專利名稱：：用于消化道神經(jīng)肌肉功能的益生菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用挑選的益生菌制造營養(yǎng)組合物或藥物，以預(yù)防或治療消化道(gut)疼痛或消化道不適、消化道運(yùn)動機(jī)能障礙(motordysfunction)、消化道神經(jīng)肌肉異常(neuromuscularabnormalities)和消化道感染后的后遺癥。本發(fā)明還涉及預(yù)防或治療消化道疼痛或消化道不適以及持久性消化道運(yùn)動機(jī)能障礙的方法。
背景技術(shù)：
：益生菌通常被定義為通過改善宿主的腸道微生物平衡而有利于人或動物宿主的活微生物食物增補(bǔ)劑。至今已經(jīng)報(bào)道或提出了益生菌的若干不同有利作用，如排除螺桿菌(Helicobacter)感染(EP0577903)、增強(qiáng)抗定居抗性(特別是對于梭狀芽孢桿菌(clostridium))、降低血清膽固醇、影響宿主免疫系統(tǒng)(例如在體液和細(xì)胞免疫系統(tǒng)水平)。EP0768375公開了能夠植入腸道菌群的雙岐桿菌(Bifidobacteria)，它能粘附腸道細(xì)胞并競爭性排除腸道細(xì)胞上的病原細(xì)菌。WO98/00035公開了含有幾種乳酸細(xì)菌的腸用組合物，如通過TCD4+外周血淋巴細(xì)胞的數(shù)量所測量到的，它們表現(xiàn)出可以刺激免疫系統(tǒng)。當(dāng)人和哺乳動物出現(xiàn)消化道不適或消化道疼痛時，這些常是消化道運(yùn)動性障礙或換句話說，消化道神經(jīng)肌肉異常的癥狀。任何年齡的個體在許多情況下都會出現(xiàn)消化道神經(jīng)肌肉異常。如嬰兒遭受的絞痛(colic)或反復(fù)的腹痛，婦女由于激素周期出現(xiàn)的消化道疼痛等等。就腸易激惹綜合癥(IBS)而言，益生菌對這一特殊綜合癥的效果在現(xiàn)有技術(shù)中并不一致。在最近的一項(xiàng)研究(NiedzielinK等人，Acontrolled，double-blind，randomizedstudyontheefficacyofLactobacillusplantarum299Vinpatientswithirritablebowelsyndrome，EuropeanJournalofGastroenterology&Hepatology2001，131143-1147)中發(fā)現(xiàn)益生菌可能具有調(diào)節(jié)消化道的運(yùn)動性的作用。另一方面，O′SullivanMA和O′Morain的文章(Bacterialsupplementationintheirritablebowelsyndrome.Arandomizeddouble-blindplacebo-controlledcrossoverstudy，DigLivDis2000May；32(4)302-4)中沒有發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)菌株GG與安慰劑平均值之間具有顯著差異。其它現(xiàn)有技術(shù)確證了此后一發(fā)現(xiàn)。ThompsonWG(Probioticsforirritablebowelsyndromealightinthedarkness？，EurJgastroenterolHepatol131135-1136，2001)討論了益生菌對IBS的可能治療作用。本發(fā)明的目的之一是減輕與消化道神經(jīng)肌肉控制和運(yùn)動功能的改變有關(guān)的任何疼痛或不適。本發(fā)明總的目的是減少和/或減輕與個體生命中任何可能情況有關(guān)的消化道神經(jīng)肌肉異常。發(fā)明概述值得注意的是，益生菌微生物、其代謝物和/或生長底物影響腸道內(nèi)的神經(jīng)肌肉控制。具體的，已證明特定的益生菌可用于減輕胃腸道神經(jīng)肌肉異常(特別是在感染后)。因此，本發(fā)明的第一方面提供挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物在制造預(yù)防或治療消化道疼痛或消化道不適的營養(yǎng)組合物或藥物中的用途。本發(fā)明的第二方面提供挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物在制造預(yù)防或治療消化道運(yùn)動機(jī)能障礙的營養(yǎng)組合物或藥物中的用途。本發(fā)明的第三方面提供挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物在制造預(yù)防或治療消化道神經(jīng)肌肉異常的營養(yǎng)組合物或藥物中的用途。本發(fā)明的第四方面提供挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物在制造治療或減輕消化道感染后的后遺癥的營養(yǎng)組合物或藥物中的用途。在還有的方面，本發(fā)明提供通過向人或動物施用有效量的挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物來預(yù)防或治療消化道疼痛或消化道不適的方法。在另一方面，本發(fā)明提供預(yù)防或治療消化道運(yùn)動機(jī)能障礙或感染后的過度收縮性(hyper-contractility)的方法，該方法包括施用有效量的挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物的步驟。本發(fā)明的一個優(yōu)勢是提供了治療或預(yù)防消化道神經(jīng)肌肉異常和相關(guān)的癥狀、消化道問題或疾病狀態(tài)的可能性。本發(fā)明的另一優(yōu)勢是提供了不施用藥物，而是基于食品級益生菌微生物或它們的衍生物來治療或預(yù)防消化道神經(jīng)肌肉異常的可能性。附圖簡述圖1顯示取自宿主生物的消化道肌肉組織的收縮強(qiáng)度曲線(AUC)下的面積，所述宿主在感染線蟲寄生蟲十天后被喂以不同的益生菌和對照。使用不同濃度的氨甲酰膽堿引發(fā)刺激(細(xì)節(jié)在實(shí)施例2中給出)。AUC是對消化道肌肉收縮的強(qiáng)度和持久性的測量，以及對感染過程中發(fā)展的神經(jīng)肌肉異常的程度的測量。符號表示以下意義◆對照、■嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，johnsonii)、×長雙岐桿菌(Bifidobacteriumlongum)、*乳酸雙岐桿菌(Bifidobacteriumlactis)、▲副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)?？梢娨嫔ǔ＝档虯UC，不同的菌株表現(xiàn)出或多或少的明顯效果。圖2顯示描述于圖1但是由電場刺激的肌肉組織的緊張性收縮(A)和位相性收縮(B)，并比較了喂以活的(L.p.)、死的(deadL.p.)副干酪乳桿菌(CNCMI-2116)益生菌株系以及僅喂以培養(yǎng)基上清液液(Sn)的宿主生物。術(shù)語“緊張性增加和位相性收縮”在實(shí)施例2和圖3中解釋。如所見的，所有益生菌來源的飼料(活的或死的細(xì)菌、上清液)都具有比對照(MRS)明顯更低的緊張性增加和位相性收縮。圖3形象地表示了用于測定感染后的神經(jīng)肌肉異常的方法的概念。曲線顯示對體外肌肉刺激的記錄。在刺激前記錄基礎(chǔ)張力(tone)(1)和基礎(chǔ)相位(4)。刺激后，肌肉發(fā)生收縮，此收縮被記錄為刺激后的張力(2)和刺激后的位相性收縮(5)。也可計(jì)算曲線(AUC)下的面積(7)。為了進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，比較了對照和處理樣品的緊張性收縮(3)、位相性收縮(6)和AUC(7)。發(fā)明詳述在說明書的上下文中，“包含”一詞指“包括，但不僅限于”。它不應(yīng)被理解為“僅僅由…組成”。為了本發(fā)明目的，術(shù)語“挑選的益生菌微生物”或簡單地“挑選的益生菌”指的是能夠發(fā)揮這里報(bào)道的有利作用的任何微生物，或這類益生菌的混合物或組合。因此益生菌可以選自已知的益生菌株系。然而，至今未知具有益生性質(zhì)的微生物也可能被證明具有根據(jù)本發(fā)明的有益的作用，并因此包括于術(shù)語“益生菌”中。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“營養(yǎng)組合物”旨在包括任何可食用的物質(zhì)。因此，它可以是設(shè)計(jì)為人食用的產(chǎn)品，但是此術(shù)語也包括動物食用的產(chǎn)品，例如寵物，如狗、貓、兔子、豚鼠、小鼠、大鼠、鳥(例如鸚鵡)、爬行動物和魚食用的產(chǎn)品。然而，此術(shù)語也包括其它馴養(yǎng)動物食用的食物，例如家畜(如牛、馬、豬、綿羊、山羊、水牛、駱駝等)的飼料產(chǎn)品。營養(yǎng)組合物可以是用于人消費(fèi)的食物產(chǎn)品，如飲料、飲品、棒狀食品、點(diǎn)心、冰激凌、奶制品(例如冷藏的或耐貯存的奶制品)、糖食、谷物產(chǎn)品(如早餐谷物)、旨在于微波爐或烤箱中加熱后食用的冷凍產(chǎn)品、即食產(chǎn)品、速食或營養(yǎng)配方制品等。營養(yǎng)配方制品包括任何全營養(yǎng)的或增補(bǔ)的制品。它可以是例如，通?？蓱?yīng)用的營養(yǎng)配方制品、嬰兒或幼兒配方制品、用于老年患者的配方制品、用于需要大量護(hù)理的患者的配方制品或?qū)ｉT適應(yīng)用于患有特殊疾病的患者的配方制品。例如，營養(yǎng)配方制品可以適應(yīng)于患有營養(yǎng)相關(guān)問題的患者，所述營養(yǎng)相關(guān)問題是例如Crohn氏癥、高血糖、肥胖、體重減輕、痢疾、便秘、苯丙酮尿癥、肝炎、急性或慢性腎衰竭等等。這類配方制品可以是可復(fù)水的，即以干品的形式存在，或是易于飲用的，例如以液體制品的形式。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“消化道神經(jīng)肌肉異?！卑ㄅc異常的或擾亂的消化道肌肉收縮、收縮性或運(yùn)動性相關(guān)聯(lián)的所有疼痛或不適相關(guān)癥狀。例如，這些異常與不正常的膨脹或通便有關(guān)，與嬰兒和/或幼兒的絞痛有關(guān)，與人或?qū)櫸锏南捞庄B有關(guān)，與消化道被寄生蟲(如線蟲或病原細(xì)菌)感染后擾亂的通過腸的轉(zhuǎn)運(yùn)時間有關(guān)。在本發(fā)明上下文中，消化道神經(jīng)肌肉異常還包括與嬰兒期相關(guān)的異常(如作為嬰兒絞痛問題的一部分)、與鍛煉相關(guān)的異常(包括運(yùn)動誘導(dǎo)的痙攣)和與劇烈鍛煉和體育運(yùn)動相關(guān)的神經(jīng)肌肉問題、與妊娠相關(guān)的異常和與分娩相關(guān)的失調(diào)、與具有無關(guān)損傷、創(chuàng)傷和感染但其臨床治療或狀況(包括抗生素、固定不動和腸胃外或腸內(nèi)喂食)導(dǎo)致了腸道神經(jīng)肌肉功能喪失的臨床患者相關(guān)的異常、與衰老有關(guān)的異常以及與活動減少、低膳食纖維和微生物區(qū)系改變相關(guān)的神經(jīng)肌肉控制喪失、與不尋常的飲食或生活習(xí)慣(包括飲酒、表現(xiàn)出神經(jīng)肌肉副作用的藥物、宇航員遇到的重力改變、劇冷或劇熱和再水化(rehydration)問題)相關(guān)的異常?！斑\(yùn)動機(jī)能障礙”等同于通常出現(xiàn)在人或動物的胃腸道被病原生物，如線蟲、絳蟲和某些細(xì)菌(如幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)或沙門氏菌(Salmonella))感染之后的消化道神經(jīng)肌肉異常。運(yùn)動機(jī)能障礙也可能發(fā)生在其它原因?qū)е碌陌l(fā)炎過程中或之后。在許多情況下，消化道神經(jīng)肌肉異?；蜻\(yùn)動機(jī)能障礙是持久的，會持續(xù)很長時間。優(yōu)選的是，本發(fā)明的用途涉及與消化道肌肉異常有關(guān)的消化道疼痛或不適?！昂筮z癥”是感染后持續(xù)的異?；蚱x健康狀態(tài)，即使是寄生蟲或其它感染因素已從宿主中消除。它們被認(rèn)為通常對宿主造成不可逆的損害。在本發(fā)明上下文中“益生菌來源物質(zhì)”包括活的或死的益生菌、通過用益生菌發(fā)酵獲得的培養(yǎng)基、在發(fā)酵后的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的代謝物以及它的衍生物，如濃縮物等、發(fā)酵底物、通過如過濾或離心去除掉益生細(xì)菌后的培養(yǎng)基上清液或保留物。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，消化道疼痛或不適、運(yùn)動機(jī)能紊亂或消化道神經(jīng)肌肉異常由病原體感染消化道引起。本發(fā)明上下文中“病原體”包括能夠感染個體消化道并導(dǎo)致疾病狀態(tài)的微生物。因此術(shù)語“病原體”包括寄生蟲、細(xì)菌、病毒、多細(xì)胞生物(如線蟲和其它蠕蟲)。益生菌的選擇可以選擇任何合適的微生物作為益生菌。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的益生菌選自對人或動物的健康發(fā)揮有益作用的微生物。文獻(xiàn)中提及了一些可以從中挑選出根據(jù)本發(fā)明的益生菌的微生物。如EP0862863A2，具體在第3頁，第25-37行，列出了可以從中選擇本發(fā)明益生菌的微生物。合適的益生微生物的例子包括酵母如酵母屬(Saccharomyces)、德巴利酵母屬(Debaromyces)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)和球擬酵母屬(Torulopsis)，霉菌如曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、毛霉屬(Mucor)和青霉屬(Penicillium)和球擬酵母屬(Torulopsis)以及細(xì)菌如雙岐桿菌屬(Bifidobacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、蜜蜂球菌屬(Melissococcus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、庫克菌屬(Kocuria)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、消化鏈球菌屬(Peptostrepococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、微球菌屬(Micrococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、魏斯氏菌屬(Weissella)、氣球菌屬(Aerococcus)、酒球菌屬(Oenococcus)以及乳桿菌屬(Lactobacillus)。合適的益生菌微生物的具體例子有黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(A.oryzae)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、腸膜芽孢桿菌(B.mesentericus)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilus)、納豆芽孢桿菌(B.natto)、嗜淀粉擬桿菌(Bacteroidesamylophilus)、多毛擬桿菌(Bac.capillosus)、棲瘤胃擬桿菌(Bac.ruminocola)、豬擬桿菌(Bac.suis)、青春雙岐桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、B.animalis、短雙岐桿菌(B.breve)、兩岐雙岐桿菌(B.bifidum)、嬰兒雙岐桿菌(B.infantis)、乳酸雙岐桿菌(B.lactis)、長雙岐桿菌(B.longum)、假長雙岐桿菌(B.pseudolongum)、嗜熱雙岐桿菌(B.thermophilum)、Candidapintolepesii、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、乳脂腸球菌(Enterococcuscremoris)、E.diacetylactis、糞腸球菌(E.faecium)、中間腸球菌(E.intermedius)、乳酸腸球菌(E.lactis)、E.muntdi、嗜熱腸球菌(E.thermophilus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、L.alimentarius、L.amylovorus、卷曲乳桿菌(L.crispatus)、短乳桿菌(L.brevis)、干酪乳桿菌(L.casei)、彎曲乳桿菌(L.curvatus)、纖維二糖乳桿菌(L.cellobiosus)、L.delbrueckiiss.Bulgaricus、L.farciminis、發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)、加氏乳桿菌(L.gasseri)、瑞士乳桿菌(L.helveticus)、乳酸乳桿菌(L.lactis)、植物乳桿菌(L.plantarum)、約氏乳桿菌(L.johnsonii)、羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、L.sakei、唾液乳桿菌(L.salivarius)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、P.cereviseae(damnosus)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)、費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、謝氏丙酸桿菌(Prop.shermanii)、釀酒酵母(Saccharomycescereviseae)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、木糖葡萄球菌(Staph.xylosus)、Streptococcusinfantarius、Strep.Salivariusss.thermophilus、嗜熱鏈球菌(Strep.thermophilus)、乳鏈球菌(Strep.Lactis)。例如，益生菌株可以選自例如地衣芽孢桿菌(DSM5749)、枯草芽孢桿菌(DSM5750)、乳酸雙岐桿菌(DSM20215)、糞腸球菌菌株(如NCIMB10415、NCIMB11181、NCIMB30098、DSM3520、DSM4788、DSM4789、DSM5464、DSM7134、CECT4515)、E.mundtii(CNCMMA27/4E)、釀酒酵母菌株(如BCCM/MUCL39885、CBS49394、CNCMI-1077、CNCMI-1079、NCYCSc47)、干酪乳桿菌(NCIMB30096)、L.farciminis(CNCMMA67/4R)、約氏乳桿菌(I-1225CNCM)、副干酪乳桿菌(I-2116CNCM)、植物乳桿菌(CNCMI-840)、鼠李糖乳桿菌(DSM7133)、乳酸片球菌(CNCMMA18/5M)、Streptococcusinfantarius(CNCMI-841)、嗜熱鏈球菌(Chr.Hansen，)，和它們的混合物。根據(jù)本發(fā)明，具有示例性保藏菌株的益生菌種的另外例子可以選自羅伊氏乳桿菌(CNCMI-2452、CNCMI-2448、CNCMI-2450、CNCMI-2451)、鼠李糖乳桿菌(CNCMI-2449)、嗜酸乳桿菌(CNCMI-2453)和它們的混合物。在這一段提及的菌株可能特別適合寵物。可以通過篩選方法從以上列出的微生物中挑選根據(jù)本發(fā)明的有效益生菌。盡管可以使用任何合適的篩選方法，但BarbaraG、VallanceBA在CollinsSMPersistentintestinalneuromusculardysfunctionafteracutenematodeinfectioninmice，Gastroenterology1997；1131224-1232中開發(fā)的方法被證明相對快速。此參考文獻(xiàn)公開了一種測量消化道神經(jīng)肌肉異常程度的模型。因此，可以通過以下步驟挑選合適的益生菌-從一種動物物種或人挑選患有消化道神經(jīng)肌肉異常的至少一個生物體，-通過腸道途徑向該生物施用益生菌來源物質(zhì)，-測量該生物消化道肌肉組織的第一收縮性，-將此第一收縮性與陰性對照的第二收縮性相比較，和，-挑選益生菌株，所述益生菌株會導(dǎo)致食用它的生物的肌肉組織具有低于陰性對照的第一收縮性。在有關(guān)篩選的段落中用于挑選特定益生菌株的“陰性對照”旨在指患有消化道神經(jīng)肌肉異常的生物的消化道肌肉組織，并且該生物沒有通過腸道途徑接受益生菌來源物質(zhì)。篩選包括測量生物消化道肌肉組織的第一收縮性的步驟，此外還包括將此第一收縮性與陰性對照的第二收縮性相比較的步驟?？梢酝ㄟ^任何適當(dāng)?shù)姆椒y量收縮性。例如，使用BarbaraG、VallanceBA、CollinsSM的方法(見上文)。參見特別是1225-1226頁的章節(jié)“用于收縮性研究的組織制備”、“收縮的測量”、“電場刺激的參數(shù)”、“藥物和溶液”及“數(shù)據(jù)表達(dá)和統(tǒng)計(jì)分析”，在此這些章節(jié)被引入為參考。因此，可以在體外測量收縮性，即，解剖消化道節(jié)段(例如近端空腸節(jié)段)，在組織浴槽中以合適的方式固定此節(jié)段，誘導(dǎo)肌肉收縮(例如通過化學(xué)或電刺激)，用適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)處理器記錄收縮。如圖3所描述的，基礎(chǔ)張力(1)、刺激后的張力(2)和緊張性收縮(3)以及基礎(chǔ)相位(4)、刺激后的位相性收縮(5)、位相性收縮(6)和曲線下面積(7)的測量可以作為收縮性的參數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的挑選的益生菌是按照上述篩選方法挑選的、例如相對于陰性對照，在患有消化道神經(jīng)肌肉異常的生物中能降低消化道肌肉的收縮性的益生菌。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，挑選的益生菌是能夠在小鼠模型中通過顯著降低Th2釋放的細(xì)胞因子來影響病原體誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的益生菌。優(yōu)選的Th2釋放的細(xì)胞因子是IL-4和/或IL-13。在本發(fā)明上下文中，“顯著的”指的是P＜0.1(優(yōu)選p＜0.05)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，它是通過將喂以益生菌的感染小鼠(處理)與陰性對照相比而獲得的。通常，可以在感染后于確定的時期在縱行腸肌肌肉制品(longitudinalmyentericmusclepreparation，LMMP)中測量細(xì)胞因子。優(yōu)選在感染后14天于LMMP中測量細(xì)胞因子。可以使用商業(yè)可獲得的試劑盒并按照廠商的說明書測量細(xì)胞因子濃度。評估益生菌是否能夠顯著降低Th2釋放的細(xì)胞因子的優(yōu)選方法包括小鼠模型，見下述。對每只雌性NIH瑞士小鼠(6-8周齡)管飼375只旋毛蟲(Trichinellaspiralis)幼蟲(見BarbaraG.等人的方法，前文)。為了測定益生菌的影響，從感染后的10到21天，感染的小鼠被每日通過管飼喂以100μl1010個益生微生物(細(xì)菌、酵母等)，使用100μlMRS作為陰性對照?？梢酝ㄟ^解剖整個空腸，在冷的無菌PBS中漂洗，并切成4段來制備LMMP。除去腸系膜，并將腸段固定在玻璃棒上。使用干凈的棉簽刮下肌肉層，速凍并儲存于-70℃直到試驗(yàn)?？梢酝ㄟ^組織學(xué)評估確證肌肉的成功分離。將肌肉組織置于1ml含有10％NP-40、10mg/ml異丙醇中的PMSF、1mg/ml抑酶肽和1mg/ml亮抑酶肽的裂解緩沖液中。組織勻漿后測定總蛋白質(zhì)濃度(Bio-RAD蛋白質(zhì)分析，Hercules，CA，USA)，等分分裝樣品并儲存于-70℃以用于進(jìn)一步分析。使用商業(yè)試劑盒(QuantikineMMurine，Minneapolis，MN，USA)，按照廠商說明書，可以在LMMP中測定IL-4和IL-13(Th2-細(xì)胞因子)和其它炎癥介質(zhì)TGF-bl和PGE2的濃度。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，益生菌是能夠在小鼠模型中通過顯著降低COX-2、TGF-β1或PGE2在LMMP中的表達(dá)或濃度來影響病原體誘導(dǎo)的炎癥的益生菌?？梢杂萌缟现赋鲇糜贗L-4和IL-13的方式以商業(yè)可獲得的試劑盒，通過分析LMMP來測量TGF-β1或PGE2濃度。以下給出評估顯著差異(特別是被感染小鼠的LMMP中表達(dá)的TGF-β1和COX-2)的優(yōu)選方法在感染后14天于LMMP中測量TGF-β和COX-2的信使RNA表達(dá)。使用一步法從LMMP中分離總RNA(ChonczynskiP，SacciN″SinglestepmethodofRNAisolationbyacidguanidiumthiocyanate-phenol-chloroformextraction，″AnnBiochem162156-159；1987)。按照VerduEF等人的描述(Modulatoryeffectofestrogenintwomurinemodelsofexperimentalcolitis.AmJPhysiolgastrointestLiverPhysiol2000；283G27-36)完成逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)。使用下述引物。HPRT(次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，用作標(biāo)準(zhǔn)化對照)有義5’-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3’，反義5’-GATTCAACTTGCGCTCATCTTAGGC-3’(SveticA，″Cytokineexpressionafterimmunization″，JImmun1472391-7)。TGFβ有義5’-TCACCCGCGTGCCTAATGGT-3’和反義5’-GGAGCTGAAGCAATAGTTGG-3’(DerynckR，RheeL，NucleicAcidRes1987；153187-97)；COX-2有義5’-TGGTGCCGGGTCTGATGATG-3’，反義5’-GCAATGCGGTTCTGATACTG-3′(Gustafson-Svard等人，Cyclooxygenase-1andcyclooxygenase-2geneexpressioninhumancolorectaladenocarcinomasandazomethaneinducedcolonictumoursinrats.Gut1996；3879-84)；為了排除污染樣品的基因組DNA的擴(kuò)增，也使用RNA作為底物進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增后在2％瓊脂糖凝膠中電泳分離15μl的PCR產(chǎn)物，通過溴乙啶染色顯像，并使用55型Polaroidland膠片拍照(Kodak，Rochester，NY)。底片被用于通過KodakDigitalScience1D2.0ImageAnalysis軟件進(jìn)行帶強(qiáng)度的密度計(jì)量學(xué)定量。以HPRT管家基因來標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果，并以細(xì)胞因子對HPRTmRNA的表達(dá)比例來表示。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，挑選的益生菌是雙岐桿菌。優(yōu)選的是乳酸雙岐桿菌或長雙岐桿菌。在還有的本發(fā)明實(shí)施方案中，挑選的益生菌是副干酪乳桿菌。還在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，挑選的益生菌選自長雙岐桿菌(CNCMI-2170)、乳酸雙岐桿菌(德意志微生物保藏中心DSM20215)、副干酪乳桿菌(CNCMI-2116，CNCMI-1292)和它們的混合物。而在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，益生菌包括死的益生細(xì)菌、發(fā)酵底物和/或益生菌來源物質(zhì)。任選的是，益生菌也包括它們的發(fā)酵底物，如益生素。本領(lǐng)域技術(shù)人員通常知道益生菌的發(fā)酵底物，例如雙岐桿菌可利用菊粉和/或寡聚果糖作為發(fā)酵底物。益生菌制備本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何制備挑選的益生微生物。它們既可以通過商業(yè)獲得，也可以通過發(fā)酵方法常規(guī)產(chǎn)生，并可任選地進(jìn)行干燥。技術(shù)人員了解，特定的菌株通常具有特定的優(yōu)選培養(yǎng)基或底物。微生物可以是干燥的形式，或例如是孢子的形式(對于形成孢子的微生物而言)。技術(shù)人員知道如何干燥發(fā)酵后產(chǎn)生的微生物。例如見WO0144440(INRA)或EP0818529(SOCIETEDESPRODUITSNESTLE)，其中描述了粉碎干燥方法。通常，從培養(yǎng)基濃縮細(xì)菌微生物并通過噴霧干燥法，流化床干燥法，凍干法(冷凍干燥)或其它適當(dāng)干燥方法進(jìn)行干燥。例如，在干燥前或干燥過程中將微生物與碳水化合物(如蔗糖、乳糖或麥芽糖糊精)、脂質(zhì)或蛋白質(zhì)(如奶粉)之類的載體材料混合。然而，微生物并非必須以干燥的形式存在。在發(fā)酵之后直接將它們與食物產(chǎn)品混合，然后任選地進(jìn)行干燥加工，也可能是合適的。這樣一種方法被描述于WO02065840(SOCIETEDESPRODUITSNESTLE)。同樣，在理論上可以在發(fā)酵后直接食用益生菌。進(jìn)一步的加工(例如為了制備方便的食物產(chǎn)品)并不是益生菌有益性質(zhì)的前提條件。許多適宜實(shí)施本發(fā)明的益生菌是商業(yè)可獲得的，可以以粉末的形式從各供應(yīng)商處獲得，例如，可以從Ch.Hansen獲得乳酸雙岐桿菌(DSM20215)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道多個不同的益生菌供應(yīng)商。一些供應(yīng)商以特定的包囊化形式提供益生菌，以便確保微生物在通過胃腸道的過程中或在產(chǎn)品的儲藏過程中或產(chǎn)品的儲存期有高的存活率。包含具有增加的貯存穩(wěn)定性而無過多損失的微生物的產(chǎn)品的例子描述于EP0180743和WO02065840(SOCIETEDESPRODUITSNESTLE)。根據(jù)本發(fā)明的益生菌可以以任何形式通過腸道途徑消費(fèi)。它們可以加入營養(yǎng)組合物，如食物產(chǎn)品中。另外，它們也可以直接消費(fèi)，例如以干燥的形式，或者在發(fā)酵產(chǎn)生生物質(zhì)之后直接消費(fèi)。例如，益生菌可以以發(fā)酵的奶制品，如冷藏的奶制品、酸乳酪或新鮮干酪的形式消費(fèi)。在后面這些例子中，也可以直接使用益生菌產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)品本身，因此益生菌至少具有雙重功能本發(fā)明上下文中的益生功能和對底物(如奶)發(fā)酵以產(chǎn)生酸乳酪的功能。如果將益生菌加入營養(yǎng)配方制品，技術(shù)人員知道實(shí)現(xiàn)此的可能方案。干的，例如噴霧干燥的細(xì)菌，如可通過描述于EP0818529的方法獲得的細(xì)菌可以以粉末的形式被直接加入營養(yǎng)配方制品或加入到任何其它任選干燥的食物產(chǎn)品。例如，可以在消費(fèi)前將粉末益生菌制品加入營養(yǎng)配方制品、早餐谷物、色拉、面包片。包含特定益生菌的營養(yǎng)配方制品目前是商業(yè)可獲得的。例如，由Nestle商品化的含有益生菌的斷奶后配方制品(follow-upformula)，例如特別適合嬰兒的“NAN2或NIDINA2-withBifidus”產(chǎn)品可以被用于本發(fā)明的目的，只要提供有效的量即可?？蛇x的是，可以將干的益生菌加入液體產(chǎn)品，例如飲料或飲品。如果旨在以活的狀態(tài)消費(fèi)細(xì)菌，在加入益生菌后，含有益生菌的液體產(chǎn)品應(yīng)該被相對迅速地消費(fèi)。然而，如果將細(xì)菌加入耐貯存產(chǎn)品，只要益生菌在飲料或飲品中是穩(wěn)定的，則沒有必要迅速的消費(fèi)。WO9810666公開了一種干燥食品組合物連同益生細(xì)菌培養(yǎng)物的方法。因此，可以將益生菌與例如汁、基于奶的產(chǎn)品或植物乳汁同時干燥，產(chǎn)生已經(jīng)含有益生菌的干燥產(chǎn)品?？梢栽谝院笫褂盟砸后w將這一產(chǎn)品復(fù)原。益生菌的量雖然并非強(qiáng)制性的，但是益生菌可以以活的狀態(tài)被消費(fèi)，以旨在使益生菌微生物完好地到達(dá)小腸和大腸，并可以在大腸建群。如果情況如此，通常要每日消費(fèi)足夠劑量的活細(xì)菌，以實(shí)現(xiàn)成功建群。技術(shù)人員了解每日劑量取決于微生物，但是通常介于每日106到1014cfu的范圍，優(yōu)選每日107到1013cfu。在本發(fā)明的上下文中，向約65kg體重的人施用的活益生菌的有效量優(yōu)選介于每日1010到1014，更優(yōu)選的介于1011到1013，最優(yōu)選的介于1-4×1012cfu。優(yōu)選的活益生菌量相當(dāng)于大約每日一瓶商業(yè)可獲得的、用益生菌株制備的、2dl酸乳酪。一個日份量的食品，或如果優(yōu)先幾個日份量，則所有這些分量一起將通常添加有以上指出的有效量益生菌。然而，使用死的益生菌、發(fā)酵的培養(yǎng)基或簡單地使用益生菌的底物(通常是益生素纖維)也能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的教導(dǎo)。因此，發(fā)酵的培養(yǎng)基(即使基本不含益生菌，但含有益生菌代謝物)可以被用來實(shí)施本發(fā)明。換句話說，可以將死的或活的益生菌、它們的培養(yǎng)基、底物或代謝物以與前面描述的針對活益生菌的相同或相似的方式直接加到食物產(chǎn)品中。發(fā)酵的培養(yǎng)基、底物或代謝物可以在發(fā)酵后通過如離心或過濾與細(xì)菌分離。然后可以濃縮、冷卻、冷凍、干燥(例如噴霧干燥)上清液或?yàn)V液，或直接通過腸道途徑施用給個體。如果干燥發(fā)酵后的培養(yǎng)基，可以將其制成粉末并如前文針對活益生菌所述的加入到任何食物產(chǎn)品中。如果向人施用上清液或發(fā)酵培養(yǎng)基，有效量為0.5到3dl，優(yōu)選1到2dl的30到50小時，優(yōu)選45到50小時細(xì)菌培養(yǎng)后收獲的生長培養(yǎng)基。當(dāng)在OD600nm估計(jì)細(xì)菌密度時，通常獲得2到7的OD，這分別表示生長到每毫升2到7×108個細(xì)菌。在通過如過濾除去細(xì)菌后可以施用上清液。上清液的有效量相當(dāng)于每天一瓶商業(yè)可獲得的、用挑選的益生菌制備的、1到2dl酸乳酪。對于動物(如寵物)，相應(yīng)的活細(xì)菌或上清液的有效量以體重的函數(shù)計(jì)算。也可以將含有益生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基勻漿，并與培養(yǎng)基一起進(jìn)一步加工通常被破壞的益生菌。如已經(jīng)指出的，益生菌底物(如促進(jìn)特定益生菌的膳食纖維)可以被用來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。這是間接實(shí)現(xiàn)本發(fā)明效果的一種方式。通過促進(jìn)腸道中特定益生菌株的生長，可以達(dá)到與這里所述相同的效果。給出以下實(shí)施例僅為舉例說明，不應(yīng)該將它們曲解為是對本發(fā)明主題的限制。以下實(shí)施例1和2旨在檢查補(bǔ)充益生菌是否可以預(yù)防或治療短暫的腸粘膜感染后形成的消化道異常和一般的消化道神經(jīng)肌肉異常。為了檢查這些問題，使用了以急性旋毛蟲感染事件后持續(xù)的神經(jīng)肌肉異常為特征的小鼠模型。由此發(fā)現(xiàn)益生細(xì)菌可以逆轉(zhuǎn)腸感染后的持續(xù)消化道神經(jīng)肌肉異常。這些結(jié)果首次表明益生細(xì)菌能夠干擾腸感染過程中的寄生蟲負(fù)荷。而且，即使是在寄生蟲感染已建立之后開始施用益生菌，也可以逆轉(zhuǎn)由這些感染引起的一些長期的胃腸道并發(fā)癥。這些效果被首次證實(shí)高度依賴于所使用的具體益生菌。實(shí)施例1預(yù)防小鼠感染旋毛蟲的益生菌材料和方法以下在″國立微生物保藏中心″(CNCM)保藏的菌株和商業(yè)可獲得的益生菌株被用于實(shí)驗(yàn)。嗜酸乳桿菌(johnsonii)(CNCMI-1225)副干酪乳桿菌(CNCM1-2116)長雙岐桿菌(CNCMI-2170)乳酸雙岐桿菌(德意志微生物保藏中心DSM20215)，購自ChristianHansenBioSystemsA/S(CHL)，10-12BogeAllé，P.OBox407，DK-2970Horsholm，丹麥。在旋毛蟲感染(375只幼蟲)前持續(xù)10天，每天用益生菌制品和兩種對照(培養(yǎng)基(MRS)或磷酸緩沖鹽水(PBS))對雌性NIH瑞士小鼠(每組n＝5)進(jìn)行管飼。貫穿整個實(shí)驗(yàn)連續(xù)施用益生菌。旋毛蟲感染后9天，對小鼠實(shí)施無痛死亡，計(jì)數(shù)蠕蟲的數(shù)量和測定髓過氧化物酶活力(MPO)。每日管飼量為每種細(xì)菌1×109細(xì)菌/100μl生長培養(yǎng)基/小鼠/天和100μl過濾的生長培養(yǎng)基/小鼠/天(在實(shí)驗(yàn)中僅用上清液)。結(jié)果在使用MRS或PBS進(jìn)行預(yù)防性處理的小鼠之間蠕蟲數(shù)量沒有差異，因此所有進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)使用MRS作為唯一對照組。發(fā)現(xiàn)用乳酸雙岐桿菌菌株預(yù)處理的小鼠比用MRS及PBS預(yù)處理的小鼠趨向于具有更低的蠕蟲數(shù)量。另一方面，嗜酸乳桿菌菌株表現(xiàn)出增加蠕蟲負(fù)荷(load)。剩下的菌株(就測試的時期和劑量而言)并沒有表現(xiàn)出對蠕蟲負(fù)荷有顯著影響?？傊?，發(fā)現(xiàn)當(dāng)預(yù)防性施用時，不同的益生菌菌株對于蠕蟲負(fù)荷具有不同的效果。特定的益生菌株(如乳酸雙岐桿菌菌株)能夠降低腸道寄生蟲(如線蟲)的感染負(fù)荷。實(shí)施例2在小鼠中治療旋毛蟲感染后遺癥的益生菌材料和方法在第二個實(shí)驗(yàn)中，小鼠首先被旋毛蟲(375只幼蟲)感染，并在感染后的10到21天，每日用上述5種益生菌或MRS進(jìn)行管飼，然后無痛處死小鼠，并取組織進(jìn)行體外收縮性實(shí)驗(yàn)。在此旋毛蟲模型中，盡管在感染后的第21天寄生蟲已被排出并且腸粘膜炎癥已經(jīng)消退，但神經(jīng)肌肉異常(過度收縮性)仍然持續(xù)。經(jīng)藥理學(xué)刺激(氨甲酰膽堿)或電刺激(EFS)置于肌肉浴槽中的腸組織之后，通過體外收縮性測量來評估神經(jīng)肌肉功能。使用的方法根據(jù)BarbaraG，VallanceBA，CollinsSMPersistentintestinalneuromusculardysfunctionafteracutenematodeinfectioninmice.Gastroenterology1997；1131224-1232。特殊是見章節(jié)“用于收縮性研究的組織制備”和“收縮的測量”。因此，從小鼠中取一小段腸，在37℃于充氧(95％O2/5％CO2)的Krebs溶液中處理。系住腸段的相對末端。組織的一端與等長力傳感器(isometricforcetransducer)(FT03C型；Grass，Quincy，MA)連接，另一端與浴槽的銜鐵(armature)連接。用Grass7E多道記錄儀記錄反應(yīng)。用EFS和氨甲酰膽堿(細(xì)節(jié)見上述參考文獻(xiàn))產(chǎn)生刺激。通過計(jì)算機(jī)分析刺激的收縮，由此測量了基礎(chǔ)張力、位相性收縮、緊張性收縮和緊接于收縮后的最大張力，并計(jì)算了曲線下面積。圖3形象化表示了基礎(chǔ)張力(1)、刺激后的張力(2)和緊張性收縮(3)以及基礎(chǔ)相位(4)和刺激后的位相性收縮(5)、位相性收縮(6)和曲線下面積(7)的概念。結(jié)果圖1顯示曲線下的面積，此面積考慮了刺激后收縮的時期和這一時期內(nèi)的收縮張力。在喂以上述提及的益生菌株的小鼠和對照小鼠之間可見明顯的差異(更小的曲線下面積)，證實(shí)在前面的情況下刺激后的收縮更短和/或張力更小。圖1中的符號具有以下意義◆對照、■嗜酸乳桿菌(johnsonii)、×長雙岐桿菌、*乳酸雙岐桿菌、▲副干酪乳桿菌。圖2表示描述于圖1的但是由電場刺激的肌肉組織的緊張性收縮(A)和位相性收縮(B)，并比較了喂以活的(L.p.)、死的(deadL.p.)副干酪乳桿菌(CNCMI-2116)益生菌株和僅喂以培養(yǎng)基上清液(Sn)的宿主生物。對照是MRS培養(yǎng)基?？梢?，在感染后的21天，與僅喂以MRS的小鼠相比，喂以益生菌來源的飼料(活的或死的細(xì)菌、上清液)的小鼠的消化道肌肉具有明顯降低的收縮張力。其數(shù)值接近于未感染小鼠的數(shù)值。結(jié)論這些結(jié)果導(dǎo)致結(jié)論益生菌能夠使感染后的腸肌肉過度收縮狀態(tài)正常化。換句話說，益生菌減少了胃腸道感染后持續(xù)的后遺癥。這些效果因菌株而不同，在本實(shí)驗(yàn)中使用益生菌株副干酪乳桿菌(CNCMI-2116)產(chǎn)生最實(shí)質(zhì)的效果，而選用于本實(shí)驗(yàn)的所有雙岐桿菌菌株也呈現(xiàn)出這些效果。實(shí)驗(yàn)的整體結(jié)論是特定的益生菌株(如副干酪乳桿菌(CNCMI-2116))能夠直接影響肌肉的收縮性。這一普遍性發(fā)現(xiàn)的結(jié)果是通過施用適當(dāng)?shù)囊嫔?，可以以一種一般性方式治愈、治療和/或預(yù)防在個體的生命中許多情況下發(fā)生的胃腸道神經(jīng)肌肉異常(消化道收縮)。異常的消化道收縮發(fā)生在遭受絞痛、消化道疼痛或消化道不適的嬰兒、幼兒、青少年和成年人中，例如描述于IBS中的那些。異常的消化道收縮可能導(dǎo)致人和寵物發(fā)生消化道套疊，它們可能導(dǎo)致消化道鼓脹及不規(guī)則和不適當(dāng)?shù)耐ㄟ^腸的轉(zhuǎn)運(yùn)時間?？梢宰鞒鼋Y(jié)論在這些情況下，通過施用益生菌能達(dá)到一般的緩解效果。權(quán)利要求1.挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物在制造預(yù)防或治療消化道疼痛或消化道不適的營養(yǎng)組合物或藥物中的用途。2.挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物在制造預(yù)防或治療消化道運(yùn)動機(jī)能障礙的營養(yǎng)組合物或藥物中的用途。3.挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物在制造預(yù)防或治療消化道神經(jīng)肌肉異常的營養(yǎng)組合物或藥物中的用途。4.挑選的益生菌或挑選的益生菌混合物在制造治療或減少消化道感染后的后遺癥的營養(yǎng)組合物或藥物中的用途。5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的用途，其中消化道疼痛或不適、運(yùn)動機(jī)能障礙或消化道神經(jīng)肌肉異常是由病原體感染消化道引起的。6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中挑選的益生菌是能夠在小鼠模型中通過顯著降低Th2釋放的細(xì)胞因子來影響病原體誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的益生菌。7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中益生菌是能夠在小鼠模型中通過顯著降低COX-2、TGF-β1或PGE2在縱行腸肌肌肉中的表達(dá)或濃度來影響病原體誘導(dǎo)的炎癥的益生菌。8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中挑選的益生菌是雙岐桿菌。9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的用途，其中挑選的益生菌是副干酪乳桿菌。10.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的用途，其中挑選的益生菌選自長雙岐桿菌(CNCMI-2170)、乳酸雙岐桿菌(德意志微生物保藏中心DSM20215)、副干酪乳桿菌(CNCMI-2116，CNCMI-1292)和它們的混合物。11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中益生菌包括死的益生細(xì)菌、發(fā)酵底物和/或益生菌來源物質(zhì)。全文摘要本發(fā)明涉及在營養(yǎng)組合物或藥物中使用益生菌來預(yù)防或治療消化道神經(jīng)肌肉異常。這類異常與例如嬰兒絞痛、一般的消化道疼痛或消化道不適等有關(guān)。本發(fā)明具體涉及治療或預(yù)防感染后的消化道神經(jīng)肌肉異常。益生菌可以以活的或死的狀態(tài)被施用，也可以直接使用發(fā)酵培養(yǎng)物的上清液來實(shí)現(xiàn)這里描述的有利效果。文檔編號C12N1/20GK1678329SQ03820003公開日2005年10月5日申請日期2003年7月23日優(yōu)先權(quán)日2002年7月23日發(fā)明者I·科爾蒂希杜拉,E·韋爾杜德貝爾?？?P·貝爾希克,S·M·柯林斯申請人:雀巢技術(shù)公司