(shí)的信號(hào)(27,28)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，該受體的胞質(zhì)區(qū)段，被稱作“死亡區(qū)段”，可充當(dāng)同源二聚體的基序(28,30)。作為免疫球蛋白雜種蛋白質(zhì)的替代物，可以想象TNF受體的胞外區(qū)域與其胞質(zhì)死亡區(qū)域的融合可產(chǎn)生一種分泌蛋白質(zhì)，它能在沒(méi)有TNF時(shí)二聚體化。這種融合蛋白質(zhì)已在國(guó)際專利申請(qǐng)WO 95/31544中公開(kāi)并要求專利保護(hù)。
用于產(chǎn)生可溶性TNF受體的二聚體的第三個(gè)策略是將該單體蛋白質(zhì)與聚乙二醇進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)(31)。發(fā)明概述用于獲得這種蛋白質(zhì)的另一種方式為本發(fā)明之一，它具有一些重要的優(yōu)點(diǎn)，該方式在于使用相應(yīng)于循環(huán)系統(tǒng)中具有長(zhǎng)半衰期的非免疫球蛋白的天然異源二聚體支架。一個(gè)優(yōu)選的例子是hCG，它是一種分泌良好，且有高的穩(wěn)定性并具有長(zhǎng)的半衰期的蛋白質(zhì)(32-33)。由于hCG作為懷孕標(biāo)記物的突出的作用，已開(kāi)發(fā)出多種試劑以在體外和體內(nèi)對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行定量和研究。此外，已對(duì)hCG使用誘變方法進(jìn)行了廣泛的研究，并且已知該蛋白質(zhì)的小的缺失，例如去除α亞基最羧基末端的五個(gè)殘基，可有效地消除其生物活性而同時(shí)保留其形成異源二聚體的能力(34,35)。多至30個(gè)氨基酸的小的插入已顯示出在α亞基的氨基和羧基末端具有可容忍性(36)，同時(shí)α亞基與β亞基的羧基末端的融合對(duì)異源二聚體的形成也具有很小的影響(37)。
也已報(bào)道了一種hCG的類似物，其中免疫球蛋白Fc區(qū)域與hCGβ亞基的C-末端融合；但該構(gòu)建體沒(méi)有被分泌，并還沒(méi)有進(jìn)行將其與α亞基相聯(lián)合的實(shí)驗(yàn)(38)。
因而本發(fā)明的主要目的為含有形成一種二聚體的兩種共同表達(dá)的氨基酸序列的雜種蛋白質(zhì)，每一種氨基酸序列含有(a)至少一種選自一種同源聚體受體，一種異源聚體受體的鏈，一種配體，和它們的片段的氨基酸序列；和(b)一種異源二聚體蛋白質(zhì)類激素的亞基或其片段；其中(a)和(b)是直接結(jié)合的或通過(guò)一種肽連接物結(jié)合的，并且在每一個(gè)雙體中，兩個(gè)亞基(b)是不同的并且能夠聚集形成一個(gè)二聚體復(fù)合體。
根據(jù)本發(fā)明，該連接物可被酶切。
序列(a)最好選自TNF受體1(55KDa，也稱作TBP1)的胞外區(qū)域，TNF受體2(75KDa，也稱作TBP2)的胞外區(qū)域，或者仍含有配體結(jié)合區(qū)域的它們的片段；IL-6受體(也稱作gp80和gp130)的胞外區(qū)域；IFNα/β受體或IFNγ受體的胞外區(qū)域；促性腺素受體或其胞外區(qū)域；抗體輕鏈，或其片段，任選地與相應(yīng)的重鏈相聯(lián)；抗體重鏈，或其片段，任選地與相應(yīng)的輕鏈相聯(lián)；抗體Fab區(qū)域；或配體蛋白質(zhì)，如細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子或除促性腺素外的激素，其特定的例子包括IL-6,TFN-β,TPO，或它們的片段。
序列(b)最好選自hCG,FSH,LH,TSH，抑制素亞基，或它們的片段。
可使用對(duì)這些蛋白質(zhì)的修飾，如對(duì)蛋白質(zhì)骨架的化學(xué)或者酶切割，或?qū)σ恍┌被醾?cè)鏈的化學(xué)或酶修飾，使本發(fā)明的雜種蛋白質(zhì)的組分失活。這種對(duì)活性的限制也可通過(guò)使用重組DNA技術(shù)，改變雜種蛋白質(zhì)的編碼序列以直接導(dǎo)致一個(gè)組分的活性受到限制的方式來(lái)完成，或者使該蛋白質(zhì)更易于接受隨后的化學(xué)或酶修飾來(lái)完成。
基于與(b)結(jié)合的氨基酸序列(a)，上述雜種蛋白質(zhì)將產(chǎn)生單功能，雙功能或多功能分子。在每一個(gè)雙體中，(a)可以與(b)的氨基端或羧基端連接，或與兩者都相連。
本發(fā)明的一個(gè)單克隆雜種蛋白質(zhì)可以，例如，含有一種促性腺素受體的胞外區(qū)域，它與相應(yīng)的受體-結(jié)合促性腺素亞基之一相連。根據(jù)這一實(shí)施方案，本發(fā)明的雜種蛋白質(zhì)可以是這樣一種分子，其中，例如，F(xiàn)SH受體胞外區(qū)域與FSH相連，以提高血漿中的半衰期并改善生物活性。
這種制劑在有助繁殖方法中，例如誘導(dǎo)排卵或體外受精，可被用于誘導(dǎo)濾泡成熟，并充當(dāng)劇烈放大對(duì)這一過(guò)程的成功所必需的激素的生物活性的工具，從而降低為達(dá)到排卵所需要的激素本身的量和需要注射的次數(shù)。
FSH受體以及人類FSH受體胞外區(qū)域的生產(chǎn)已被分別描述于WO92/16620和WO96/38575。
按照一個(gè)特定的實(shí)施方案，F(xiàn)SH受體的胞外區(qū)域(ECD)可與含有凝血酶識(shí)別/切割位點(diǎn)的肽連接物同框融合(29)并呈現(xiàn)一種“被栓住的”長(zhǎng)臂。該肽連接物將FSH的胞外區(qū)域與FSH亞基相連，這樣，當(dāng)這種分子在循環(huán)系統(tǒng)中與凝血酶相接觸時(shí)可使FSH受體的胞外區(qū)域通過(guò)在凝血酶切割位點(diǎn)切割而被除去。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用的是大量存在于卵巢中的酶的酶識(shí)別位點(diǎn)，而不是凝血酶識(shí)別位點(diǎn)。這樣，當(dāng)ECD-FSH分子遷移到卵巢中時(shí)，它將暴露于該組織中高濃度存在的酶，ECD將被除去，從而使FSH可與膜結(jié)合受體相互作用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，不是使用酶識(shí)別位點(diǎn)，而是將一種柔性絞鏈區(qū)段克隆到ECD和FSH之間，從而ECD不會(huì)被酶從該激素上除去。這樣，當(dāng)ECD-FSH分子抵達(dá)卵巢后，絞鏈連接的ECD和卵巢細(xì)胞膜上存在的FSH受體的ECD之間將出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)。
在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該雜種蛋白質(zhì)是由一對(duì)氨基酸序列的聚集體組成的，其中之一含有TBP1(或從氨基酸20至氨基酸161或至氨基酸190的一些片段)作為(a)，和hCG的α亞基，作為(b)，其它的總含有TBP1(或與上述相同的片段)作為(a)，和hCG的β亞基或其片段，作為(b)。按照這一實(shí)施方案，基于被選作(b)的特定的序列(hCG的β全亞基，或其片段或修飾物)，所產(chǎn)生的雜種蛋白將具有一種活性(只有TBP1的活性)或幾種活性的組合(TNP1的活性與hCG的活性)。在后一種情況下，該雜種蛋白質(zhì)可被用于，例如，聯(lián)合治療Kaposi氏肉瘤和艾滋病(AIDS)中的代謝損耗。
在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，在兩個(gè)亞基(b)之間加入一個(gè)或多個(gè)共價(jià)鍵，以提高所產(chǎn)生的雜種蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。這可通過(guò)例如加入一個(gè)或多個(gè)非天然的鏈間二硫鍵來(lái)進(jìn)行。這些交聯(lián)的位點(diǎn)可從已知的異源二聚體激素的結(jié)構(gòu)推導(dǎo)出來(lái)。例如，hCG中的一個(gè)適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)為可將半胱氨酸置于α亞基的殘基Lys45和β亞基的殘基Glu21，將一個(gè)鹽橋鍵(非共價(jià)鍵)用一個(gè)二硫鍵(共價(jià)鍵)替換。本發(fā)明的另一個(gè)目的是這些雜種蛋白質(zhì)的PEG化或其它的化學(xué)修飾的形式。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是一種DNA分子，它含有編碼上述雜種蛋白質(zhì)的DNA序列，以及基本上相同的核苷酸序列?！盎旧舷嗤暮塑招蛄小卑ㄆ渌挠捎谶z傳密碼的簡(jiǎn)并性也編碼給定的氨基酸序列的核酸序列。
對(duì)于生產(chǎn)本發(fā)明的雜種蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，DNA序列(a)得自存在的克隆，如(b)那樣。將編碼所需的序列(a)的DNA序列與編碼所需序列(b)的DNA序列相連。將這兩種融合產(chǎn)物插入并連接進(jìn)適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒或?qū)⒚恳环N連接進(jìn)不同的質(zhì)粒，完成后，將表達(dá)載體或兩種表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，然后宿主細(xì)胞對(duì)載體進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生如上定義的本發(fā)明的雜種蛋白質(zhì)。
制備本發(fā)明雜種蛋白的優(yōu)選方法是通過(guò)PCR技術(shù)，使用的寡核苷酸是對(duì)需要從編碼序列(a)和(b)的克隆復(fù)制的期望序列具有特異性的寡核苷酸。
本文所述的本發(fā)明的任一個(gè)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)可使用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體在真核細(xì)胞(如酵母，昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)或原核細(xì)胞中進(jìn)行，可使用現(xiàn)有技術(shù)已知的任何一種方法。
例如，將編碼通過(guò)上述任意一種方法得到的蛋白質(zhì)的DNA分子用現(xiàn)有技術(shù)公知的技術(shù)插入適當(dāng)構(gòu)建的表達(dá)載體中(參見(jiàn)Sambrook等1989)。將雙鏈cDNA與質(zhì)粒載體連接的技術(shù)有同源多聚體加尾，涉及使用合成的DNA連接物的限制性連接和平端連接技術(shù)使用DNA連接酶連接DNA分子，并且通過(guò)用堿性磷酸酶處理來(lái)避免不期望的連接。
為了能夠表達(dá)所需的蛋白質(zhì)，一個(gè)表達(dá)載體應(yīng)該也包括含有轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)信息的特殊的核苷酸序列，并且它與編碼期望蛋白質(zhì)的DNA相連，其連接方式應(yīng)允許基因的表達(dá)和該蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。對(duì)于要轉(zhuǎn)錄的基因來(lái)說(shuō)最為重要的是它必須在其前面有一個(gè)可被RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子，該聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合從而起始轉(zhuǎn)錄過(guò)程。已有多種這種啟動(dòng)子被投入使用，它們以不同的效率起作用(強(qiáng)和弱啟動(dòng)子)。
對(duì)于真核宿主來(lái)說(shuō)，根據(jù)宿主的性質(zhì)可以使用不同的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)序列。它們可以來(lái)自病毒，如腺病毒，小牛乳頭瘤病毒，猿猴病毒等，其中，該調(diào)節(jié)信號(hào)與具有很高的表達(dá)水平的特定基因相聯(lián)。它們的例子有皰疹病毒的TK啟動(dòng)子，SV40早期啟動(dòng)子，酵母ga14基因啟動(dòng)子等。被選用的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)信號(hào)可以是允許抑制和激活的，從而可對(duì)基團(tuán)的表示進(jìn)行調(diào)控。
將含有編碼本發(fā)明的雜種蛋白質(zhì)的核苷酸序列插入載體中，該載體具有可操縱連接的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)信號(hào)，并能夠?qū)⑵谕蛐蛄姓线M(jìn)宿主細(xì)胞。已被導(dǎo)入的DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可通過(guò)也導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物來(lái)選擇，該標(biāo)記物可允許對(duì)含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇。該標(biāo)記物也可以對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主提供光營(yíng)養(yǎng)，殺生物抗性，如抗生素，或重金屬，如銅等?？蛇x擇的標(biāo)記基因可直接與待表達(dá)的DNA基因序列相連，也可通過(guò)共轉(zhuǎn)染導(dǎo)入同一個(gè)細(xì)胞中。對(duì)于本發(fā)明蛋白質(zhì)的最適合成來(lái)說(shuō)也可能需要其它的要素。
在選擇特定的質(zhì)?；虿《据d體中的重要因素包括從那些不含有載體的受體細(xì)胞中識(shí)別和選出含有載體的受體細(xì)胞的難易性；在特定宿主中期望載體的拷貝數(shù)；以及是否需要它能夠在不同種類的宿主細(xì)胞之間“穿梭”。
一旦制備出用于表達(dá)的含有所述構(gòu)建體的載體或DNA序列，該DNA構(gòu)建體可通過(guò)多種適當(dāng)?shù)姆绞街械娜我庖环N被導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，接合，原生質(zhì)體融合，電穿孔，磷酸鈣沉淀，直接微注射等。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。優(yōu)選真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人、猴、小鼠、和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，這是因?yàn)樗鼈儗?duì)蛋白質(zhì)分子提供轉(zhuǎn)譯后修飾，包括正確折疊和在正確的位點(diǎn)糖基化。酵母細(xì)胞也進(jìn)行轉(zhuǎn)譯后肽修飾，包括糖基化。已有一些使用強(qiáng)啟動(dòng)子序列和高拷貝數(shù)質(zhì)粒的重組DNA策略，它可用于在酵母中生產(chǎn)所需的蛋白質(zhì)。酵母識(shí)別克隆的哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)物上的引導(dǎo)序列，并分泌攜帶引導(dǎo)序列的肽(即前肽)。
在載體引入之后，將宿主細(xì)胞培養(yǎng)于選擇培養(yǎng)基中，它對(duì)含有載體的細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行選擇，克隆的基因序列的表達(dá)導(dǎo)致所需蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
重組蛋白質(zhì)的純化是通過(guò)已知用于這一目的的任意一種方法，即涉及提取，沉淀，層折，電泳等的任一種常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行的。一種可優(yōu)選用于純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)一步純化方法為使用與靶蛋白質(zhì)結(jié)合的單克隆抗體的親和層折方法，該單克隆抗體產(chǎn)生和被固定在包含于一個(gè)柱中的凝膠基質(zhì)上。將含有該重組蛋白質(zhì)的不純凈的制劑流經(jīng)該柱。這種蛋白質(zhì)將通過(guò)特定的抗體與柱結(jié)合，而雜質(zhì)將流出去。洗滌之后，通過(guò)改變pH值或離子強(qiáng)度將該蛋白質(zhì)洗脫出來(lái)。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“雜種蛋白質(zhì)”一般表示含有兩種或多種不同的蛋白質(zhì)或其片段的蛋白質(zhì)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“融合蛋白質(zhì)”是指一種雜種蛋白質(zhì)，它是由共價(jià)相連的兩種或多種蛋白或其片段組成的。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“聚集體”是指兩個(gè)多肽鏈之間形成強(qiáng)的特異性非共價(jià)相互作用，從而形成一個(gè)復(fù)合體，例如在異源二聚體激素(如FSH,LH,hCG或TSH)的α和β亞基之間形成的相互作用。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“配體”或“配體蛋白質(zhì)”是指一種除抗體或免疫球蛋白之外的分子，它可被受體的配體結(jié)合區(qū)域結(jié)合；這種分子可以是自然界中存在的，或者可以是化學(xué)修飾的或化學(xué)合成的。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“配體結(jié)合區(qū)域”是指一種參與配體結(jié)合的受體部分，它通常是部分的或基本上全部的胞外區(qū)域。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“受體”是指一種膜蛋白，它與相應(yīng)的配體的結(jié)合引發(fā)二級(jí)細(xì)胞響應(yīng)，導(dǎo)致胞內(nèi)過(guò)程的激活或抑制。
另一方面，本發(fā)明提供了這種雜種蛋白質(zhì)作為藥物的應(yīng)用。這種藥品最好以含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑的藥物組合物的形式提供。這種藥物組合物代表了本發(fā)明的再一個(gè)方面。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明參閱附圖可更好地理解本發(fā)明，其中

圖1(a)和1(b)分別表示了TBP(20-161)-hCGα以及TBP(20-161)-hCGβ構(gòu)建體，以及相應(yīng)的序列(SEQID NO:1-4)。
圖2(a)和2(b)分別表示了TBP(20-190)-hCGα以及TBP(20-190)-hCGβ構(gòu)建體，以及相應(yīng)的序列(SEQID NO:5-8)。
圖3是圖1和圖2的構(gòu)建體的圖解綜述，表示了p55 TNFR1,TBP1和TBP1融合構(gòu)建體。最后兩行表示的連接物序列為SEQ ID NO:9(ALa-GLy-ALa-ALa-Pro-GLy)和SEQ ID NO:10(ALa-GLy-GLa-GLy)。
圖4表明CHO細(xì)胞表達(dá)的TBP-hCG(20-190)對(duì)TNFα-誘導(dǎo)的對(duì)BT-20細(xì)胞的細(xì)胞毒性的保護(hù)效應(yīng)的劑量依賴性，以及各種對(duì)照。
圖5表示COS細(xì)胞表達(dá)的TBP-hCG(20-190)對(duì)TNFα-誘導(dǎo)的對(duì)BT-20細(xì)胞毒性的保護(hù)效應(yīng)的劑量依賴性，以及各種對(duì)照。
圖6表明親和純化的CHO細(xì)胞表達(dá)的TBP-hCG(20-161)對(duì)TNFα-誘導(dǎo)的對(duì)BT-20細(xì)胞毒性的保護(hù)效應(yīng)的劑量依賴性，以及各種對(duì)照。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述。
本發(fā)明將通過(guò)下文的實(shí)施例進(jìn)行描述，不能解釋為以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例材料和方法用于本研究的細(xì)胞系是得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),Rockville,Maryland，除非另有說(shuō)明。CHO-DUKX細(xì)胞系通過(guò)MIT的D,Houseman得自哥倫比亞大學(xué)的Chasin(39)。將缺乏功能性二氫葉酸還原酶基因的CHO-DUKX細(xì)胞常規(guī)地保持在補(bǔ)充了10％小牛血清(FBS)的完全α(+)改良的Eagles培養(yǎng)基(α(+)MEM)中。將COS-7細(xì)胞按照常規(guī)保持在補(bǔ)充有10％FBS的Dulbecco改良的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)中。除非特別說(shuō)明，將細(xì)胞打散使它們保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)試劑得自GIBCO(Grand Island,New York)。
1、編碼雜種蛋白質(zhì)的遺傳構(gòu)建體的組裝對(duì)p55TNF受體的編號(hào)基于Wallach的克隆論文(40)，而對(duì)人hCG亞基的編號(hào)是基于Fichdes克隆論文的編號(hào)(41,42)。TBP，或TNF結(jié)合蛋白質(zhì)這一稱謂表示能夠結(jié)合TNF的TNF受體的腹外區(qū)域部分。在這些實(shí)施例中，該DNA構(gòu)建體將被命名為TBP一雜種蛋白質(zhì)，加上構(gòu)建體命名法中指明的TBP的參與物和區(qū)段。所有的TBP-hCG構(gòu)建體均含有替換天然p55信號(hào)序列的人生長(zhǎng)激素(hGH)信號(hào)肽。此外，hGH信號(hào)肽的定位使其緊接在TBP殘基Asp20的前面，期望在成熟的分泌蛋白質(zhì)中它成為第一個(gè)殘基。這些修飾對(duì)于使用hCG作為該雜種蛋白質(zhì)的參與物這一基本思想來(lái)說(shuō)不是必需的。
編碼該雜種蛋白質(zhì)的DNA是使用PCR方法構(gòu)建的(43)。
a．TBP1(20-161)-hCG起初的TBP-hCG構(gòu)建體被設(shè)計(jì)成含有來(lái)自p55TNF受體的胞外區(qū)域(從Asp20開(kāi)始包括殘基Cys161)的配體結(jié)合區(qū)域，它通過(guò)一個(gè)短的連接物與hCGα和β亞基(分別從殘基αCys7或βPro7開(kāi)始)融合。這一構(gòu)建體，下文稱作TBP1(20-161)-hCG，是一種兩個(gè)被修飾的hCG亞基，TBP1(20-161)-hCGα和TBP1(20-161)-hCGβ，的異源二聚體。
用于TBP1(20-161)-hCGα構(gòu)建體的寡核苷酸引物為引物1(αβ)TTT TCT CGA GAT GGC TAC AGG TAA GCG CCC(SEQ ID NO:11)引物2(α)ACC TGG GGC ACG ACC GGC ACA GGA GAC ACA CTC GTT TTC(SEQ ID NO:12)引物3(α)TGT GCC GGT GCT GCC CCA GGT TGC CCA GAA TGC ACG CTA CAG(SEQ ID NO:13)引物4(α)TTT TGG ATC CTT AAG ATT TGT GAT AAT AAC AAG TAC(SEQ ID NO:14)
這些引物和這些實(shí)施例中描述的其它引物是使用亞磷酰胺化學(xué)方法在Applied Biosysrem Model 392 DNA合成儀上合成的(ABI，F(xiàn)oster市，加里福尼亞)。
由于兩個(gè)TBP-hCG亞基構(gòu)建體具有相同的5’-端(即hCH/TBP構(gòu)建體的5’-端)，兩個(gè)TBP-hCG亞基構(gòu)建體均使用引物1(αβ)。用于TBP1(20-161)-hCGβ構(gòu)建體的其它引物為引物2(β)CCG TGG ACC AGC ACC AGC ACA GGA GAC ACA CTC GTT TTC(SEQ ID NO:15)引物3(β)TGT GCT GGT GCT GGT CCA CGG TGC CGC CCC ATC AAT(SEQ ID NO:16)引物4(β)TTT TGG ATC CTT ATT GTG GGA GGA TCG GGG TG(SEQ ID NO:17)引物2(α)和3(α)為反向互補(bǔ)，并覆蓋p55胞外區(qū)域編碼區(qū)段的3’-端，以及hCGα亞基的5’-端。同樣，引物2(β)和3(β)也為反向互補(bǔ)，并覆蓋p55胞外區(qū)域編碼區(qū)段的3’-端，和hCGβ亞基的5’-端。
對(duì)兩個(gè)TBP-hCG亞基構(gòu)建體的每一個(gè)進(jìn)行兩個(gè)PCR反應(yīng)。第一個(gè)使用了引物1(αβ)和2(α或β)，并使用了作為模板的編碼可溶性p55殘基20-180并在其前面存在hGH信號(hào)肽的質(zhì)粒(pCMVhGHspcDNA.pA4質(zhì)粒)。第二個(gè)使用了引物3(α或β)和4(α或β)，并使用了作為模板的質(zhì)粒pSVL-hCGα或pSVL-hCGβ兩者之一(44)。PCR是使用得自New England Biolabs(Beverly,Massachusetts)的Vent(TM)聚合酶，并按照制造商推薦的方法進(jìn)行的。每一反應(yīng)進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件為模板DNA 100μg每種引物1μgVent(TM)聚合酶(New Englandl Biolabs)2U99℃變性30秒，退火對(duì)于引物1(αβ)和2(α)為59℃30秒；引物3(α)和4(α)為59℃30秒；引物1(αβ)和2(β)為57℃30秒；
引物3(β)和4(β)為63℃30秒；在75℃延伸75秒。
將PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上電泳并用溴化乙錠(ethidiumbromide)染色，證實(shí)了其為期望的大小。然后將這些片段通過(guò)一個(gè)Wizard柱(Promega)并按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行純化。
TBP1(20-161)-hCGα的最后一個(gè)編碼序列是通過(guò)使用引物1(αβ)和引物4(α)的融合PCR進(jìn)行組裝的，并且使用了從第一個(gè)PCR反應(yīng)得到的從p55和hCGα片段純化的產(chǎn)物作為模板。首先將兩個(gè)模板，它們由于引物2(α)和3(α)之間的重疊而變性后退火到一起，在不加入任何引物的情況下進(jìn)行10個(gè)循環(huán)的PCR。這些循環(huán)的條件基本上與先前使用的條件相同，只是退火是在67℃下進(jìn)行的，延伸進(jìn)行了2分鐘。在這10個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)加入引物1(αβ)和4(α)，再進(jìn)行另外10個(gè)循環(huán)。這后一輪反應(yīng)的條件與先前使用的相同，只是所用的退火溫度為59℃，延伸進(jìn)行了75秒。
在1％瓊脂糖凝膠上電泳對(duì)這一反應(yīng)的產(chǎn)物的分析結(jié)果證實(shí)，我們獲得了約1100bp的期望片段。將產(chǎn)物通過(guò)一個(gè)Wizard柱以純化該片段，然后將它用XbaⅠ和BamHⅠ消化，并在0.7％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上重新純化。將純化的片段亞克隆進(jìn)質(zhì)粒pSVL(pharmacia)，該質(zhì)粒已首先用XbaⅠ和BamHⅠ消化并在0.8％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上重新純化。在用T4連接酶連接之后，將混合物用于轉(zhuǎn)化AG1大腸桿菌，然后將其平鋪在LB/氨芐青霉素平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。將得自氨芐毒霉素抗性的菌落的質(zhì)粒DNA通過(guò)用Xho和BamHⅠ消化分析，以證實(shí)插入物(它在這一消化中被切去)的存在。發(fā)現(xiàn)6個(gè)克隆含有插入物，選擇其中的一個(gè)(克隆7)用于進(jìn)步一的研究并命名為pSVLTBPhCGα(含有TBP1(20-161)-hCGα)。對(duì)這一載體中插入物的雙脫氧DNA測(cè)序(使用SeguenaseTM,U.S.Biochemicals.Cleveland,Ohio)的結(jié)果證實(shí)了該構(gòu)建體是正確的，并且沒(méi)有引入非期望的變化。
最終編碼TBP1(20-161)-hCGβ的序列是以對(duì)TBP1(20-161)-hCGα所述相同的方式使用引物1(αβ)和4(β)的融合PCR組裝的，并使用了從得自第一個(gè)PCR反應(yīng)的p55和hCGβ片段純化的產(chǎn)物作為模板。所產(chǎn)生含有期望的插入物的pSVL被命名為pSVLTBPhCGβ。
b．TBP(20-190)-hCG通過(guò)對(duì)TBP(20-161)-hCG構(gòu)建體進(jìn)行修飾制備出第二組TBP-hCG蛋白質(zhì)，以產(chǎn)生含有橫跨Asp20至Thr190的TBP的類似物，以代替原生類似物中的20-161區(qū)段。將通過(guò)將在質(zhì)粒pSVLTBPhCGα中的BglⅡ和XbaⅠ位點(diǎn)之間的片段用含有該變化的PCR片段替換來(lái)進(jìn)行的，這一PCR片段是使用融合PCR產(chǎn)生的。這些引物為引物1 TTT TAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG GAC(SEQ ID NO:18)引物2 TGT GGT GCC TGA GTC CTC AGT(SEQ ID NO:19)引物3 ACT GAG GAC TCA GGC ACC ACA GCC GGT GCT GCC CCA GGT TG(SEQ ID NO:20)引物4 TTT TTC TAG AGA AGC AGC AGC AGC CCA TG(SEQ ID NO:21)引物1和2被用于產(chǎn)生編從161-190的額外的p55殘基的序列。該P(yáng)CR反應(yīng)基本上是如前所述的條件進(jìn)行的，使用1μg的每種引物和pUC-p55作為模板。同樣，引物3和3被用于通過(guò)PCR產(chǎn)生TBP編碼區(qū)段的3’-端和編碼hCGα亞基5’端之間的連接物，使用的是質(zhì)粒pSVLTBPhCGα作為模板。在8％凝膠上的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)證實(shí)了這些PCR反應(yīng)的產(chǎn)物為正確大小(分別為約296bp和121bp)，然后使用Wizard柱將其純化。引物2和3的設(shè)計(jì)是這樣的，它們含有重疊區(qū)段，從而使這兩種PCR產(chǎn)物(得自引物1和2和得自引物3和4)可退火用于使用引物1和4的融合PCR。融合反應(yīng)之后，將給400bp的期望產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠和Wizard柱進(jìn)行證實(shí)和純化。然后將這種DNA用BglⅡ和XbaⅠ進(jìn)行消化，并與BglⅡ/XbaⅠ消化的pSVLTBPhCGα進(jìn)行連接。在從轉(zhuǎn)化的AG1大腸桿菌中分離的質(zhì)粒中插入物的存在通過(guò)用BglⅡ和XbaⅠ的消化得到了證實(shí)。該新的構(gòu)建體被命名為pSVLTBP(20-190)-hCGα。
同樣，將質(zhì)粒pSVLTBPhCGβ通過(guò)BglⅡ和XcmⅠ片段的替換來(lái)修飾，但是，這是通過(guò)單個(gè)PCR產(chǎn)物的亞克隆來(lái)進(jìn)行的，而不是融合PCR產(chǎn)物。使用了引物1和2b(見(jiàn)下文)，以及作為模板的pUC-p55。
引物2b TTT TCC ACA GCC AGG GTG GCA TTG ATG GGG CGG CAC CGT GGA CCAGCA CCA GCT GTG GTG CCT GAG TCC TCA GTG(SEQ ID NO:22)將產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物(約3376p)用上述方法進(jìn)行證實(shí)和純化，用BglⅡ和XcmⅠ消化，然后連接進(jìn)用BglⅡ/XbaⅠ消化的pSVLTBPhCGβ中。對(duì)從得自轉(zhuǎn)化的AG1大腸桿菌分離的質(zhì)粒中插入物的存在通過(guò)用BglⅡ和XcmⅠ的消化來(lái)證實(shí)，該新構(gòu)建體被命名為pSVLTBP(20-190)-hCGβ。
隨后對(duì)該新構(gòu)建體用DNA測(cè)序來(lái)證實(shí)。
除了產(chǎn)生這些新的以pSVL為基的質(zhì)粒外，這些構(gòu)建體也被亞克隆進(jìn)其它可能更適于在CHO中穩(wěn)定表達(dá)的其它表達(dá)載體中，特別是載體D2，以前被描述為質(zhì)粒CLH3AXSV2DHFR(45)。這是通過(guò)將側(cè)接基于pSVL的載體中的插入物的BamHⅠ位點(diǎn)轉(zhuǎn)換成XhoⅠ位點(diǎn)，然后用XhoⅠ切除該插入物并將它克隆進(jìn)Xhol消化的Dα中。
2、雜種蛋白質(zhì)的瞬間和穩(wěn)定表達(dá)用于瞬間表達(dá)TBP-hCG雜種蛋白質(zhì)的COS-7細(xì)胞(ATCCCRL 1651,ref.46)的轉(zhuǎn)染是使用電穿孔進(jìn)行的(47)。將指數(shù)生長(zhǎng)的COS-7細(xì)胞通過(guò)胰蛋白酶消化除去，通過(guò)輕微離心(800rpm,4分鐘)收集，用冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS),pH7.3-7.4洗滌，然后通過(guò)離心重新團(tuán)聚。將細(xì)胞以每400μl冷PBS為5×106細(xì)胞的濃度重新懸浮并在預(yù)冷凍的2mm缺口電穿孔小槽中與10μg質(zhì)粒DNA混合。對(duì)于共轉(zhuǎn)染來(lái)說(shuō)使用35μg的每種質(zhì)粒。將小槽和細(xì)胞在冰上再冷凍10分鐘，然后使用BTX600型儀器和125V,950μF和R=8的條件進(jìn)行電穿孔。之后將細(xì)胞在冰上放置10分鐘使之冷凍，轉(zhuǎn)移至一個(gè)15ml含有9.5ml室溫溫度的完全培養(yǎng)基中(補(bǔ)充了10％小牛血清(FBS)的1％L-谷氨酰胺的Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM))，并在室溫下放置5分鐘。在該15ml試管中輕微混合后，將全部?jī)?nèi)含物接種到兩個(gè)P100平板上并置于一個(gè)37℃,5％CO2溫箱中。18小時(shí)后，改換培養(yǎng)基，并且在一些情況下該新的培養(yǎng)基僅含有1％或0％FBS。再過(guò)72小時(shí)后，收獲該條件培養(yǎng)基，離心除去細(xì)胞，然后在-70℃冷凍貯存。
用于瞬間或穩(wěn)定表達(dá)的CHO-DUKX(CHO)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染是使用DNA的磷酸鈣沉淀法進(jìn)行的，轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將指數(shù)生長(zhǎng)的CHO細(xì)胞以每平板7.5×105細(xì)胞的密度鋪布在100mm培養(yǎng)板上。在轉(zhuǎn)染的當(dāng)天，將10μg質(zhì)粒DNA放入0.5ml轉(zhuǎn)染緩沖液中(見(jiàn)下文)，加入31μl的2M CaCl2，將該DNA-CaCl2溶液進(jìn)行渦旋混合，并在室溫下放置45分鐘。在此之后，將培養(yǎng)基從平板上吸去，使用一個(gè)無(wú)菌塑料管將DNA加到細(xì)胞中，并將這些細(xì)胞在室溫下放置20分鐘，在此期間結(jié)束時(shí)，向平板中加入5ml含有10％FBS的完全α(+)MEM，將其在37℃溫育4-6小時(shí)。然后將培養(yǎng)基從平板上吸去，將這些細(xì)胞在37℃用轉(zhuǎn)染緩沖液中的15％甘油液溫育3.5分鐘而進(jìn)行甘油沖擊。在將該甘油溶液除去后，將細(xì)胞用PBS洗兩次，再加入10ml完全α(+)MEM,10％FBS，并放回37℃培養(yǎng)箱。為了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，48小時(shí)后將這些細(xì)胞1∶10分開(kāi)用選擇培養(yǎng)基(完全α(-)MEM(缺乏核苷)，10％透析的FBS，和0.02μM氨甲蝶呤)喂養(yǎng)。非轉(zhuǎn)染的(非抗性的)細(xì)胞一般情況下在3-4周中被除去，剩下了轉(zhuǎn)染的，氨甲蝶呤抗性的細(xì)胞群。
3、表達(dá)的定量分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞的雜種蛋白質(zhì)的分泌是使用檢測(cè)可溶性p55的商品試劑盒(R&D Systems；Minneapolis,Minnesota)，按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)的。這一檢測(cè)也提供了一種對(duì)條件化的和處理的培養(yǎng)基中雜種蛋白質(zhì)的估測(cè)，以此為基礎(chǔ)選擇用于生物檢測(cè)中的劑量。
4、對(duì)異源二聚體形成的評(píng)估為評(píng)估TBP-hCG亞基融合體結(jié)合和形成異源二聚體的能力，進(jìn)行了使用針對(duì)hCG亞基的抗體的夾心面包免疫檢測(cè)(Sandwichimmunoassay)。在這一檢測(cè)則中，將針對(duì)hCGβ亞基的單克隆抗體涂敷在微滴定板上并用于分析物捕獲。主要的檢測(cè)抗體是一種山羊多克隆抗體，它是針對(duì)人TSHα亞基培育的(#082422G-BiodesignInternational；Kennenbunkport,Maine)，反過(guò)來(lái)使用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的兔抗羊多克隆抗體(Cappel；Durham,North Carolina)檢測(cè)該山羊抗體。
在這一工作中使用幾種不同的抗hCGβ亞基抗體，它們對(duì)自由α亞基均設(shè)有顯示出可檢測(cè)的交叉反應(yīng)性。這些抗體中的一個(gè)(3/6)被用于商品MAIAclonehCG檢測(cè)試劑盒(Biodata；Romt,Italy)。
將高-蛋白質(zhì)結(jié)合微滴板(Costar#3590)涂布以捕獲抗體，通過(guò)溫育(2小時(shí)，37℃)用100μl/孔涂敷緩沖液(PBS,pH7.4,01mMCa++,0.1mM Mg++)中的5μg/ml抗體溶液進(jìn)行涂敷。用洗滌溶液(PBS,pH7.4+0.1％Tween20)洗過(guò)一次之后，通過(guò)用封閉溶液(PBS中3％小牛血清白蛋白(BSA；級(jí)分V-A-4503Sigma),pH7.4)將孔完全充滿(約400μl/孔)并在37℃溫育1小時(shí)或者在4℃過(guò)夜溫育將板封閉，然后將板用洗滌緩沖液洗滌兩次，并將參照和實(shí)驗(yàn)樣品，在用稀釋液(PBS中的5mg/ml BSA,pH7.4)稀釋至100μl體積后加入其中。在將板和樣品在37℃溫育2小時(shí)后，將板用洗滌溶液再洗滌兩次。加入在稀釋液中稀釋1∶5000的第一檢測(cè)抗體(100μl/孔)并在37℃溫育1小時(shí)。加入在稀釋液中稀釋1∶5000的第二檢測(cè)抗體(HRP偶聯(lián)的免抗羊Ig)(100μl/孔)，并在37℃溫育1小時(shí)后，用洗滌溶液將板洗滌三次。加入100μl TMB底物溶液(Kirkegaard和Perry實(shí)驗(yàn)室)，將板在黑暗中室溫下溫育20分鐘，然后通過(guò)加入50μl/孔，0.3M硫酸終止酶反應(yīng)。然后使用微滴板讀出器在波長(zhǎng)450nm處對(duì)板進(jìn)行分析。
5、部分純化為了更好地對(duì)這些雜種蛋質(zhì)的活性進(jìn)行定量，用免疫吸附層析法將TBP-hCG雜種蛋白質(zhì)進(jìn)行部分純化。所用的抗體是一種可通過(guò)商業(yè)途徑從R&D System(MAB#225)得到的單克隆抗體。柱為CNBr活化的瓊脂糖，按照制造商(Pharmacia)的說(shuō)明進(jìn)行裝填。
條件培養(yǎng)基是使用每天收獲的50μl SFMⅡ培養(yǎng)基(GIBCO)從每一細(xì)胞系的匯合T-175瓶中收集的，每一細(xì)胞系有5個(gè)收獲物。將收集物進(jìn)行離心(1000RPM)以除去細(xì)胞碎片。然后使用商品免疫檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)該材料進(jìn)行TBP含量檢測(cè)并進(jìn)行濃縮(Centricon unts by Arnicon；Beverly,Massachusetts)，使表觀TBP濃度為約50ng/ml。
將10ml濃縮的TBP-hCG(樣品#188737)通過(guò)加入NaCl并將該溶液的導(dǎo)電率調(diào)整至給85mS/cm而使其具有約1MNaCl。將它通過(guò)0.5ml的抗-TBP免疫親和柱。收集流出物并使其第二次通過(guò)該柱。之后用PBS中的1M NaCl洗滌該柱。在用50mM檸檬酸(pH2.5)洗脫之后收集結(jié)合的TBP(20-161)-hCG。將洗脫液(約7ml)通過(guò)使用Amicon Centricon-10’s并按照制造商(Amicon)的說(shuō)明進(jìn)行的過(guò)濾進(jìn)行濃縮，使其達(dá)到約200μl的體積。加入約800μl的PBS使樣品體積達(dá)到1ml,4℃儲(chǔ)存直至用生物檢測(cè)法進(jìn)行測(cè)試。
6、抗-TNF活性的評(píng)估。
多種用于評(píng)估可溶性TNF受體的類似物的體外TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法已有描述。我們使用了一種使用人乳腺癌細(xì)胞系。BT-20細(xì)胞(ATCCHTB19)的檢測(cè)方法。這些細(xì)胞作為TNF生物檢測(cè)的基礎(chǔ)的使用已有描述(48)。將這些細(xì)胞在37℃培養(yǎng)在補(bǔ)充了10％熱失活TBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，將細(xì)胞生長(zhǎng)至最大80-90％匯合，這樣每3-4天限制了分裂，種子密度為每T175cm2瓶約3×106個(gè)細(xì)胞。
BT-20檢測(cè)使用了一種細(xì)胞染料，結(jié)晶紫，的著色，以此作為用TNF處理后對(duì)存活細(xì)胞評(píng)估的檢測(cè)方法，死亡細(xì)胞不能攝取并保持該染料。
簡(jiǎn)言之，用于檢測(cè)抗TNF活性的方法如下。將重組人TNFα(R&D systems)和實(shí)驗(yàn)樣品配制于培養(yǎng)基中(RPMI 1640和5％熱滅活的FBS，并加到96孔培養(yǎng)板上的孔中。然后將這些細(xì)胞以1×105細(xì)胞/孔的密度平鋪到這些孔中。加入的TNFα的量是早先在滴定研究中測(cè)定的，并代表一種約50％的細(xì)胞被殺死的劑量。
樣品加入之后，將細(xì)胞在39℃培養(yǎng)48小時(shí)，之后，使用結(jié)晶紫染色和微滴板讀出器(570nm)確定活細(xì)胞的比例。結(jié)果1、被研究的構(gòu)建體對(duì)研究的雜種蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)總結(jié)于下；對(duì)兩種對(duì)照蛋白質(zhì)，一種單體可溶性p55(r-hTBP-1)和一種二聚體TBP-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)(TBP-IgG3)(基本上如(10)所述制備的)進(jìn)行了研究，以進(jìn)行比較。
構(gòu)建體 TNPN-末端 TBPC-末端 融合對(duì)應(yīng)物r-hTBP-1 9和20的混合物180 無(wú)TBP-IgG3 9和20的混合物190 IgG3重鏈恒定區(qū)TBP(20-161)-hCG 20 161 hCGα和hCGβ(異源二聚體)(異源二聚體)(異源二聚體)TBP(20-190)-hCG 20 190 hCGα和hCGβ編碼TBP(20-190)-hCG和TBP(20-161)-hCG的DNA的序列分別示于圖1和2。對(duì)這些構(gòu)建體的圖示總結(jié)示于圖3。
2、TBP-hCG蛋白質(zhì)的分泌發(fā)現(xiàn)所有這些構(gòu)建體被轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生并分泌至培養(yǎng)基中。表示這些結(jié)果的數(shù)據(jù)示于表1和表2。
3、組裝成異源二聚體的TBP-hCG(αβ)融合蛋白質(zhì)TBP-hCGα和TBP-hCGβ的結(jié)合是使用hCG異源二聚體的夾心餅檢測(cè)法得證實(shí)的，只有α和β亞基融合物的聯(lián)合轉(zhuǎn)染產(chǎn)生異源二聚體檢測(cè)(表3)。
4、TBP-hCG雜種蛋白質(zhì)與TBP單體相比顯示出提高了的活性。
在COS-7或CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的染種蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)為在BT-20生和檢測(cè)中為TNFα的強(qiáng)抑制物。一些樣品的檢測(cè)結(jié)果總結(jié)于表4。
負(fù)對(duì)照(來(lái)自模擬轉(zhuǎn)染的條件培養(yǎng)基)被包括在IX培養(yǎng)基樣品中。
如圖4-6所示(Y軸上的點(diǎn))，TNF的加入(2.5ng/ml)導(dǎo)致活細(xì)胞數(shù)的明顯降低(由OD570測(cè)得)。在每一種情況下，活性樣品所具有的最大保護(hù)效能是將細(xì)胞存活性恢復(fù)到在不加入TNF時(shí)所看到的水平(即，標(biāo)有“只有細(xì)胞”的對(duì)照)正對(duì)照r-hTBP-1和TBP-IgG3均為保護(hù)性的，顯示出明顯的劑量依賴性，并且r-hTBP-1的ED50為約100ng/ml(圖4-6),TBP-TgG3的ED50為約1.5ng/ml(圖4)。
來(lái)自IX培養(yǎng)基或來(lái)自免疫純化物的TBP-hCG構(gòu)建體(CHO或COS)顯示出劑量依賴性的保護(hù)，其ED50在約2-11ng/ml的范圍內(nèi)(圖4-6)。
體外生物檢測(cè)的結(jié)果描述于表5。這些結(jié)果表明，該雜種蛋白質(zhì)抑制了TNF細(xì)胞毒性，并且它們基本上比TBP單體更有效力。負(fù)對(duì)照沒(méi)有保護(hù)活性。
除了TBP的二聚體化可增強(qiáng)效力的可能性外，也有可能該雜種蛋白質(zhì)的活性與TBP的二聚體相互作用沒(méi)有關(guān)系，而是與空間位阻有關(guān)，這是由于該雜種蛋白質(zhì)的參與物干擾可溶性TBP/TNF與細(xì)胞表面TNF受體的結(jié)合。
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對(duì)已知的方法步驟、常規(guī)的方法步驟、已知的方法或常規(guī)的方法的參考并不意味著我們承認(rèn)本發(fā)明的任一方面，描述或?qū)嵤┓桨敢言谶@些相關(guān)文獻(xiàn)中被公開(kāi)，教導(dǎo)或提示。
前文對(duì)特定實(shí)施例的描述對(duì)本發(fā)明的總體的性質(zhì)進(jìn)行了完整的披露，其他人應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)的知識(shí)(包括本文引用的參考文獻(xiàn))可容易地對(duì)這些特定實(shí)施例進(jìn)行修改和調(diào)整，而不需要進(jìn)行過(guò)多的實(shí)驗(yàn)，但卻不偏離本發(fā)明的總體內(nèi)容。因而，基于本文的教導(dǎo)和指示，這些調(diào)整和修改應(yīng)包含于本文公開(kāi)的實(shí)施例等同意思和范圍之內(nèi)。本文的措辭和用語(yǔ)應(yīng)被理解為為了更清楚描述的目的，而不限定其范圍。本發(fā)明書(shū)的諸詞和用語(yǔ)應(yīng)由本技術(shù)領(lǐng)域人普通技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)和指示并結(jié)合本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的現(xiàn)有知識(shí)進(jìn)行解釋。

構(gòu)建體是使用pSVL(Pharmacia)表達(dá)的

構(gòu)建體是使用含有小鼠金屬硫蛋白啟動(dòng)子的載體-pDα表達(dá)的

**用于材料的劑量的定量和ED50的估測(cè)是使用TBPELISA進(jìn)行的參考文獻(xiàn)1．Smith,R.A.et al.,J. Biol.Chem.262:6951-6954,1987.
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序列表(1)總信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)名稱應(yīng)用研究系統(tǒng)ARS控股公司(B)街道14 John B.Gorsiraweg(C)城市Curacao(D)國(guó)家Netherlands Antilles(E)郵政編碼(A)姓名CAMPBELL,Robert C.
(B)街道25 Meadowbrood Drive(C)城市Wrentham(D)州Massachusetts(E)國(guó)家USA(A)姓名JAMESON,Bradford A.
(B)街道76 Robbins Street(C)城市Milton(D)州Massachusetts(E)國(guó)家USA(A)姓名CHAPPEL,Scott C.
(B)街道125 Canton Avenue(C)城市Milton(D)州Massachusetts(E)國(guó)家USA(ⅱ)發(fā)明名稱雜種蛋白質(zhì)(ⅲ)序列數(shù)目22(ⅳ)通信地址(A)收信人BROWDY AND NEIMARK(B)街道419 Seventh Street N.W.,Ste.300(C)城市Washington(D)州D.C.
(E)國(guó)家USA(F)郵政編碼22207(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(ⅵ)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?0/011936(B)申請(qǐng)日1996年2月20日(C)分類(ⅷ)代理人信息(A)姓名Browdy,Roger L.
(B)登記號(hào)25618(C)案號(hào)CAMPBELL=2A PCT(ⅸ)通訊資料(A)電話(202)628-5197(B)傳真(202)737-3528(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1049堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置278..1047(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1TCCACATGGC TACAGGTAAG CGCCCCTAAA ATCCCTTTGG GCACAATGTG TCCTGAGGGG 60AGAGGCAGCG ACCTGTAGAT GGGACGGGGG CACTAACCCT CAGGTTTGGG GCTTCTCAAT 120CTCACTATCG CCATGTAAGC CCAGTATTTG GCCAATCTCA GAAAGCTCCT CCTCCCTGGA 180GGGATGGAGA GAGAAAAACA AACAGCTCCT GGAGCAGGGA GAGTGCTGGC CTCTTGCTCT 240CCGGCTCCCT CTGTTGCCCT CTGGTTTCTC CCCAGGC TCC CGG ACG TCC CTG CTC 295Ser Arg Thr Ser Leu Leu1 5CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGT GCC343Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala10 15 20GAT AGT GTG TGT CCC CAA GGA AAA TAT ATC CAC CCT CAA AAT AAT TCC391Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser25 30 35ATT TGC TGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT GAC TGT439Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu 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165GCT GCC CCA GGT TGC CCA GAA TGC ACG CTA CAG GAA AAC CCA TTC TTC823Ala Ala Pro Gly Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe170 175 180TCC CAG CCG GGT GCC CCA ATA CTT CAG TGC ATG GGC TGC TGC TTC TCT 871Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser185 190 195AGA GCA TAT CCC ACT CCA CTA AGG TCC AAG AAG ACG ATG TTG GTC CAA 919Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln200 205 210AAG AAC GTC ACC TCA GAG TCC ACT TGC TGT GTA GCT AAA TCA TAT AAC 967Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn215 220 225 230AGG GTC ACA GTC ATG GGG GGT TTC AAA GTG GAG AAC CAC ACG GGG TGC 1015Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Gly Cys235 240 245CAC TGC AGT ACT TGT TAT TAT CAC AAA TCT TA AG 1049His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser250 255(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度256氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp1 5 10 15Leu Gln Glu Gly Ser Ala Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile20 25 30His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr35 40 45Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg50 55 60Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His65 70 75 80Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile85 90 95Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn100 105 110Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys115 120 125Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln130 135 140Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu145 150 155 160Cys Val Ser Cys Ala Gly Ala Ala Pro Gly Cys Pro Glu Cys Thr Leu165 170 175Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys180 185 190Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys195 200 205Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys210 215 220Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val225 230 235 240Glu Asn His Thr Gly Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser245 250 255(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1202堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置279..1199(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3CTCGAGATGG CTACAGGTAA GCGCCCCTAA AATCCCTTTG GGCACAATGT GTCCTGAGGG 60GAGAGGTAGC GACCTGTAGA TGGGACGGGG GCACTAACCC TGAGGTTTGG GGCTTCTGAA 120TGTGAGTATC GCCATGTAAG CCCAGTATTT GGCCAATGTC AGAAAGCTCC TGGTCCCTGG 180AGGGATGGAG AGAGAAAAAC AAACAGCTCC TGGAGCAGGG AGAGTGCTGG CCTCTTGCTC 240TCCGGCTCCC TCTGTTGCCC TGTGGTTTCT CCCCAGGC TCC CGG ACG TCC CTG 293Ser Arg Thr Ser Leu260CTC CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGT341Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser265 270 275GCC GAT AGT GTG TGT CCC CAA GGA AAA TAT ATC CAC CCT CAA AAT AAT389Ala Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn280 285 290TCG ATT TGC TGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT GAC437Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys 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Cys Val Ser Cys Ala410 415 420GGT GCT GGT CCA CGG TGC CGC CCC ATC AAT GCC ACC CTG GCT GTG GAG 821Gly Ala Gly Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu425 430 435AAG GAG GGC TGC CCC GTG TGC ATC ACC GTC AAC ACC ACC ATC TGT GCC 869Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala440 445 450GGC TAC TGC CCC ACC ATG ACC CGC GTG CTG CAG GGG GTC CTC CCC GCC 917Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala455 460 465CTG CCT CAG GTG GTG TGC AAC TAC CGC GAT GTG CGC TTC GAG TCC ATC 965Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile470 475 480 485CGG CTC CCT GGC TGC CCG CGC GGC GTG AAC CCC GTG GTC TCC TAC GCT 1013Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala490 495 500GTG GCT CTC AGC TGT CAA TGT GCA CTC TGC CGC CGC AGC ACC ACT GAC 1061Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp505 510 515TGC GGG GGT CCC AAG GAC CAC CCC TTG ACC TGT GAT GAC CCC CGC TTC 1109Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe520 525 530CAG GAC TCC TCT TCC TCA AAG GCC CCT CCC CCC AGC CTT CCA AGC CCA 1157Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro535 540 545TCC CGA CTC CCG GGG CCC TCG GAC ACC CCG ATC CTC CCA CAA TAA 1202Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln550 555 560(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度307氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp1 5 10 15Leu Gln Glu Gly Ser Ala Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile20 25 30His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr35 40 45Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg50 55 60Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His65 70 75 80Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile85 90 95Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn100 105 110Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys115 120 125Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln130 135 140Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu145 150 155 160Cys Val Ser Cys Ala Gly Ala Gly Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala165 170 175Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn180 185 190Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Gln195 200 205Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp Val210 215 220Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro225 230 235 240Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu Cys Arg245 250 255Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys260 265 270Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro275 280 285Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile290 295 300Leu Pro Gln305(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1147堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅸ)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置278..1132(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5TCGAGATGGC TACAGGTAAG CGCCCCTAAA ATCCCTTTGG GCACAATGTG TCCTGAGGGG 60AGAGGCAGCG ACCTGTAGAT GGGACGGGGG CACTAACCCT CAGGTTTGGG GCTTTTGAAT 120GTGAGTATGG CCATGTAAGC CCAGTATTTG CCCAATCTCA GAAAGCTCCT GGTCCCTGGA 180GGGATGGAGA GAGAAAAACA AACAGCTCCT GGAGCAGGGA CACTCCTGGC CTCTTGCTCT 240GCGGCTCCGT GTGTTGCCCT GTGGTTTCTC CCCACGC TCC CGG ACG TCC CTG CTC 295Ser Arg Thr Ser Leu Leu310CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGT GCC343Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala315 320 325GAT AGT GTG TGT CCC CAA GGA AAA TAT ATC CAC CCT CAA AAT AAT TCG391Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser330 335 340 345ATT TGC TGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT GAC TGT439Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys350 355 360CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACC GAC TGC AGG GAG TGT GAG AGC GGC TCC487Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser365 370 375TTC ACC GCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC TCC AAA535Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys380 385 390TGC CGA AAG GAA ATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG GAC583Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp395 400 405CGG GAC ACC GTG TGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT TAT TGG631Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp410 415 420 425AGT GAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TGC ACC CTC TGC CTC AAT GGG679Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Thr Leu Cys Leu Asn Gly430 435 440ACC GTG CAC CTC TCC TGT CAG GAG AAA CAG AAC ACC GTC TGC ACC TGC727Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys445 450 455CAT GCA GGT TTC TTT CTA AGA GAA AAC GAG TGT GTC TCC TGT AGT AAC775His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn460 465 470TGT AAG AAA AGC CTG GAG TGC ACG AAG TTG TCC CTA CCC CAG ATT GAG823Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Ser Leu Pro Gln Ile Glu475 480 485AAT GTT AAG GGC ACT GAG GAC TCA GGC ACC ACA GCC GGT GCT GCC CCA871Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr Ala Gly Ala Ala Pro490 495 500 505GGT TGC CCA GAA TGC ACG CTA CAG GAA AAC CCA TTC TTC TCC CAG CCG 919Gly Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro510 515 520GGT GCC CCA ATA CTT CAG TGC ATG GGC TGC TGC TTC TCT AGA GCA TAT 967Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr525 530 535CCC ACT CCA CTA AGG TCC AAG AAG ACG ATG TTG GTC CAA AAG AAC GTC 1015Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val540 545 550ACC TCA GAG TCC ACT TGC TGT GTA GCT AAA TCA TAT AAC AGG GTC ACA 1063Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr555 560 565GTA ATG GGG GGT TTC AAA GTG GAG AAC CAC ACG GCG TGC CAC TGC AGT 1111Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser570 575 580 585ACT TGT TAT TAT CAC AAA TCT TAAGGATCCC TCGAG 1147Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser590(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度285氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp1 5 10 15Leu Gln Glu Gly Ser Ala Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile20 25 30His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr35 40 45Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg50 55 60Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His65 70 75 80Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile85 90 95Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn100 105 110Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys115 120 125Thr Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln130 135 140Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu145 150 155 160Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu165 170 175Ser Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr180 185 190Thr Ala Gly Ala Ala Pro Gly Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn195 200 205Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys210 215 220Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met225 230 235 240Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys245 250 255Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His260 265 270Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser275 280 285(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1301堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置279..1287(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7CTCGAGATGG CTACAGGTAA GCGCCCCTAA AATCCCTTTG GGCACAATGT GTCCTGAGGG 60GAGAGGCAGC GACCTGTAGA TGGGACGGGG GCACTAACCC TCAGGTTTGG GGCTTCTGAA 120TGTGAGTATC GCCATGTAAG CCCAGTATTT GGCCAATGTC AGAAAGCTCC TGGTCCCTGG 180AGGGATGGAG AGAGAAAAAC AAACACCTCC TGGAGCAGGG AGAGTGCTGC CCTCTTGCTC 240TCCGGCTCCC TCTGTTGCCC TCTGGTTTCT CCCCAGGC TCC CGG ACG TCC CTG 293Ser Arg Thr Ser Leu290CTC CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGT341Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser295 300 305GCC GAT AGT GTG TGT CCC CAA GGA AAA TAT ATC CAC CCT CAA AAT AAT389Ala Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn310 315 320TCG ATT TGC TGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT GAC437Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp325 330 335TGT CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACG GAC TGC AGG GAG TGT GAG AGC GGC485Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly340 345 350TCC TTC ACC GCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC TCC 533Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser355 360 365 370AAA TGC CGA AAG GAA ATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG 581Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val375 380 385GAC CGG GAC ACC GTG TGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT TAT 629Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr390 395 400TGG AGT GAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TGC AGC CTC TGC CTC AAT 677Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn405 410 415GGG ACC GTG CAC CTC TCC TGC CAG GAG AAA CAG AAC ACC GTG TGC ACC 725Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr420 425 430TGC CAT GCA GGT TTC TTT CTA AGA GAA AAC GAG TGT GTC TCC TGT AGT 773Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser435 440 445 450AAC TGT AAG AAA AGC CTG GAG TGC ACG AAG TTG TGC CTA CCC CAG ATT 821Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile455 460 465GAG AAT GTT AAG GGC ACT GAG GAC TCA GGC ACC ACA GCT GGT GCT GGT 869Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr Ala Gly Ala Gly470 475 480CCA CGG TGC CGC CCC ATC AAT GCC ACC CTG GCT GTG GAG AAG GAG GGC 917Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly485 490 495TGC CCC GTG TGC ATC ACC GTC AAC ACC ACC ATC TGT GCC GGC TAC TGC 965Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys500 505 510CCC ACC ATG ACC CGC GTG CTG CAG GGG GTC CTG CCG GCC CTG CCT CAG 1013Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln515 520 525 530GTG GTG TGC AAC TAC CGC GAT GTG CGC TTC GAG TCC ATC CGG CTC CCT 1061Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro535 540 545GGC TGC CCG CGC GGC GTG AAC CCC GTG GTC TCC TAC GCC GTG GCT CTC 1109Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu550 555 560AGC TGT CAA TGT GCA CTC TGC CGC CGC AGC ACC ACT GAC TGC GGG GGT 1157Ser Cys Gln Cys Ala Leu Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly565 570 575CCC AAG GAC CAC CCC TTG ACC TGT GAT GAC CCC CGC TTC CAG GAC TCC 1205Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser580 585 590TCT TCC TCA AAG GCC CCT CCC CCC AGC CTT CCA AGC CCA TCC CGA CTC 1253Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu595 600 605 610CCG GGG CCC TCG GAC ACC CCG ATC CTC CCA CAA T AAGGATCCCT CGAG1301Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln615 620
(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度336氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp1 5 10 15Leu Gln Glu Gly Ser Ala Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile20 25 30His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr35 40 45Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg50 55 60Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His65 70 75 80Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile85 90 95Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn100 105 110Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys115 120 125Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln130 135 140Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu145 150 155 160Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu165 170 175Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr180 185 190Thr Ala Gly Ala Gly Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu Ala195 200 205Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr Ile210 215 220Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu225 230 235 240Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe Glu245 250 255Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser260 265 270Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu Cys Arg Arg Ser Thr275 280 285Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys Asp Asp Pro290295 300Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro305 310 315 320Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln325 330 335(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度6氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9Ala Gly Ala Ala Pro Gly1 5(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度4氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10Ala Gly Ala Gly1(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11TTTTCTCGAG ATGGCTACAG GTAAGCGCCC(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度39堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12ACCTGGGGCA GCACCGGCAC AGGAGACACA CTCGTTTTC
(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度42堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13TGTGCCGGTG CTGCCCCAGG TTGCCCAGAA TGCACGCTAC AG42(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14TTTTGGATCC TTAAGATTTG TGATAATAAC AAGTAC 36(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度39堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15CCGTGGACCA GCACCAGCAC AGGAGACACA CTCGTTTTC39(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:16TGTGCTGGTG CTGGTCCACG GTGCCGCCCC ATCAAT 36(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17TTTTGGATCC TTATTGTGGG AGGATCGGGG TG 32(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18TTTTAGATCT CTTCTTGCAC AGTGGAC 27(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19TGTGGTGCCT GAGTCCTCAG T 21(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度41堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20ACTGAGGACT CAGGCACCAC AGCCGGTGCT GCCCCAGGTT G 1(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21TTTTTCTAGA GAAGCAGCAG CAGCCCATG 29
(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度75堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22TTTTCCACAG CCAGGGTGGC ATTGATGGGG CGGCACCGTG GACCAGCACC AGCTGTGGTG60CCTGAGTCCT CAGTG 7權(quán)利要求
1.一種雜種蛋白質(zhì)，它含有形成一種二聚體的兩種共表達(dá)的氨基酸序列，每種氨基酸序列含有(a)至少一種選自一種同源聚體受體，一種異源聚體受體的鏈，一種配體，和它們的保留配體-受體結(jié)合能力的片段；以及(b)一種異源二聚體蛋白質(zhì)類激素的亞基，或者保留了該亞基與它的其它的亞基形成異源二聚體的能力的它的片段；其中序列(a)和(b)是直接結(jié)合的或通過(guò)一種肽連接物結(jié)合的，并且其中每一個(gè)所說(shuō)的兩種共表達(dá)的序列中的序列(b)能夠聚集形成一種二聚體復(fù)合體。
2.按照權(quán)利要求1所述的雜種蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的序列(a)選自TBP1、TBP2或者仍含有配體結(jié)合區(qū)域的它們的片段；IFNα/β受體或IFNγ受體的胞外區(qū)域；促性腺素受體或其胞外片段；抗體輕鏈或其片段，任選地與相應(yīng)的重鏈相聯(lián)；抗體重鏈或其片段；抗體Fab區(qū)域；和IL-6,IFN-β,TPO或其片段。
3.按照權(quán)利要求1所述的雜種蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的序列(b)是選自hCG,FSH,LH,TSH或抑制素的亞基，和它們的片段。
4.按照權(quán)利要求1所述的雜種蛋白質(zhì)，其中序列(a)是與序列(b)的氨基末端相連接。
5.按照權(quán)利要求1所述的雜種蛋白質(zhì)，其中序列(a)是與序列(b)的羧基末端相連接。
6.按照權(quán)利要求1所述的雜種蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的兩種共表達(dá)的氨基酸序列的每一種包括TBP1的序列或者它的片段，該片段相應(yīng)于TBP1的氨基酸殘基20-161或20-190，作為序列(a)，以及各自的hCG的α和β亞基或其片段，作為序列(b)。
7.按照權(quán)利要求1所述的雜種蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的兩種共表達(dá)的氨基酸序列的每一種包括促性腺素受體的胞外區(qū)域，作為序列(a)，以及各自的促性腺素的α和β亞基，作為序列(b)。
8.按照權(quán)利要求7所述的雜種蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的序列(a)是FSH受體胞外區(qū)域和序列(b)是FSH亞基。
9.按照權(quán)利要求7所述的雜種蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的序列(a)和(b)由一個(gè)肽連接物連接。
10.按照權(quán)利要求9所述的雜種蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的肽連接物具有一種酶切位點(diǎn)。
11.按照權(quán)利要求10所述的雜種蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的酶切位點(diǎn)是一種凝血酶切割位點(diǎn)。
12.按照權(quán)利要求10所述的雜種蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的酶切位點(diǎn)被一種發(fā)現(xiàn)于卵巢中的酶識(shí)別和切割。
13.按照權(quán)利要求9所述的雜種蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的肽連接物充當(dāng)一種柔性絞鏈。
14.按照權(quán)利要求1所述的雜種蛋白質(zhì)，其中在兩個(gè)亞基(b)之間加入了一個(gè)或多個(gè)共價(jià)鍵。
15.一種編碼權(quán)利要求1所述的雜種蛋白質(zhì)的DNA分子。
16.含有權(quán)利要求15所述DNA分子的表達(dá)載體。
17.一種宿主細(xì)胞，它含有權(quán)利要求16所述的表達(dá)載體并能夠表達(dá)所說(shuō)的雜質(zhì)蛋白質(zhì)。
18.一種生產(chǎn)雜種蛋白質(zhì)的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求17所述的宿主細(xì)胞并回收由其表達(dá)的雜種蛋白質(zhì)。
19.一種藥物組合物，它含有權(quán)利要求1所述的雜種蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。
20.一種誘導(dǎo)濾泡成熟的方法，包括將含有權(quán)利要求8所述的雜種蛋白質(zhì)的藥物組合物施用給有此需要的受施對(duì)象。
全文摘要
一種雜種蛋白質(zhì),它包括形成一種二聚體的兩種共同表達(dá)的氨基酸序列。每一個(gè)序列含有一種受體,如TBP1或TBP2,或一種配體,如IL6,IFN－β和TPO的結(jié)合部分。它與一種異源二聚體蛋白質(zhì)類激素如人CG的亞基連接。每一個(gè)共表示的序列含有一個(gè)相應(yīng)的激素亞基從而在表達(dá)后形成一種異源二聚體。也公開(kāi)了相應(yīng)的DNA分子,表達(dá)載體,宿主細(xì)胞,藥物組合物和生產(chǎn)這種蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號(hào)C12P21/04GK1212017SQ97192411
公開(kāi)日1999年3月24日 申請(qǐng)日期1997年2月20日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月20日
發(fā)明者羅伯特·K·坎佩利, 布拉德福德·A·詹姆森, 斯考特·C·查普爾 申請(qǐng)人:應(yīng)用研究系統(tǒng)Ars控股公司