專利名稱：用于生產(chǎn)具有改變的多不飽和脂肪酸的植物的核酸序列和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸分子和核酸構(gòu)建體，以及與脂肪酸合成相關(guān)的其他試劑，特別是飽和脂肪和不飽和脂肪的比例。另外，本發(fā)明涉及摻入了所述試劑的植物，其中，所述植物具有改變的飽和脂肪與不飽和脂肪的比例。具體地講，本發(fā)明涉及摻入了所述試劑的植物，其中，所述植物具有改變的單不飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸的比例。
背景植物油具有多種用途。需要從生物合成的或天然植物來源中獲得新型植物油組成以及獲得油組成的改進(jìn)的方法。根據(jù)希望的油用途，需要各種不同的脂肪酸組成。
高等植物似乎是通過共同的代謝途徑--脂肪酸合成酶(FAS)途徑合成脂肪酸。在發(fā)育中的種子中，脂肪酸連接在甘油主鏈上，形成三酰甘油酯，作為能量來源而儲存，以便進(jìn)一步萌發(fā)。FAS途徑位于質(zhì)體中。第一個關(guān)鍵步驟是通過乙酰-CoA:ACP轉(zhuǎn)酰酶(ATA)的催化由乙酰-CoA和ACP形成乙酰-ACP(?；d體蛋白)。乙酰-ACP延長成16-和18-碳脂肪酸，包括以下反應(yīng)順序的循環(huán)作用與來自丙二酰-ACP的二碳單位縮合，形成β-酮酰-ACP(β-酮酰-ACP合成酶)，酮-官能團(tuán)還原成醇(β-酮酰-ACP還原酶)，脫水形成烯酰-ACP(β-酮酰-ACP脫水酶)，以及最終還原烯酰-ACP，以便形成延長的飽和酰基-ACP(烯酰-ACP還原酶)。β-酮酰-ACP合成酶I能催化從C4:0延長到棕櫚酰-ACP(C16:0)，而β-酮酰-ACP合成酶II能催化最終延長至硬脂酰-ACP(C18:0)。常見的植物不飽和脂肪酸，如油酸，亞油酸和亞麻酸存在于儲存的三酰甘油酯中，它是在由可溶性質(zhì)體Δ-9去飽和酶(通常又被稱為“硬脂酰-ACP去飽和酶”)催化的反應(yīng)中通過硬脂酰-ACP的去飽和作用形成油酰-ACP(C18:1)形成的。分子氧是去飽和作用所必須的，其中，還原的鐵氧還蛋白起著電子共同供體的作用。其他去飽和作用是通過膜結(jié)合的Δ-12去飽和酶和Δ-15去飽和酶的順序作用實現(xiàn)的。因此，所述“去飽和酶”產(chǎn)生了多不飽和脂肪酸。
獲得能夠產(chǎn)生導(dǎo)致FAS的表型的核酸序列、將脂肪酸去飽和、和/或?qū)⒅舅釗饺敫视椭麈溕弦员惝a(chǎn)生油的過程遇到了各種障礙，包括，但不局限于感興趣的代謝因子的鑒定，具有有用的動力學(xué)特征的酶來源的選擇和表征，將感興趣的蛋白純化到可以對它進(jìn)行氨基酸測序的水平，利用氨基酸序列數(shù)據(jù)獲得能夠用作探針的核酸序列，以便回收需要的DNA序列，以及制備構(gòu)建體，并且轉(zhuǎn)化并且分析所得到的植物。
因此，需要用于改變脂肪酸組成的其他核酸目標(biāo)和方法。具體地講，需要生產(chǎn)多種不同的脂肪酸組成的構(gòu)建體和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了基本上純化的核酸分子，它包括與選自下組的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO4，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段。
本發(fā)明還提供了包括具有SEQ ID NO12的序列的核酸分子的至少15個連續(xù)的核苷酸的核酸分子；包括具有SEQ ID NO13的序列的核酸分子的至少15個連續(xù)的核苷酸的核酸分子；包括具有SEQ ID NO14的序列的核酸分子的至少15個連續(xù)的核苷酸的核酸分子；和包括具有SEQ ID NO4的序列的核酸分子的至少15個連續(xù)的核苷酸的核酸分子。
本發(fā)明還提供了重組核酸分子，它包括作為可操作地連接的成分的以下成分(a)啟動子，它能在植物細(xì)胞中發(fā)揮作用，以便導(dǎo)致mRNA分子的產(chǎn)生；和(b)能在高嚴(yán)格條件下與選自下組的核酸序列雜交的核酸序列SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO4，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段。
本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)化的大豆植物，它具有包括以下成分的核酸分子(a)可操作地與具有第一種核酸序列的第一種核酸分子連接的第一啟動子，所述第一種核酸序列與選自下組的核酸序列具有85％或更高的同一性SEQ ID NOs1-SEQ ID NO2，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段，和(b)具有第二種核酸序列的第二種核酸分子，所述第二種核酸序列與選自下組的核酸序列具有85％或更高的同一性SEQ ID NO4-SEQ ID NO14，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段，其中，所述第二種核酸分子可操作地與多順反子構(gòu)型的第一啟動子連接或與第二啟動子連接。
本發(fā)明還提供了包括雙鏈RNAi構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化的大豆植物，其中，第一啟動子可操作地與具有第一種核酸序列的第一種核酸分子連接，所述第一種核酸序列與選自下組的核酸序列具有85％或更高的同一性SEQ ID NOs1-SEQ ID NO2，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段，其中具有第二種核酸序列的第二種核酸分子可操作地與第一種核酸分子連接，所述第二種核酸序列與選自下組的核酸序列具有85％或更高的同一性SEQ ID NO4-SEQ ID NO14，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段。
本發(fā)明還提供了包括雙鏈RNAi構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化的大豆植物，其中，第一啟動子可操作地與具有第一種核酸序列的第一種核酸分子連接，所述第一種核酸序列與選自下組的核酸序列具有85％或更高的同一性SEQ ID NO1-SEQ ID NO2，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段，其中，具有第二種核酸序列的第二種核酸分子可操作地與dsRNAi構(gòu)型的第二啟動子連接，所述第二種核酸序列與選自下組的核酸序列具有85％或更高的同一性SEQ ID NO4-SEQ ID NO14，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段。
本發(fā)明還提供了具有兩種或兩種以上核酸分子的轉(zhuǎn)化的大豆植物，其中，每一種核酸分子可操作地與啟動子連接，并且，其中，每一種核酸分子具有這樣的核酸序列，它與選自下組的核酸序列具有85％或更高的同一性SEQ ID NOs1，2，4-14，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段。
本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化的大豆植物，其中，選擇性地降低了由選自下組的基因編碼的轉(zhuǎn)錄物的水平FAD2-1A，F(xiàn)AD2-1B，F(xiàn)AD2-2B，F(xiàn)AD3-1A，F(xiàn)AD3-1B，F(xiàn)AD3-1C，而保持由選自下組的不同基因編碼的轉(zhuǎn)錄物的水平至少部分不受影響FAD2-1A，F(xiàn)AD2-1B，F(xiàn)AD2-2B，F(xiàn)AD3-1A，F(xiàn)AD3-1B，F(xiàn)AD3-1C。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)具有降低的亞麻酸含量的種子的大豆植物的方法，包括用包括以下成分的核酸分子轉(zhuǎn)化大豆植物(a)可操作地與具有第一種核酸序列的第一種核酸分子連接的第一啟動子，所述第一種核酸序列與選自下組的核酸序列具有85％或更高的同一性SEQ IDNOs1，2，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段，和(b)具有第二種核酸序列的第二種核酸分子，所述第二種核酸序列與選自下組的核酸序列具有85％或更高的同一性SEQ ID NO4-SEQ ID NO14，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段，其中，所述第二種核酸分子可操作地與第一啟動子或第二啟動子連接；并且生長所述植物，其中，所述植物產(chǎn)生的種子的亞麻酸比具有類似的遺傳背景但缺少所述核酸分子的植物少。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)具有提高的油酸含量的種子的大豆植物的方法，包括用包括以下成分的核酸分子轉(zhuǎn)化大豆植物(a)可操作地與具有第一種核酸序列的第一種核酸分子連接的第一啟動子，所述第一種核酸序列與選自下組的核酸序列具有85％或更高的同一性SEQ ID NOs1，2，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段，和(b)具有第二種核酸序列的第二種核酸分子，所述第二種核酸序列與選自下組的核酸序列具有85％或更高的同一性SEQ ID NO4-SEQ ID NO14，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段，其中，所述第二種核酸分子可操作地與第一啟動子或第二啟動子連接；并且生長所述植物，其中，所述植物產(chǎn)生的種子的油酸比具有類似的遺傳背景但缺少所述核酸分子的植物多。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)具有改變的油組成的種子的植物的方法，包括用包括作為可選擇地連接的部分的以下成分的核酸分子轉(zhuǎn)化植物第一啟動子和具有第一種核酸序列的第一種核酸分子，所述第一種核酸序列與選自下組的核酸序列具有85％或更高的同一性SEQ ID NOs1，2，4-14，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段；并且生長所述植物，其中，所述植物產(chǎn)生的種子與具有類似的遺傳背景但缺少所述核酸分子的植物相比具有改變的油組成。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)具有改變的單不飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸比例的種子的植物的方法，包括用包括作為可選擇地連接的部分的以下成分的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物兩種或兩種以上核酸分子，每一種都具有與選自下組的核酸序列具有85％或更高的同一性的核酸序列SEQ IDNOs1，2，4-14，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段，其中，每一種核酸分子可操作地與啟動子連接；并且生長所述植物，其中，所述植物產(chǎn)生的種子與具有類似的遺傳背景但缺少所述兩種或兩種以上核酸分子的植物相比具有改變的單不飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸比例。
附圖簡述

圖1是構(gòu)建體pCGN5468的示意圖。
圖2是構(gòu)建體pCGN5469的示意圖。
圖3是構(gòu)建體pCGN5471的示意圖。
圖4是構(gòu)建體pCGN5485的示意圖。
圖5是構(gòu)建體pCGN5486的示意圖。
圖6是構(gòu)建體pCGN5462的示意圖。
圖7是構(gòu)建體pCGN5466的示意圖。
圖8是構(gòu)建體pCGN5464的示意圖。
圖9是構(gòu)建體pCGN5473的示意圖。
圖10是構(gòu)建體pMON68521的示意圖。
圖11是構(gòu)建體pMON68519的示意圖。
圖12是構(gòu)建體pCGN5455的示意圖。
圖13是構(gòu)建體pCGN5459的示意圖。
發(fā)明詳述核酸序列的說明SEQ ID NO1表示FAD2-1A內(nèi)含子1的核酸序列。
SEQ ID NO2表示FAD2-1B內(nèi)含子1的核酸序列。
SEQ ID NO3表示部分FAD2-2基因組克隆的核酸序列。
SEQ ID NO4表示FAD2-2B內(nèi)含子1的核酸序列。
SEQ ID NO5表示FAD3-1A內(nèi)含子1的核酸序列。
SEQ ID NO6表示FAD3-1A內(nèi)含子2的核酸序列。
SEQ ID NO7表示FAD3-1A內(nèi)含子3A的核酸序列。
SEQ ID NO8表示FAD3-1A內(nèi)含子4的核酸序列。
SEQ ID NO9表示FAD3-1A內(nèi)含子5的核酸序列。
SEQ ID NO10表示FAD3-1A內(nèi)含子3B的核酸序列。
SEQ ID NO11表示FAD3-1A內(nèi)含子3C的核酸序列。
SEQ ID NO12表示FAD3-1B內(nèi)含子3C的核酸序列。
SEQ ID NO13表示FAD3-1B內(nèi)含子4的核酸序列。
SEQ ID NO14表示FAD3-1C內(nèi)含子4的核酸序列。
SEQ ID NO15表示FAD2-1A基因序列的cDNA序列。
SEQ ID NOs16和17表示FAD2-1A PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO18表示部分FAD2-1A基因組克隆的核酸序列。
SEQ ID NO19表示部分FAD2-1B基因組克隆核酸序列。
SEQ ID NOs20和21表示FAD3-1A PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO22表示FAD2-1B啟動子的核酸序列。
SEQ ID NO23表示部分FAD3-1A基因組克隆的核酸序列。
SEQ ID NOs24-39表示PCR引物的核酸序列。
定義在本文中，術(shù)語“基因”被用于表示核酸序列，它包括5’非翻譯區(qū)，包括與所述基因產(chǎn)物的表達(dá)相關(guān)的啟動子區(qū)，與所述基因產(chǎn)物表達(dá)相關(guān)的任何內(nèi)含子和外顯子區(qū)以及5’或3’非翻譯區(qū)。
在本文中，“FAD2”，“Δ12去飽和酶”或“ω-6去飽和酶”基因是編碼一種酶的基因，這種酶能夠催化將雙鍵插入脂肪酰基部分的從羧基末端開始計算的第十二號位置。
本文在提到蛋白和核酸時，普通大寫字母的使用，例如，“FAD2”表示酶，蛋白，多肽，或肽，而斜體大寫字母的使用，例如，“FAD2”表示核酸，包括，但不局限于基因，cDNAs，和mRNAs。
在本文中，術(shù)語“FAD2-1”被用于表示在種子組織中以特異性方式天然表達(dá)的FAD2基因。
在本文中，術(shù)語“FAD2-2”被用于表示這樣的FAD2基因(a)它是與FAD2-1基因不同的基因，和(b)它是在包括種子在內(nèi)的多種組織中天然表達(dá)的。
在本文中，“FAD3”，“Δ15去飽和酶”或“ω-3去飽和酶”基因是編碼一種酶的基因，這種酶能夠催化將雙鍵插入脂肪?；糠值膹聂然┒碎_始計算的第十五號位置。
在本文中，術(shù)語“FAD3-1”被用于表示FAD3基因，它能在包括種子在內(nèi)的多種組織中天然表達(dá)。
在本文中，基因名詞后面的大寫字母(A，B，C)被用于表示家族的成員，即FAD2-1A是與FAD2-1B不同的基因家族成員。
在本文中，“中等油大豆種子”是種子的油組成中具有50％-75％的油酸的種子。
在本文中，“高油大豆種子”是種子的油組成中具有超過75％的油酸的種子。
術(shù)語“非編碼”表示不編碼被表達(dá)的蛋白的部分或全部的核酸分子序列。非編碼序列包括，但不局限于內(nèi)含子，啟動子區(qū)，3’非翻譯區(qū)，和5’非翻譯區(qū)。
在本文中，術(shù)語“內(nèi)含子”表示該術(shù)語的通常含義，它表示一段核酸分子，通常是DNA，它不編碼被表達(dá)蛋白的部分或全部，并且，在內(nèi)源條件下，被轉(zhuǎn)錄成RNA分子，不過，它在所述RNA被翻譯成蛋白之前被從內(nèi)源RNA中剪接掉。
在本文中，術(shù)語“外顯子”表示該術(shù)語的正常含義，它表示一段核酸分子，通常是DNA，它編碼表達(dá)的蛋白的一部分或全部。
在本文中，“可操作地連接”于一個或多個核酸序列的啟動子能夠驅(qū)動一個或多個核酸序列的表達(dá)，包括以多順反子構(gòu)型排列的多個編碼或非編碼核酸序列。
“多順反子基因”或“多順反子mRNA”是任何基因或mRNA，它包括轉(zhuǎn)錄的核酸序列，該序列相當(dāng)于一個以上要定向表達(dá)的基因的核酸序列的。應(yīng)當(dāng)理解的是，所述多順反子基因或mRNAs可以包括相當(dāng)于內(nèi)含子，5’UTRs，3’UTRs的序列，或它們的組合，并且重組多順反子基因或mRNA可以，例如，但不局限于，包括相當(dāng)于來自一個基因的一個或多個UTRs和來自第二個基因的一個或多個內(nèi)含子的序列。
在本文中，術(shù)語核酸序列的互補(bǔ)序列表示沿所述序列整個長度的互補(bǔ)序列。
在本文中，所提出的任何范圍都包括該范圍的終點，除非另有說明。
試劑本發(fā)明的試劑優(yōu)選是在任意一種結(jié)構(gòu)特征方面是“生活學(xué)活性的”，如核酸分子與另一種核酸分子雜交的能力方面，或蛋白被抗體結(jié)合的能力(或與另一種分子競爭這種結(jié)合)。另外，所述特征可能是催化性的，因此，包括所述試劑介導(dǎo)化學(xué)反應(yīng)或應(yīng)答的能力。所述試劑優(yōu)選是“基本上純化的”。在本文中，術(shù)語“基本上純化的”表示基本上與在它的天然環(huán)境條件下與它正常相關(guān)的所有其他分子分離的分子。更優(yōu)選，基本上純化的分子是制劑中主要類型的分子?；旧霞兓姆肿涌赡苁浅^60％不含，超過75％不含，優(yōu)選超過90％不含，更優(yōu)選超過95％不含存在于天然混合物中的其他分子(溶劑除外)。術(shù)語“基本上純化的”并不是要包括存在于它們的天然環(huán)境條件下的分子。
本發(fā)明的試劑還可以是重組體。在本文中，術(shù)語“重組體”表示任何試劑(例如，包括，但不局限于DNA，肽)，它是對核酸分子進(jìn)行人工操作的結(jié)果，或間接產(chǎn)生的結(jié)果。
應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的試劑可以用有利于檢測所述試劑的試劑標(biāo)記(例如，熒光標(biāo)記，Prober等，Science 238336-340(1987)；Albare11a等，EP 144914；化學(xué)標(biāo)記，Sheldon等，美國專利4,582,789；Albarella等，美國專利4,563,417；修飾過的標(biāo)記，Miyoshi等，EP 119448)。
核酸分子本發(fā)明的試劑包括核酸分子，在本發(fā)明的一個方面，所述核酸分子包括核酸序列，在所述核酸序列被導(dǎo)入細(xì)胞或生物體之后，能夠選擇性地降低由FAD2或FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，而保持由第二種FAD2或FAD3編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，所述核酸分子包括核酸序列，在所述核酸序列被導(dǎo)入細(xì)胞或生物體之后，能夠選擇性地降低由FAD2或FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，而保持由第二種FAD2或FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平基本上不受影響。在本發(fā)明的一個高度優(yōu)選的方面，所述核酸分子包括核酸序列，在所述核酸序列被導(dǎo)入細(xì)胞或生物體之后，能夠選擇性地降低由FAD2或FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，而保持由第二種FAD2或FAD3編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平實質(zhì)上不受影響。
在一個優(yōu)選方面，核酸分子選擇性地降低一個基因相對于另一個基因的水平的能力，是通過比較mRNA轉(zhuǎn)錄物的水平進(jìn)行的。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面，本發(fā)明的核酸分子包括選自下組的核酸序列SEQID NOs1-15，18，19，22，23，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面，本發(fā)明的核酸分子包括選自下組的核酸序列SEQ ID NOs16，17，20，21，24-39，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段。
在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的核酸被稱為導(dǎo)入的核酸分子。如果核酸分子在通過人工操作，無論是如何間接操作插入細(xì)胞或生物體，該核酸分子就被稱為“導(dǎo)入的”。導(dǎo)入的核酸分子的例子包括，但不局限于，通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，注射，和投射導(dǎo)入細(xì)胞的核酸，以及通過包括，但不局限于接合，胞吞作用，和吞噬作用導(dǎo)入生物體的核酸。所述細(xì)胞或生物體可以是，或可以來自植物，植物細(xì)胞，藻類細(xì)胞，藻類，真菌細(xì)胞，真菌，或細(xì)菌細(xì)胞。
在本文中，“實質(zhì)上不受影響”表示諸如蛋白或mRNA轉(zhuǎn)錄物的試劑的水平?jīng)]有因為特定的事件而改變，或所改變的程度不會影響所述試劑的生理學(xué)功能。在一個優(yōu)選方面，所述實質(zhì)上不受影響的試劑的水平為缺少能選擇性地降低另一種試劑的核酸分子的細(xì)胞或生物體中的水平的20％以內(nèi)，更優(yōu)選10％以內(nèi)，更優(yōu)選5％以內(nèi)。
在本文中，“基本上不受影響”表示諸如蛋白或mRNA轉(zhuǎn)錄物的試劑的水平，其中，所述試劑的基本上不受影響的水平為缺少能夠選擇性地降低另一種試劑的水平的核酸分子的細(xì)胞或生物體中的水平的49％以內(nèi)，更優(yōu)選35％以內(nèi)，更優(yōu)選24％以內(nèi)。
在本文中，“部分不受影響”表示諸如蛋白或mRNA轉(zhuǎn)錄物的試劑的水平，其中，所述試劑的部分不受影響的水平是在缺少能夠選擇性地降低另一種試劑的水平的核酸分子的細(xì)胞或生物體中的水平的80％以內(nèi)，更優(yōu)選65％以內(nèi)，甚至更優(yōu)選50％以內(nèi)。
在本文中，諸如蛋白或mRNA的試劑的“選擇性降低”是相對缺少能夠選擇性地降低所述試劑水平的核酸分子的細(xì)胞或生物體而言的。在一個優(yōu)選方面，所述試劑的水平選擇性地降低了至少50％，優(yōu)選超過75％，更優(yōu)選至少超過90％或95％。
在對試劑的水平進(jìn)行比較時，這種比較優(yōu)選是在具有類似遺傳背景的生物體之間進(jìn)行。在一個優(yōu)選方面，類似的遺傳背景是這樣的遺傳背景，其中，被比較的生物體的核遺傳物質(zhì)具有50％或以上是相同的。在一個更優(yōu)選的方面，類似的遺傳背景是這樣的遺傳背景，其中，被比較的生物體的核遺傳物質(zhì)75％或以上，甚至更優(yōu)選90％或以上是相同的。在另一個甚至更優(yōu)選的方面，類似的遺傳背景是這樣的遺傳背景，其中，被比較的生物體是植物，并且所述植物是同基因的，利用植物轉(zhuǎn)化技術(shù)原始導(dǎo)入的任何遺傳物質(zhì)除外。
在本發(fā)明的實施方案中，一種核酸分子在導(dǎo)入細(xì)胞或生物體之后，能選擇性地降低由FAD2基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，同時保持由第二個FAD2基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響，基本上不受影響，或?qū)嵸|(zhì)上不受影響。在一個優(yōu)選方面，核酸分子選擇性地降低選擇一個基因相對另一個基因的水平的能力是通過比較mRNA轉(zhuǎn)錄物的水平進(jìn)行的。在本文中，mRNA轉(zhuǎn)錄物包括加工過的和未加工過的mRNA轉(zhuǎn)錄物。
在另一種實施方案中，一種核酸分子在導(dǎo)入細(xì)胞或生物體之后，能選擇性地降低由FAD2-1基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，而保持由FAD2-2基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響，基本上不受影響，或?qū)嵸|(zhì)上不受影響。在一種不同的實施方案中，一種核酸分子在導(dǎo)入細(xì)胞或生物體之后，能選擇性地降低由FAD2-2基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，而保持由FAD2-1基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響，基本上不受影響，或?qū)嵸|(zhì)上不受影響。
在另一種實施方案中，一種核酸分子在導(dǎo)入細(xì)胞或生物體之后能選擇性地降低由FAD2基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，而保持由FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響，基本上不受影響，或?qū)嵸|(zhì)上不受影響。在優(yōu)選實施方案中，一種核酸分子在導(dǎo)入細(xì)胞或生物體之后，能選擇性地降低由FAD2-1基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，而保持由FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響，基本上不受影響，或?qū)嵸|(zhì)上不受影響。
在一種不同的實施方案中，一種核酸分子在導(dǎo)入細(xì)胞或生物體之后，能選擇性地降低由FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，而保持由另一個FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響，基本上不受影響，或?qū)嵸|(zhì)上不受影響。
在另一種實施方案中，一種核酸分子在導(dǎo)入細(xì)胞或生物體之后，能選擇性地降低由FAD3-1C基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，而保持由FAD3-1B基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響，基本上不受影響，或?qū)嵸|(zhì)上不受影響。在另一種實施方案中，一種核酸分子在導(dǎo)入細(xì)胞或生物體之后，能選擇性地降低由FAD3-1C基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，而保持由FAD3-1A基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響，基本上不受影響，或?qū)嵸|(zhì)上不受影響。
在一種不同的實施方案中，一種核酸分子在導(dǎo)入細(xì)胞或生物體之后，能選擇性地降低由FAD3-1B基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，而保持由FAD3-1C基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響，基本上不受影響，或?qū)嵸|(zhì)上不受影響。在一種不同的實施方案中，一種核酸分子在導(dǎo)入細(xì)胞或生物體之后，能選擇性地降低由FAD3-1B基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，而保持由FAD3-1A基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響，基本上不受影響，或?qū)嵸|(zhì)上不受影響。
在另一種實施方案中，一種核酸分子在導(dǎo)入細(xì)胞或生物體之后，能選擇性地降低由FAD3-1A基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，而保持由FAD3-1B基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響，基本上不受影響，或?qū)嵸|(zhì)上不受影響。在另一種實施方案中，一種核酸分子在導(dǎo)入細(xì)胞或生物體之后，能選擇性地降低由FAD3-1A基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，而保持由FAD3-1C基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響，基本上不受影響，或?qū)嵸|(zhì)上不受影響。
本發(fā)明的其他優(yōu)選的實施方案是在整個長度上與本發(fā)明的核酸分子的同一性至少為50％，60％，或70％的核酸分子，以及與所述核酸分子互補(bǔ)的核酸分子。更優(yōu)選的是包括這樣一個區(qū)域的核酸分子，該區(qū)域在它的整個長度上與本發(fā)明的核酸分子的同一性為至少80％或85％，以及與所述核酸分子互補(bǔ)的核酸分子。就此而言，在整個長度上至少90％同一的核酸分子是特別優(yōu)選的，至少95％同一的核酸分子是尤其優(yōu)選的。另外，具有至少97％同一性的核酸分子是高度優(yōu)選的，而具有至少98％和99％同一性的核酸分子是特別高度優(yōu)選的，具有至少99％同一性的核酸分子是最高度優(yōu)選的。
本發(fā)明還提供了包括可以通過以下方法獲得的核酸分子序列的核酸分子在嚴(yán)格雜交條件下，用具有所述核酸分子序列或它的片段的探針篩選含有序列表中所示出的核酸分子序列的完整基因的合適文庫；并且分離所述核酸分子序列。例如，可用于獲得所述核酸分子的片段包括本文所披露的探針和引物。
可以將本發(fā)明的核酸分子用作RNA，cDNA，或基因組DNA的雜交探針，用于分離全長cDNAs或基因組克隆，以及分離與序列表中所示出的核酸分子的序列具有高度序列相似性的其他基因的cDNA或基因組克隆。
本發(fā)明的核酸分子可以通過利用本文所披露的核酸分子或它們的片段篩選從植物物種或其他合適的生物體中獲得的cDNA或基因組文庫方便地獲得。所述方法與用于制備所述文庫的方法一樣為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。在一種實施方案中，所述序列是通過以下方法獲得的將本發(fā)明的核酸分子與基因文庫的成員一起溫育，并且回收能與所述核酸分子雜交的克隆。在第二種實施方案中，可以利用染色體步移或反向PCR的方法獲得所述序列。在第三種實施方案中，可以將本發(fā)明的核酸分子的序列用于篩選文庫或數(shù)據(jù)庫，使用本領(lǐng)域所公知的生物信息技術(shù)。例如，參見Bioinformatics，Baxevanis & Ouellette，eds.，Wiley-Interscience(1998)。
可以將多種方法中的任意一種用于獲得一種或多種本發(fā)明的核酸分子?？梢詫⒆詣踊怂岷铣蓛x用于這一目的，并且制備具有同樣存在于細(xì)胞或生物體中的序列的核酸分子。作為所述合成方法的替代，可以將所披露的核酸分子用于確定一對引物，可以將所述引物用于聚合酶鏈反應(yīng)，以便擴(kuò)增并且獲得任何需要的核酸分子或片段。
正如本領(lǐng)域所充分了解的，“同一性”是兩種或兩種以上多肽序列或兩種或兩種以上核酸分子序列之間的關(guān)系，正如通過比較所述序列所確定的。在本領(lǐng)域中，“同一性”還表示多肽或核酸分子序列之間的序列相關(guān)程度，它是通過所述序列串之間的匹配確定的?！巴恍浴笨梢酝ㄟ^已知方法方便地計算，這些方法包括，但不局限于披露于以下文獻(xiàn)中的方法Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York (1988)；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，AcademicPress，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press(1987)；Sequence AnalysisPrimer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，Stockton Press，New York(1991)；and Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.AppliedMath，481073(1988)。確定同一性的方法被設(shè)計成能夠提供測試序列之間的最大程度的匹配。另外，確定同一性的方法被編輯成公開提供的程序。可用于確定兩種序列之間的同一性的計算機(jī)程序包括，但不局限于GCG(Devereux，J.，等，Nucleic Acids Research 12(1)387(1984)；包括五種BLASTX程序的軟件包，三種被設(shè)計用于核苷酸序列查詢(BLASTN，BLASTX，和TBLASTX)，兩種被設(shè)計用于蛋白序列查詢(BLASTP和TBLASTN)(Coulson，Trends in Biotechnology，1276-80(1994)；Birren等，Genome Analysis，1543-559(1997))。BLASTX程序可以從NCBI和其他來源公開獲得(BLAST Manual，Altschul，S.，等，NCBI NLM NIH，Bethesda，MD 20894；Altschul，S.，等，J.Mol.Biol.，215403-410(1990))。還可將眾所周知的Smith Waterman算法用于確定同一性。
用于多肽序列比較的參數(shù)通常包括以下參數(shù)算法Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48443-453(1970)比較矩陣BLOSSUM62，來自Hentikoff和Hentikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910915-10919(1992)空位罰分12空位長度罰分4一種可以使用上述參數(shù)的程序是可以從Genetics ComputerGroup，Madison，Wisconsin公開獲得的“空位”程序。末端空位的上述參數(shù)以及無罰分是用于肽比較的默認(rèn)參數(shù)。
用于核酸分子序列比較的參數(shù)包括以下參數(shù)算法Needleman和Wunsch，J.Mol.Bio.，48443-453(1970)比較矩陣匹配-+10；錯配＝0空位罰分50空位長度罰分3在本文中，“％同一性”是利用上述參數(shù)作為核酸分子序列比較的默認(rèn)參數(shù)和來自GCG的“空位”程序10.2版確定的。
本發(fā)明還涉及能與本發(fā)明的核酸分子雜交的核酸分子。具體地講，本發(fā)明涉及能在嚴(yán)格條件下與上述核酸分子雜交的核酸分子。在本文中，術(shù)語“嚴(yán)格條件”和“嚴(yán)格雜交條件”表示雜交通常是在序列之間存在至少95％，優(yōu)選至少97％的同一性時發(fā)生的。嚴(yán)格雜交條件的一種例子是在42℃下，在包括50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸三鈉(pH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖，和20微克/毫升變性的，剪切過的鮭魚精子DNA的溶液中過夜溫育，然后在大約65℃下，在0.1×SSC中洗滌所述雜交支持物。其他雜交和洗滌條件是眾所周知的，并且披露于以下文獻(xiàn)中Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor，NY(1989)，特別是第11章。
在核酸序列的表達(dá)能夠選擇性地降低植物中由FAD2-1基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，和由至少一種FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，而保持由FAD2-2基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分、基本上或?qū)嵸|(zhì)上不受影響的實施方案中，優(yōu)選的FAD2-1核酸序列選自下組(1)在核酸分子的整個長度上與選自下組的核苷酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO2和它們的片段，其中，所述核酸序列在嚴(yán)格條件下不能與具有SEQ ID NO4的核苷酸序列的核酸分子雜交；(2)包括同樣存在于大豆FAD2-1基因內(nèi)含子中的序列的核酸分子；和(3)在核酸分子的整個長度上與(2)的核酸分子具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸分子。
在核酸序列的表達(dá)能夠選擇性地降低植物中由FAD2-2基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，和由至少一種FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平，而保持由FAD2-1基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分、基本上或?qū)嵸|(zhì)上不受影響的實施方案中，優(yōu)選的FAD2-2核酸序列選自下組(1)在核酸分子的整個長度上與SEQ ID NO4和它的片段的核苷酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸序列，其中，所述核酸序列在嚴(yán)格條件下不能與具有選自下組的核苷酸序列的核酸分子雜交SEQ ID NO1和SEQ ID NO2；(2)包括同樣存在于大豆FAD2-2基因內(nèi)含子中的序列的核酸分子；和(3)在核酸分子的整個長度上與(2)的核酸分子具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸分子。
在核酸序列表達(dá)時能夠選擇性地減少FAD3基因的實施方案中，優(yōu)選的FAD3核酸序列選自下組(1)在核酸分子的整個長度上與選自下組的核苷酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸序列SEQ ID NOs5-14，和它們的片段，其中，所述核酸序列在嚴(yán)格條件下不能與具有選自下組的核苷酸序列的核酸分子雜交SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，和SEQ ID NO4；(2)包括同樣存在于大豆FAD3基因內(nèi)含子中的序列的核酸分子；和(3)在核酸分子的整個長度上與(2)的核酸分子具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸分子。
本發(fā)明的核酸分子的一種亞型包括片段核酸分子。片段核酸分子可以由本發(fā)明的核酸分子的主要部分，或?qū)嶋H上是它的大部分組成，正如所專門披露的。另外，所述片段可以包括更小的寡核苷酸(具有大約15-大約400個連續(xù)的核苷酸殘基，更優(yōu)選，大約15-大約30個連續(xù)的核苷酸殘基，或大約50-大約100個連續(xù)的核苷酸殘基，或大約100-大約200個連續(xù)的核苷酸殘基，或大約200-大約400個連續(xù)的核苷酸殘基，或大約275-大約350個連續(xù)的核苷酸殘基)。
在另一方面，片段核酸分子具有這樣的核酸序列，它是本發(fā)明核酸分子的至少15，25，50，或100個連續(xù)的核苷酸。在優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子的核酸序列是具有選自下組的核酸序列的核酸分子的至少15，25，50，或100個連續(xù)的核苷酸SEQ ID NO1-SEQ ID NO14和它們的互補(bǔ)序列。
一種或多種本發(fā)明的核酸分子的片段可以是探針，并且特別是PCR探針。PCR探針是能夠啟動聚合酶活性，同時，與另一個核酸分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸分子。本領(lǐng)域存在各種用于確定PCR探針結(jié)構(gòu)的方法和PCR技術(shù)。計算機(jī)進(jìn)行的檢索使用以下程序(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer 3.cgi)，STSPipeline(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www-STS_Pipeline)，或GeneUp(Pesole等，BioTechniques 25112-123(1998))，例如，可用于鑒定可能的PCR引物。
本發(fā)明的核酸分子或它們的片段在某些場合下能夠特異性地與其他核酸分子雜交。本發(fā)明的核酸分子包括能特異性地與具有選自下組的核酸序列的核酸分子雜交的核酸分子SEQ ID NO1-SEQ ID NO14，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段。
在本文中，如果兩種核酸分子能夠形成反向平行的，雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就將這兩種核酸分子說成是能夠彼此特異性雜交。
本發(fā)明的核酸分子還可以編碼同源物核酸分子。在本文中，同源物核酸分子或它的片段是第二個物種中的對應(yīng)的核酸分子或它的片段(例如，玉米FAD2-1內(nèi)含子核酸分子是擬南芥FAD2-1內(nèi)含子核酸分子的同源物)。同源物還可以通過分子進(jìn)化或DNA混排技術(shù)制備，以便所述分子保留了原始多肽的至少一種功能或結(jié)構(gòu)特征(例如，參見美國專利5,811,238)。
在另一種實施方案中，所述同源物是從選自下組的植物中獲得的苜蓿，擬南芥，大麥，蕓薹，油菜，花椰菜，甘藍(lán)，canola，柑桔，棉花，大蒜，燕麥?zhǔn)[屬，亞麻，觀賞植物，加州希蒙得木，玉米，花生，胡椒，馬鈴薯，油菜籽，水稻，黑麥，高粱，草莓，甘蔗，甜菜，番茄，小麥，白楊，松樹，冷杉，桉樹，蘋果樹萵苣，小扁豆，葡萄，香蕉，茶，草坪草，向日葵，菜豆屬，海甘藍(lán)，芥菜，蓖麻，芝麻，棉籽，亞麻籽，紅花，和油棕。更具體地講，優(yōu)選的同源物是從選自下組的植物中獲得的canola，玉米，蕓薹，油菜，大豆，海甘藍(lán)，芥菜，蓖麻，花生，芝麻，棉籽，亞麻籽，油菜籽，紅花，油棕，亞麻，和向日葵。在一種更優(yōu)選的實施方案中，所述同源物是從選自下組的植物中獲得的canola，油菜籽，玉米，蕓薹，油菜，大豆，向日葵，紅花，油棕，和花生。
植物構(gòu)建體和植物轉(zhuǎn)化體可以將一種或多種本發(fā)明的核酸分子用于植物轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染?？梢詫⑼庠催z傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且讓所述植物細(xì)胞再生成完整的可育或不育的植物或植物部分。外源遺傳物質(zhì)是任何遺傳物質(zhì)，它可以是天然存在的或從能夠插入任何生物體中的任何來源獲得的。
植物可以具有一個以上FAD2或FAD3基因的家族(即，編碼具有特殊活性的酶的基因，這些基因存在于所述植物基因組內(nèi)的不同位點上)。在本文中，“FAD2基因家族成員”是存在于所述植物的遺傳物質(zhì)中的任何FAD2基因。在本文中，“FAD3基因家族成員”是存在于所述植物的遺傳物質(zhì)中的任何FAD3基因。在一種實施方案中，還可以根據(jù)所述核酸序列的相似性對所述基因家族成員進(jìn)行額外的分類。在本實施方案的一個優(yōu)選方面，基因家族成員在所述基因的編碼序列部分具有至少60％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％的核酸序列同一性。
在本發(fā)明的一方面，植物包括雙鏈RNAi構(gòu)建體，其中，第一啟動子可操作地與具有第一種核酸序列的第一種核酸分子連接，所述第一種核酸序列與選自下組的核酸序列具有至少大約85％的同一性SEQ IDNO1-SEQ ID NO2，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段，具有第二種核酸序列的第二種核酸分子可操作地與所述第一種核酸分子連接，所述二種核酸序列與選自下組的核酸序列具有至少大約85％的同一性SEQ ID NO4-SEQ ID NO14，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段。
本發(fā)明還提供了包括雙鏈RNAi構(gòu)建體的植物，其中，第一啟動子可操作地與具有第一種核酸序列的第一種核酸分子連接，所述第一種核酸序列與選自下組的核酸序列具有至少大約85％的同一性SEQ IDNO1-SEQ ID NO2，它們的互補(bǔ)序列，，和任意一個的片段，其中具有第二種核酸序列的第二種核酸分子可操作地與dsRNAi構(gòu)型的第二啟動子連接，所述二種核酸序列與選自下組的核酸序列具有至少大約85％的同一性SEQ ID NO4-SEQ ID NO14，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段。
在本發(fā)明的一種實施方案中，選擇性地降低了所述基因的一個家族成員的蛋白或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持第二個家族成員的蛋白或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，選擇性地降低了所述基因的一個家族成員的蛋白或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持第二個家族成員的蛋白或轉(zhuǎn)錄物的水平基本上不受影響。在本發(fā)明的高度優(yōu)選的實施方案中，選擇性地降低了所述基因的一個家族成員的蛋白或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持第二個家族成員的蛋白或轉(zhuǎn)錄物的水平實質(zhì)性不受影響。
在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的植物包括核酸序列，在所述序列表達(dá)時能夠選擇性地降低所述植物中由某些FAD2和FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持至少一個其他FAD2或FAD3基因的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的植物包括核酸序列，在所述序列表達(dá)時能夠選擇性地降低所述植物中由某些FAD2和FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持至少一個其他FAD2或FAD3基因的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平基本上不受影響。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的植物包括核酸序列，在所述序列表達(dá)時能夠選擇性地降低所述植物中由某些FAD2和FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持至少一個其他FAD2或FAD3基因的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平實質(zhì)上不受影響。
在更特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的大豆植物包括核酸序列，在其表達(dá)時能夠選擇性地降低所述植物中由FAD2-1基因和至少一個FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持FAD2-2基因的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響。在更特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的大豆植物包括核酸序列，在其表達(dá)時能夠選擇性地降低所述植物中由FAD2-1基因和至少一個FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持FAD2-2基因的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平基本上不受影響。在更特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的大豆植物包括核酸序列，在其表達(dá)時能夠選擇性地降低所述植物中由FAD2-1基因和至少一個FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持FAD2-2基因的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平實質(zhì)上不受影響。
在另一種更特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的大豆植物包括核酸序列，在其表達(dá)時能夠選擇性地降低所述植物中由FAD2-1基因和至少兩個，三個或三個以上FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持FAD2-2基因的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響。在另一種更特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的大豆植物包括核酸序列，在其表達(dá)時能夠選擇性地降低所述植物中由FAD2-1基因和至少兩個，三個或三個以上FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持FAD2-2基因的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平基本上不受影響。在另一種更特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的大豆植物包括核酸序列，在其表達(dá)時能夠選擇性地降低所述植物中由FAD2-1基因和至少兩個，三個或三個以上FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持FAD2-2基因的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平實質(zhì)上不受影響。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的大豆植物包括選自下組的外源核酸序列FAD3內(nèi)含子或它的片段，更優(yōu)選選自下組的核酸分子SEQ IDNOs5-14，或它們的片段。
在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的大豆植物包括核酸序列，在它表達(dá)時能夠選降低所述植物中由FAD3-1C基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持FAD3-1B基因的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的大豆植物包括核酸序列，在它表達(dá)時能夠降低所述植物中由FAD3-1C基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持FAD3-1B基因的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平基本上不受影響。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的大豆植物包括核酸序列，在它表達(dá)時能夠降低所述植物中由FAD3-1C基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持FAD3-1B基因的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平實質(zhì)上不受影響。
在核酸序列表達(dá)時能夠選擇性地降低植物中由FAD2-1基因和至少一個FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持FAD2-2基因的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響、基本上不受影響、或?qū)嵸|(zhì)上不受影響的實施方案中，優(yōu)選的FAD2-1核酸序列選自下組(1)在所述核酸分子的整個長度上與選自下組的核苷酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO2和它們的片段，其中，所述核酸序列在嚴(yán)格條件下不能與具有SEQ ID NO4的核苷酸序列的核酸分子雜交；(2)包括同樣存在于大豆FAD2-1基因內(nèi)含子中的序列的核酸分子，和(3)在核酸分子的整個長度上與(2)的核酸分子具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸分子。
在核酸序列表達(dá)時能夠選擇性地降低植物中由FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平的實施方案中，優(yōu)選的FAD3核酸序列選自下組(1)在核酸分子的整個長度上與選自下組的核苷酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸序列SEQ ID NOs5-14，和它們的片段，其中，所述核酸序列在嚴(yán)格條件下不能與具有選自下組的核苷酸序列的核酸分子雜交SEQID NO1，SEQ ID NO2，和SEQ ID NO4；(2)包括同樣存在于大豆FAD3基因內(nèi)含子中的序列的核酸分子；和(3)在核酸分子的整個長度上與(2)的核酸分子具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸分子。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明大豆種子的油組成為50％或以上的油酸，10％或以下的亞麻酸。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明大豆種子的油組成為60％或以上的油酸，7％或以下的亞麻酸。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明大豆種子的油組成為65％或以上的油酸，5％或以下的亞麻酸，優(yōu)選4％或以下的亞麻酸，更優(yōu)選3％或以下的亞麻酸。在本文中，在植物或諸如種子的植物部分中的所有油的％組成是通過相對摩爾百分比確定的。
在另一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明大豆種子的油組成為50％-90％的油酸，和10％或以下的亞麻酸。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明大豆種子的油組成為60％-80％的油酸，和7％或以下的亞麻酸。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明大豆種子的油組成為65％-75％的油酸，和5％或以下的亞麻酸，優(yōu)選4％或以下的亞麻酸，更優(yōu)選3％或以下的亞麻酸。
在另一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明大豆種子的油組成為50％-90％的油酸，8％-16％的棕櫚酸和10％或以下的亞麻酸。在一種更優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明大豆種子的油組成為60％-80％的油酸，6％-12％的棕櫚酸和7％或以下的亞麻酸。在一種特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明大豆種子的油組成為65％-75％的油酸，8％-11％的棕櫚酸和5％或以下的亞麻酸，優(yōu)選4％或以下的亞麻酸，更優(yōu)選3％或以下的亞麻酸。
在一種特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明大豆種子的油組成為65％-75％的油酸，和5％或以下的亞麻酸，優(yōu)選4％或以下的亞麻酸，更優(yōu)選3％或以下的亞麻酸，其中，在核酸序列表達(dá)時能夠選擇性地降低所述植物中由FAD2-1基因和至少一個FAD3基因編碼的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，同時保持FAD2-2基因的蛋白和/或轉(zhuǎn)錄物的水平部分不受影響、基本上不受影響、或?qū)嵸|(zhì)上不受影響，F(xiàn)AD2-1核酸序列選自下組(1)在核酸分子的整個長度上與選自下組的核苷酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO2和它們的片段，其中，所述核酸序列在嚴(yán)格條件下不能與具有SEQ ID NO4的核苷酸序列的核酸分子雜交；(2)包含同樣存在于大豆FAD2-1基因內(nèi)含子中的序列的核酸分子；和(3)在核酸分子的整個長度上與(2)的核酸分子具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸分子；并且所述FAD3核酸序列選自下組(1)在核酸分子的整個長度上與選自下組的核苷酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％的序列同一性核酸序列SEQ ID NOs5-14，其中，所述核酸序列在嚴(yán)格條件下不能與具有選自下組的核苷酸序列的核酸分子雜交SEQ ID NO1，SEQ ID NO2和SEQ ID NO4；(2)包含同樣存在于大豆FAD3基因內(nèi)含子中的序列的核酸分子；和(3)在核酸分子的整個長度上與(2)的核酸分子具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％的序列同一性核酸分子。
在另一種實施方案中，本發(fā)明大豆種子的油組成為80％或以上，更優(yōu)選90％或以上的油酸，5％或以下的亞麻酸，優(yōu)選4％或以下的亞麻酸，更優(yōu)選3％或以下的亞麻酸。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明大豆種子的油組成為80％或以上，更優(yōu)選90％或以上的油酸，5％或以下的亞麻酸，優(yōu)選4％或以下的亞麻酸，更優(yōu)選3％或以下的亞麻酸，其中，所述核酸序列能夠減少FAD2-1，F(xiàn)AD2-2和至少一個FAD3基因的表達(dá)。在這一方面的特別優(yōu)選的實施方案中，所述核酸序列選自下組SEQ ID NO1-SEQ IDNO14，它們的互補(bǔ)序列，和任意一個的片段。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明大豆種子的油組成為50％或以上的油酸，更優(yōu)選60％或以上，70％或以上，80％或以上，或90％或以上的油酸。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明大豆種子的油組成為10％或以下的亞麻酸，更優(yōu)選5％或以下，4％或以下，或3％或以下的亞麻酸。
還可以從諸如單子葉植物或雙子葉植物的其他物種中獲得類似的遺傳物質(zhì)，所述植物包括，但不局限于canola，玉米，大豆，擬南芥，菜豆，花生，苜蓿，小麥，水稻，燕麥，高粱，油菜籽，黑麥，大麥，粟，羊茅，多年生黑麥草，甘蔗，酸果蔓，番木瓜，香蕉，紅花，油棕，亞麻，香瓜，蘋果，黃瓜，石槲蘭，劍蘭，菊花，百合，棉花，桉樹，向日葵，蕓薹，油菜，草坪草，甜菜，咖啡和薯蕷(Christou，INOParticle Bombardment for Genetic Engineering of Plants，Biotechnology Intelligence Unit.Academic Press，San Diego，California(1996))，優(yōu)選canola，玉米，蕓薹，油菜，油菜籽，大豆，海甘藍(lán)，芥菜，蓖麻，花生，芝麻，棉籽，亞麻籽，紅花，油棕，亞麻，和向日葵，更優(yōu)選canola，油菜籽，玉米，蕓薹，油菜，大豆，向日葵，紅花，油棕，和花生。在更優(yōu)選的實施方案中，將所述遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入canola.在另一種更優(yōu)選的實施方案中，將所述遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入油菜。在另一種特別優(yōu)選的實施方案中，將所述遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入大豆。
可以在諸如植物的整個生物體中提高或降低諸如轉(zhuǎn)錄物或蛋白的產(chǎn)物的含量，或局限在所述生物體的一個或多個特定的器官或組織。例如，可以提高或降低植物的一個或多個組織和器官中的產(chǎn)物的含量，包括，但不局限于根，塊莖，干，葉，莖，果實，漿果，堅果，樹皮，豆莢，種子和花。優(yōu)選的器官是種子。
可以通過利用為此而設(shè)計的DNA載體或構(gòu)建體將外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。所述載體的設(shè)計屬于本領(lǐng)域的公知技術(shù)(參見，PlantMolecular BiologyA Laboratory Manual，Clark(ed.)，Springer，New York(1997))。
構(gòu)建體或載體可以包括植物啟動子，以便表達(dá)所選擇的核酸分子。在優(yōu)選實施方案中，本文所披露的任何核酸分子都能可操作地連接在啟動子區(qū)上，該啟動子區(qū)能在植物細(xì)胞中起作用，導(dǎo)致mRNA分子的生產(chǎn)。例如，可以使用能夠在植物細(xì)胞中起作用以導(dǎo)致mRNA分子生產(chǎn)的任何啟動子，如，但不局限于本文所披露的啟動子。在優(yōu)選實施方案中，所述啟動子是植物啟動子。
在文獻(xiàn)中業(yè)已披露了在植物細(xì)胞中有活性的多種啟動子。這些啟動子包括，但不局限于，胭脂堿合成酶(NOS)啟動子(Ebert等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)845745-5749(1987))，章魚堿合成酶(OCS)啟動子(它被攜帶在根癌土壤桿菌的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上)，花椰菜花葉病毒啟動子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動子(Lawton等，Plant Mol.Biol.9315-324(1987))和CaMV 35S啟動子(Odell等，Nature 313810-812(1985))，玄參花葉病毒35S-啟動子(美國專利號5,378,619)，來自核糖-1，5-二-磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)的光誘導(dǎo)型啟動子，Adh啟動子(Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)846624-6628(1987))，蔗糖合成酶啟動子(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)874144-4148(1990))，R基因復(fù)合體啟動子(Chandler等，The Plant Cell 11175-1183(1989))以及葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動子。業(yè)已將所述啟動子用于制備在植物中得到表達(dá)的DNA構(gòu)建體；例如，參見，PCT
發(fā)明者J·J·菲拉蒂 申請人:加利福尼亞基因公司