經(jīng)改良的抗gdf-8的拮抗劑抗體及其用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供經(jīng)改良的中和性抗GDF-8抗體，其能在宿主細(xì)胞中以顯著高于先前抗GDF-8抗體的水平表達(dá)。本發(fā)明還提供使用包含這些抗體的組合物增加肌肉質(zhì)量或強(qiáng)度及治療或預(yù)防肌肉病癥、神經(jīng)肌肉病癥、代謝紊亂、脂肪組織病癥或骨病的方法。PTA-1298020120614PTA-1298120120614
【專(zhuān)利說(shuō)明】經(jīng)改良的抗GDF-8的拮抗劑抗體及其用途
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)主張2012年6月15日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/660, 232號(hào)的權(quán)益，所述 申請(qǐng)的內(nèi)容以引用方式全文并入本文中。
[0003] 序列表引用
[0004] 在37CFR § 1. 821下以計(jì)算機(jī)可讀取形式（CRF)經(jīng)由EFS-Web以文件名PC071914_ SEQLIST_ST25. txt同時(shí)提交的序列表以引用方式并入本文中。序列表的電子副本于2013 年5月14日創(chuàng)建，文件大小為71KB。
[0005] 生物保藏
[0006] 本發(fā)明的代表性材料于2012年6月14日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection，"ATCC，'），學(xué)院大道（University Boulevard) 10801 號(hào)，馬納薩斯，VA 20110-2209,美國(guó)。具有ATCC登錄號(hào)PTA-12980的載體0GD1.0. O-HC是 編碼OGDL 0. 0重鏈可變區(qū)的多核苷酸，具有ATCC登錄號(hào)PTA-12981的載體OGDL 0. O-LC 是編碼OGDL 0. 0輕鏈可變區(qū)的多核苷酸。
[0007] 保藏物在國(guó)際承認(rèn)用于專(zhuān)利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約及其下條例（"布達(dá) 佩斯條約"）的規(guī)定下制備。這保證可將保藏物的活培養(yǎng)物自保藏的日起維持30年。根據(jù) 布達(dá)佩斯條約條款將使保藏物可由ATCC獲得且使其遵守Pf izer公司與ATCC之間的協(xié)議， 其保證公眾可基于相關(guān)美國(guó)專(zhuān)利的發(fā)布或基于向公眾公開(kāi)任何美國(guó)或外國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)（以 先達(dá)到者為準(zhǔn)）永久且不受限制地獲得保藏培養(yǎng)物的后代，且保證由美國(guó)專(zhuān)利商標(biāo)局根據(jù) 35U. S. C. § 122和依據(jù)35U. S. C. § 122的委員會(huì)規(guī)則（包括37CFR § L 14,尤其參照886 OG 638)確定授權(quán)者可獲得所述后代。
[0008] 本申請(qǐng)的專(zhuān)利權(quán)人已同意，若所保藏材料的培養(yǎng)物當(dāng)在適宜條件下培養(yǎng)時(shí)死亡或 丟失或被破壞，則將迅速更換所述材料的另一培養(yǎng)物并作出通知。所保藏材料的可獲得性 不應(yīng)視為允許在違反任何政府機(jī)關(guān)根據(jù)其專(zhuān)利法授予的權(quán)利的情況下實(shí)踐本發(fā)明。

【背景技術(shù)】
[0009] 生長(zhǎng)分化因子-8(⑶F-8)也稱(chēng)作肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin)，是分泌蛋白及結(jié) 構(gòu)相關(guān)生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)超家族的成員。該超家族的成員具有生長(zhǎng) 調(diào)節(jié)及形態(tài)發(fā)生性質(zhì)（Kingsley 等人（1994) Genes Dev. 8:133-46 ;Hoodless 等人（1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72)。人類(lèi)⑶F-8 是以 375 個(gè)氨基酸的前體蛋白 質(zhì)來(lái)合成，其形成同型二聚體復(fù)合體。在處理期間，稱(chēng)為"陰性相關(guān)肽"(LAP)的氨基末端前 肽被切割且可與所述同型二聚體保持非共價(jià)結(jié)合，從而形成名為"小潛伏復(fù)合體"的無(wú)活性 復(fù)合體（Miyazono 等人（1988) J. Biol. Chem. 263:6407-15 ;Wakefield 等人（1988) J. Biol. Chem. 263:7646-54 ;Brown 等人（1999) Growth Factors3:35-43 ;Thies 等人（2001) Growth Factors 18:251-59 ;Gentry 等人（1990)Biochemistry 29:6851-57 ;Derynck 等人（1995) Nature 316:701-05 ;Massague(1990)Ann. Rev. Cell Biol. 12:597-641)。諸如促濾泡素抑 制素（follistatin)及其相關(guān)物的蛋白質(zhì)也結(jié)合成熟⑶F-8同型二聚體且抑制⑶F-8生物 活性（Gamer 等人（1999) Dev. Biol. 208:222-32)。
[0010] 來(lái)自不同物種的推斷⑶F-8氨基酸序列的比對(duì)顯示，⑶F-8非常保守（McPherron 等人（1997)Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A. 94:12457-61)。人類(lèi)、小鼠、大鼠、豬及雞⑶F-8 的 序列在C末端區(qū)100%相同，而狒狒、牛及羊⑶F-8在C末端處僅相差3個(gè)氨基酸。⑶F-8 在物種之間的高保守度表明，GDF-8具有必需的生理功能。
[0011] 已顯示⑶F-8可通過(guò)抑制成肌細(xì)胞及衛(wèi)星細(xì)胞的增殖及分化在肌肉發(fā)育調(diào)節(jié) 及體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起重要作用（Lee and McPherron(1999)Curr.0pin.Genet.Dev.9:604_07; McCroskery等人（2003) J. Cell. Biol. 162:1135-47)。其早期在發(fā)育中的骨骼肌中表達(dá)，且 繼續(xù)在成年骨骼肌中表達(dá)，優(yōu)先在快縮類(lèi)型中表達(dá)。另外，在成年小鼠中過(guò)表達(dá)的⑶F-8造 成顯著肌肉損失（Zimmers等人（2002)Science 296:1486-88)。同樣，已顯不使GDF-8基因 無(wú)活性的天然突變?cè)趧?dòng)物及人類(lèi)中可引起肥大及增生（Lee及McPherron (1997),見(jiàn)上文）。 例如，GDF-8敲除轉(zhuǎn)基因小鼠的特征在于骨骼肌的顯著肥大及增生以及改變的骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu) (McPherron 等人（1997)Nature387:83_90;Hamrick 等人（2000)Bone 27:343-49)。在天 然⑶F-8突變的牛中顯現(xiàn)類(lèi)似的骨骼肌質(zhì)量增加（Ashmore等人（1974) Growth 38:501-07 ; Swatland 等人（1994) J. Anim. Sci. 38:752-57 ;McPherron 等人，見(jiàn)上文；Kambadur 等人 (1997)Genome Res. 7:910-15)。另外，不同研究顯示，增加的⑶F-8表達(dá)與HIV誘導(dǎo)的肌 肉耗損有關(guān)（Gonzalez-Cadavid 等人（1998)Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 95:14938-43)。 也已顯示⑶F-8參與肌肉特異性酶（例如，肌酸激酶）的產(chǎn)生及成肌細(xì)胞增殖（W0 00/43781)。
[0012] 除了其生長(zhǎng)調(diào)節(jié)及形態(tài)發(fā)生性質(zhì)以外，⑶F-8據(jù)信參與多種其它生理過(guò)程，包括在 2型糖尿病發(fā)展期間的葡萄糖體內(nèi)穩(wěn)態(tài)、葡萄糖耐量降低、代謝綜合征（即，例如綜合征X的 綜合征，其涉及同時(shí)發(fā)生一組健康狀況，所述狀況可包括胰島素抵抗、腹部肥胖癥、血脂異 常、高血壓、慢性炎癥、趨血栓阻塞性狀態(tài)等，其使個(gè)人具有2型糖尿病和/或心臟病的高風(fēng) 險(xiǎn)）、胰島素抵抗（例如，由諸如創(chuàng)傷或氮失調(diào)癥等創(chuàng)傷誘導(dǎo)的抗性）及脂肪組織病癥（例 如，肥胖癥、血脂異常、非酒精性脂肪肝疾病等）（Kim等人（2000)Biochem. Biophys. Res. Comm. 281:902-06)〇
[0013] 多種人類(lèi)及動(dòng)物病癥與肌肉組織功能受損有關(guān)，例如，肌萎縮側(cè)索硬化癥 ("ALS")、肌營(yíng)養(yǎng)不良（"MD";包括杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良（Duchenne，s muscular dystrophy))、 肌萎縮、器官萎縮、衰弱癥、充血阻塞性肺?。–OPD)、少肌癥、惡病質(zhì)及由其它疾病及狀況引 起的肌肉耗損綜合征。目前，幾乎沒(méi)有可靠或有效的療法可治療這些病癥。這些疾病的病 理表明GDF-8信號(hào)傳導(dǎo)在這些疾病的治療中作為靶的潛在作用。
[0014] ALS是遲發(fā)且致死的神經(jīng)變性疾病，其特征在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性及肌萎縮。ALS 通常始于步態(tài)異常及靈活性損失，然后進(jìn)展至肢體及膈膜癱瘓。盡管大多數(shù)ALS病例是散 發(fā)性的且病因未知，但已顯示5-10%病例源自顯性家族性（FALS)遺傳。約10-20%的FALS 病例歸因于Cu/Zn超氧化物歧化酶（S0D1)基因中的突變（綜述于Bruijn等人（2004) Ann. Rev. Neurosci. 27:723-49中）。SODl是催化超氧化物變?yōu)檫^(guò)氧化氫及雙原子氧的反應(yīng)的異 二聚金屬-蛋白質(zhì)，且由于SODl的損失不引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾?。≧eaume等人（1996)Nat. Genet. 13:43-47)，人們相信毒性功能獲得可誘導(dǎo)疾?。ňC述于Brui jn等人，見(jiàn)上文）。SODl 誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡的具體機(jī)制尚未明了，且可能涉及軸突運(yùn)輸?shù)母淖?、?duì)錯(cuò)誤折疊蛋 白質(zhì)的細(xì)胞反應(yīng)、線粒體功能失調(diào)及興奮性神經(jīng)毒性（Bruijn等人，見(jiàn)上文）。
[0015] 在ALS中觀察到的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性可經(jīng)由多種機(jī)制發(fā)生，包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元破壞 營(yíng)養(yǎng)因子的攝取或運(yùn)輸（綜述于Holzbaur(2004)Trends Cell Biol. 14:233-40中）。因 此，ALS可用通過(guò)提供最佳存活環(huán)境來(lái)使變性神經(jīng)元恢復(fù)活力的療法來(lái)治療。神經(jīng)環(huán)境包 括諸如神經(jīng)膠質(zhì)及肌肉細(xì)胞等受運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元支配的非神經(jīng)元細(xì)胞。此環(huán)境提供由神經(jīng)元 內(nèi)吞并經(jīng)由逆行軸突運(yùn)輸運(yùn)輸至細(xì)胞體的營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)因子（Chao(2003)Neuron 39:1-2; Holzbaur，見(jiàn)上文）。
[0016] FALS已通過(guò)突變體SODl的過(guò)表達(dá)在小鼠及大鼠二者中建模（Howland等人 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99:1604-09)。過(guò)表達(dá)突變體 SODl 的 G93A 形式的轉(zhuǎn)基 因小鼠截至90至100日齡時(shí)顯示肌肉無(wú)力及萎縮，且通常在接近130日齡時(shí)死亡（Gurney 等人（1994) Science 264:1772-75)。然而，潛在的S0DG93A誘導(dǎo)的病理（其包括握力減弱 及神經(jīng)肌肉接點(diǎn)損失）早在50日齡時(shí)即顯著（Frey等人（2000) J. Neurosci. 20:2534-42 ; Fisher 等人（2004)Exp. Neuro. 185:232-40 ;Ligon 等人（2005)NeuroReport 16:533-36 ; Wooley等人（2005)Muscle Nerve 32:43-50)。表達(dá)S0DG93A突變的轉(zhuǎn)基因大鼠遵循類(lèi)似 的變性時(shí)程（Howland等人，見(jiàn)上文）。近期研究已表明，病理的發(fā)展并非細(xì)胞自主性，此與 以下假設(shè)相同：在ALS中觀察到的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性經(jīng)由多種機(jī)制而發(fā)生，包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元 破壞營(yíng)養(yǎng)因子的攝取及運(yùn)輸（見(jiàn)上文）。Clement及合作者使用嵌合小鼠顯示，野生型非 神經(jīng)元細(xì)胞可延長(zhǎng)表達(dá)突變體SODl的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活（Clement等人（2003) Science 302:113-17)。這些觀察已促使人們研究可能通過(guò)提供最佳存活微環(huán)境來(lái)減慢神經(jīng)元變性 的療法。例如，經(jīng)由直接肌內(nèi)注射病毒表達(dá)的生長(zhǎng)因子（包括IGF-1、⑶NF及VEGF)治療 S0DG93A 小鼠延長(zhǎng)動(dòng)物存活（Kaspar 等人（2003) Science301:839-42 ;Azzouz 等人（2004) Nature 429:413-17 ;Wang 等人（2002) J.Neurosci. 22:6920-28)。另外，在 S0DG93A 轉(zhuǎn)基因 小鼠模型中，局部IGF-I特異性同種型（mIGF-1)的肌肉特異性表達(dá)穩(wěn)定神經(jīng)肌肉接點(diǎn)，促 進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活且延遲疾病的發(fā)作及進(jìn)展，表明在轉(zhuǎn)基因 SODl動(dòng)物中，對(duì)肌肉的直接效 應(yīng)可影響疾病發(fā)作及進(jìn)展（Dobrowolny等人（2005) J. Cell Biol. 168:193-99)。也已在ALS 小鼠中報(bào)導(dǎo)肌肉高代謝與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元易損性之間的關(guān)聯(lián)，從而支持肌肉缺陷可促進(jìn)疾病病 因的假設(shè)（Dupois 等人（2004) Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A. 101:11159-64)。因此，促進(jìn)肌 肉生長(zhǎng)應(yīng)可改良對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的局部支持，并因此產(chǎn)生治療益處。
[0017] 抑制肌肉生長(zhǎng)抑制素表達(dá)導(dǎo)致肌肉肥大及增生（Lee及McPherron，見(jiàn)上文； McPherron等人，見(jiàn)上文）。肌肉生長(zhǎng)抑制素負(fù)向調(diào)節(jié)損傷后的肌肉再生，且在⑶F-8無(wú) 效小鼠中，缺少肌肉生長(zhǎng)抑制素導(dǎo)致肌肉再生加速（McCroskery等人，（2005) J. Cell. Sci. 118:3531-41)。肌肉生長(zhǎng)抑制素中和抗體增加野生型小鼠（Whittemore等人（2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300:965-71)及 mdx 小鼠（肌營(yíng)養(yǎng)不良模型，Bogdanovich 等人（2002)Nature420:418-21 ;Wagner 等人（2002)Ann. Neurol. 52:832-36)的體重、骨骼 肌質(zhì)量以及骨骼肌的肌肉大小及強(qiáng)度。此外，在這些小鼠中，肌肉生長(zhǎng)抑制素抗體降低對(duì)膈 膜（在ALS發(fā)病期間也被靶向的肌肉）的損傷。有假設(shè)諸如HGF等生長(zhǎng)因子對(duì)肌肉的作用 可以是由于抑制肌肉生長(zhǎng)抑制素表達(dá)所致（McCroskery等人（2005)，見(jiàn)上文），由此幫助 向上移動(dòng)再生與變性之間的"推拉（push and pull)"或平衡。因此，⑶F-8抑制作為治療 ALS、肌營(yíng)養(yǎng)不良（MD)及其它期望增加肌肉質(zhì)量、強(qiáng)度、大小等的GDF-8相關(guān)病癥（例如神 經(jīng)肌肉病癥）的潛在藥理學(xué)靶存在。由于可獲得ALS的多種動(dòng)物模型（小鼠及大鼠），可在 兩種不同物種中測(cè)試治療劑，由此提高人類(lèi)體內(nèi)治療效果的可信度。
[0018] 除了人類(lèi)的神經(jīng)肌肉病癥以外，還存在與骨丟失相關(guān)的生長(zhǎng)因子相關(guān)狀況，例如 骨質(zhì)疏松和骨關(guān)節(jié)炎，其主要影響老人和/或停經(jīng)后女性。另外，代謝性骨疾病及病癥包括 由于長(zhǎng)期糖皮質(zhì)素療法、性腺早衰、雄激素抑制、維生素 D缺乏、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、 營(yíng)養(yǎng)缺乏及神經(jīng)性厭食癥所致的低骨量。盡管這些狀況的多種當(dāng)前療法通過(guò)抑制骨再吸收 來(lái)發(fā)揮作用，但促進(jìn)骨形成的療法可以是有用的替代性治療。由于GDF-8在骨發(fā)育以及肌 肉發(fā)育中起作用，GDF-8的調(diào)節(jié)也是治療骨變性病癥的極佳藥理學(xué)靶。
[0019] 除了其他生物效應(yīng)，特異性拮抗GDF-8的鼠類(lèi)單克隆抗體先前描述為在ALS的 哨齒動(dòng)物模型中增加肌肉質(zhì)量及強(qiáng)度（Holzbaur, EL等人，Myostatin inhibition slows muscle atrophy in rodent models of amyotrophic lateral sclerosis, Neurobiology of Disease (2006) 23 (3) :697-707)。因此預(yù)期在ALS患者以及在受其它特征為過(guò)量⑶F-8 或由其介導(dǎo)的疾病及病癥（例如上述的那些）影響的患者中，小鼠抗體及其人源化對(duì)應(yīng)體 可有效增加肌肉質(zhì)量及強(qiáng)度。
[0020] 上文所提及的人源化版本的小鼠抗GDF-8抗體（如多種單克隆抗體及其它基于蛋 白質(zhì)的治療劑）的制造困難且昂貴，因其制造通常需要在活哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行生產(chǎn)。因 此，提高該抗體或其它具有類(lèi)似特異性的抗體的產(chǎn)率允許以較少投入產(chǎn)生等量活性藥物。 這將具有雙重益處，即在降低制造成本的同時(shí)釋放有限的制造設(shè)施用于生產(chǎn)其它生物藥 物。兩種益處均都會(huì)促進(jìn)達(dá)成提高治療性抗⑶F-8抗體以及其它生物制劑對(duì)于患者的可用 性的目標(biāo)。因此，本領(lǐng)域需要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有較高產(chǎn)率的抗GDF-8抗體的改良形式。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 本發(fā)明提供人源化抗GDF-8抗體或其抗原結(jié)合片段，其能以與共享相同互補(bǔ)決定 區(qū)（⑶R)的這些抗體的先前形式相比較高的水平在宿主細(xì)胞中表達(dá)。還提供用于本發(fā)明方 法中的包含這些抗體的組合物。
[0022] 在某些實(shí)施方案中，這些抗體具有重鏈可變（VH)區(qū)，其中⑶Rl由氨基酸序列SEQ ID NO: 10 或 SEQ ID NO: 20 限定，CDR2 由氨基酸序列 SEQ ID NO: 11 或 SEQ ID NO: 21 限定， ⑶R3由氨基酸序列SEQ ID NO: 12限定，且其中VH區(qū)經(jīng)修飾以使得在Kabat位置108的氨 基酸是亮氨酸而非甲硫氨酸。在其它實(shí)施方案中，這些抗體具有包含相同⑶R的VH區(qū)，且 其中VH區(qū)的第四框架區(qū)包含SEQ ID N0:44的氨基酸106-116。在這些抗體的其它實(shí)施方 案中，CDR接枝至人類(lèi)生殖細(xì)胞VH基因區(qū)段DP-47上然后與JH4人類(lèi)重鏈J區(qū)段基因連接。 在其它實(shí)施方案中，這些抗體的VH區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID N0:44。
[0023] 在Kabat位置108具有亮氨酸的本發(fā)明抗體（例如上文所例示的那些）的特征在 于表達(dá)水平與在相同位置存在甲硫氨酸的形式相比有所提高。在某些實(shí)施方案中，前一形 式在類(lèi)似條件下的表達(dá)水平比后一形式高大于約50 %、100 %、150 %、200 %、250 %、300 %、 400 %、500 %、600 %、700 %、800 %、900 %、1000 %、1200 %、1400 %、1600 %、1800 % 或甚至 2000%的量。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明抗體的其它實(shí)施方案，前一段落中描述的VH區(qū)可與輕鏈可變（VL)區(qū) 配對(duì)，在所述輕鏈可變（VL)區(qū)中⑶Rl由氨基酸序列SEQ ID NO: 13限定，⑶R2由氨基酸 序列SEQ ID NO: 14限定，CDR3由氨基酸序列SEQ ID NO: 15限定，且其中VL區(qū)中Kabat位 置100的氨基酸是甘氨酸或谷氨酰胺。在其它實(shí)施方案中，VH區(qū)與VL區(qū)配對(duì)，在所述VL 區(qū)中輕鏈CDR接枝至人類(lèi)生殖細(xì)胞VL基因區(qū)段DPK-9然后與JK4人類(lèi)輕鏈J區(qū)段基因連 接。根據(jù)這些抗體的一些其它實(shí)施方案，先前所述的VH區(qū)與VL區(qū)配對(duì)，這些VL區(qū)具有先 前所述的VL區(qū)CDR且其中VL區(qū)的第四框架區(qū)包含SEQ ID N0:9或SEQ ID N0:46的氨基 酸98-107。在其它實(shí)施方案中，先前所述的VH區(qū)與VL區(qū)配對(duì)，這些VL區(qū)包含氨基酸序列 SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:46。
[0025] 在一些其它實(shí)施方案中，上文所述VH區(qū)連接至來(lái)自人類(lèi)抗體亞型（包括IgA、IgG、 IgD、IgE或IgM)的重鏈恒定區(qū)。如果重鏈恒定區(qū)來(lái)自IgG，則在其它實(shí)施方案中，抗體重鏈 恒定區(qū)來(lái)自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的IgG亞型。重鏈恒定區(qū)可經(jīng)修飾以例如消除一或多 種Fc結(jié)構(gòu)域效應(yīng)子功能，如SEQ ID NO: 57中所例示。在其它實(shí)施方案中，上文所述VL區(qū) 連接至可以具有λ或κ亞型的輕鏈恒定區(qū)。
[0026] 根據(jù)其它實(shí)施方案，SEQ ID NO: 44的VH區(qū)與氨基酸序列SEQ ID NO: 57的經(jīng)修飾 重鏈區(qū)連接以產(chǎn)生氨基酸序列SEQ ID N0:58的全長(zhǎng)抗體重鏈。相反，在其它實(shí)施方案中， SEQ ID N0:46的VL區(qū)可與氨基酸序列SEQ ID NO: 17的κ恒定輕鏈連接以產(chǎn)生氨基酸序列 SEQ ID N0:59的全長(zhǎng)抗體輕鏈。在其它實(shí)施方案中，每一全長(zhǎng)抗體重鏈和輕鏈的兩個(gè)繼而 可組合以產(chǎn)生具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗⑶F-8抗體。在其它實(shí)施方案中，抗體可包含這 些全長(zhǎng)大小的完整抗體的片段或衍生物，包括例如Fab、F(ab'） 2、scFv、scFv-Fc、scFv-CH、 scFab、scFv-拉鏈、雙抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微型抗體、Fv及雙特異性抗體。
[0027] 本發(fā)明抗體可對(duì)⑶F-8具有一定范圍的結(jié)合親和性，例如約5000nM或甚至更高， 例如至少約 4000nM、3000nM、2000nM、1000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、 300nM、200nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、 6ηΜ、5ηΜ、4ηΜ、3ηΜ、2ηΜ、1ηΜ、0· 1ηΜ、0· OlnM 或 0· OOlnM。
[0028] 本發(fā)明還提供編碼抗⑶F-8抗體的核酸，以及包含這些核酸序列的表達(dá)載體，以 及用于表達(dá)這些抗體的宿主細(xì)胞。
[0029] 本發(fā)明還提供用于治療或預(yù)防患者中特征為肌肉質(zhì)量或強(qiáng)度減小的肌肉病癥的 方法。這些方法通過(guò)向需要治療或預(yù)防這些病癥的患者施用治療或預(yù)防有效量的包含特異 性結(jié)合GDF-8的抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物來(lái)實(shí)施。用于這些方法的抗體包括上文及 本發(fā)明全文中描述的那些抗體。
[0030] 根據(jù)某些實(shí)施方案，本發(fā)明抗體組合物可以治療或預(yù)防有效量施用給需要治療或 預(yù)防肌肉病癥的患者，所述肌肉病癥包括選自以下的病癥：肌營(yíng)養(yǎng)不良、肌萎縮、少肌癥、惡 病質(zhì)、肌肉耗損綜合征、年齡相關(guān)性肌肉質(zhì)量或強(qiáng)度損失及衰弱癥。在其它實(shí)施方案中，肌 肉病癥是由癌癥引起的惡病質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，肌肉病癥是杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良。在后一 情況的某些實(shí)施方案中，施用抗GDF-8抗體可有效改良患者在6分鐘步行測(cè)試中的表現(xiàn)。
[0031] 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在有效治療肌營(yíng)養(yǎng)不良的另一藥劑之前、同時(shí)或之后施 用包含本發(fā)明抗體的組合物還可用于治療患有肌營(yíng)養(yǎng)不良（例如杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良）的患 者。在某些實(shí)施方案中，該藥劑是糖皮質(zhì)素，例如強(qiáng)的松（prednisone)。
[0032] 還提供通過(guò)以有效增加哺乳動(dòng)物的肌肉質(zhì)量或強(qiáng)度的量向哺乳動(dòng)物施用包含本 發(fā)明抗GDF-8抗體的組合物來(lái)增加哺乳動(dòng)物的肌肉質(zhì)量或強(qiáng)度的方法。在多個(gè)實(shí)施方案 中，肌肉是骨骼?。òㄒ换蚨喾N在呼吸中發(fā)揮作用的骨骼肌）或心肌。
[0033] 還提供通過(guò)向需要治療或預(yù)防神經(jīng)肌肉病癥的對(duì)象施用治療或預(yù)防有效量的本 發(fā)明抗GDF-8抗體來(lái)治療或預(yù)防神經(jīng)肌肉病癥的方法。在某些實(shí)施方案中，欲治療或預(yù)防 的神經(jīng)肌肉病癥是ALS。
[0034] 還提供通過(guò)向需要治療或預(yù)防代謝紊亂的對(duì)象施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明 抗GDF-8抗體來(lái)治療或預(yù)防代謝紊亂的方法。在多個(gè)實(shí)施方案中，欲治療或預(yù)防的代謝紊 亂包括2型糖尿病、代謝綜合征、綜合征X、胰島素抵抗及葡萄糖耐量降低。
[0035] 還提供通過(guò)向需要治療或預(yù)防脂肪組織病癥的對(duì)象施用治療或預(yù)防有效量的本 發(fā)明抗GDF-8抗體來(lái)治療或預(yù)防脂肪組織病癥的方法。在多個(gè)實(shí)施方案中，欲治療或預(yù)防 的脂肪組織病癥包括肥胖癥及異常高身體質(zhì)量指數(shù)。
[0036] 還提供通過(guò)向需要治療或預(yù)防骨丟失病癥的對(duì)象施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā) 明抗GDF-8抗體來(lái)治療或預(yù)防骨丟失病癥的方法。在多個(gè)實(shí)施方案中，欲治療或預(yù)防的骨 丟失病癥包括骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)減少、骨關(guān)節(jié)炎及骨質(zhì)疏松相關(guān)性骨折。
[0037] 在一些其它實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明方法中的抗⑶F-8抗體包括與有用地改變 其功能或特征（例如，但不限于增加血清半衰期）的部分綴合的抗體。在其它實(shí)施方案中， 可出于類(lèi)似目的或其它目的來(lái)實(shí)現(xiàn)氨基酸變化。
[0038] 用于本發(fā)明方法中的抗體組合物可制備為不同劑型，包括但不限于水性懸浮液， 用于通過(guò)多種途徑施用，這些途徑包括但不限于皮下施用、靜脈內(nèi)施用、肌內(nèi)施用、腹膜內(nèi) 施用、輸注施用或推注施用。
[0039] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明抗⑶F-8抗體的有效劑量在0. 001mg/kg至約250mg/kg 范圍內(nèi)，其可在一次施用中或在多次間隔施用中給予。
[0040] 本發(fā)明還提供由臨床醫(yī)師及其他人員用于幫助將抗⑶F-8抗體組合物施用給患 者的藥物試劑盒。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括凍干形式或水溶液的本發(fā)明抗GDF-8抗 體、稀釋劑（例如藥物級(jí)水或緩沖液）及用于施用抗前胃泌素抗體的裝置（例如注射器及 針）。在其它實(shí)施方案中，試劑盒可另外包括第二治療劑。
[0041] 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0042] 圖IA提供來(lái)自某些本發(fā)明抗⑶F-8抗體的VH區(qū)的氨基酸序列的比對(duì)，這些VH區(qū) 包括鼠類(lèi)抗體VH區(qū)及通過(guò)將鼠類(lèi)重鏈CDR接枝至人類(lèi)生殖細(xì)胞系VH區(qū)DP-47中產(chǎn)生的兩 個(gè)人源化抗體VH區(qū)（即，VHO和VH1)。另外提供進(jìn)一步人源化VH區(qū)VH2-VH5的氨基酸序 列的比對(duì)。重鏈⑶R的氨基酸序列使用粗體加下劃線字型突出顯示。在Kabat位置108的 氨基酸使用星號(hào)下方的粗體字型突出顯示。
[0043] 圖IB提供來(lái)自某些本發(fā)明抗⑶F-8抗體的VL區(qū)的氨基酸序列的比對(duì)，這些VL區(qū) 包括鼠類(lèi)抗體VL區(qū)及通過(guò)將鼠類(lèi)輕鏈CDR接枝至人類(lèi)生殖細(xì)胞系VL區(qū)DPK-9中產(chǎn)生的兩 種人源化抗體VL區(qū)（S卩，VLO和VL1)。另外提供進(jìn)一步人源化VL區(qū)VL2-VL5的氨基酸序 列的比對(duì)。輕鏈⑶R的氨基酸序列使用粗體加下劃線字型突出顯示。在Kabat位置100的 氨基酸使用星號(hào)下方的粗體字型突出顯示。
[0044] 圖2A提供顯示來(lái)自經(jīng)10mg/kg OGDL 0. 0抗體治療兩周的C57B1/6小鼠的腓腸肌 (GAS)及四頭?。≦UAD)質(zhì)量與媒介物對(duì)照相比的增加的圖表。圖2B以經(jīng)OGDL 0. 0抗體治 療的小鼠的肌肉質(zhì)量相對(duì)于對(duì)照的增加百分比報(bào)告圖2A中的相同數(shù)據(jù)。圖2B另外顯示來(lái) 自同組抗體治療小鼠及對(duì)照小鼠的趾長(zhǎng)伸肌（EDL)的肌肉質(zhì)量的增加百分比。
[0045] 圖3提供顯示由來(lái)自經(jīng)10mg/kg OGDL 0· 0抗體治療兩周的C57B1/6小鼠的EDL 肌肉生成的總強(qiáng)直性張力與媒介物對(duì)照相比的增加的圖表。
[0046] 圖4A提供顯示來(lái)自經(jīng)PBS媒介物和0.3、1、3、10及30mg/kg 0GD1.0.0抗體每周 一次治療4周的C57B1/6小鼠的腓腸?。℅astroc)及四頭?。≦uad)質(zhì)量的劑量反應(yīng)性增 加的圖表。數(shù)據(jù)代表在4周結(jié)束時(shí)測(cè)量的肌肉質(zhì)量。圖4B以經(jīng)OGDL 0.0抗體治療的小鼠 的腓腸肌及四頭肌質(zhì)量相對(duì)于對(duì)照的增加百分比報(bào)告圖4A中的相同數(shù)據(jù)。
[0047] 圖54提供顯示經(jīng)？85媒介物和0.3、1、3、10及3011^/1^(?01.0.0抗體每周一次 治療4周的C57B1/6小鼠的全身瘦肉質(zhì)量（lean mass)的劑量反應(yīng)性增加的圖表。數(shù)據(jù)代 表在4周中每周結(jié)束時(shí)測(cè)量的瘦肉質(zhì)量。圖5B提供顯示經(jīng)PBS媒介物和0. 3、1、3、10及 30mg/kg OGDL 0. 0抗體每周一次治療4周的C57B1/6小鼠在4周研究結(jié)束時(shí)全身瘦肉質(zhì)量 的增加的圖表。
[0048] 圖6A提供顯示經(jīng)10mg/kg OGDL 0· 0抗體每周一次治療8周的mdx小鼠的全身瘦 肉質(zhì)量相對(duì)于施用PBS媒介物的對(duì)照mdx小鼠的增加的圖表。圖6B提供顯示經(jīng)10mg/kg OGDL 0. 0抗體每周一次治療8周的mdx小鼠的最大峰值握力相對(duì)于施用PBS媒介物的對(duì)照 mdx小鼠的增加的圖表。
[0049] 圖7A提供顯示來(lái)自經(jīng)10mg/kg OGDL 0· 0抗體每周一次治療8周的mdx小鼠及 C57B1/6小鼠的腓腸肌及四頭肌質(zhì)量相對(duì)于施用PBS媒介物的對(duì)照小鼠的增加的圖表。數(shù) 據(jù)代表在8周結(jié)束時(shí)測(cè)量的肌肉質(zhì)量。圖7B以經(jīng)OGDL 0. 0抗體治療的mdx小鼠的腓腸肌 及四頭肌質(zhì)量相對(duì)于對(duì)照的增加百分比報(bào)告圖7A中的相同數(shù)據(jù)。
[0050] 圖8提供顯示經(jīng)0、3、10及30mg/kg OGDL 0.0抗體治療的食蟹猴中全身瘦肉質(zhì)量 及腿部瘦肉質(zhì)量的劑量反應(yīng)性增加的圖表。
[0051] 圖9提供顯示經(jīng)10mg/kg及30mg/kg 0GD1.0.0抗體治療的食蟹猴的全身瘦肉質(zhì) 量的增加在抗體治療中斷后仍持續(xù)數(shù)周的圖表。
[0052] 圖10A提供顯示經(jīng)10mg/kg及30mg/kg OGDL 0· 0抗體治療8周的食蟹猴中覆蓋 L3-L5椎骨的軸上肌體積相對(duì)于施用PBS媒介物的對(duì)照動(dòng)物有所增加的圖表。
[0053] 圖11提供在4周的OGDL 0. 0抗體治療之前及之后來(lái)自實(shí)例性動(dòng)物對(duì)象的軸上肌 的3D呈像。
[0054] 圖12A提供含有在本文中稱(chēng)作VHO的重鏈可變區(qū)的實(shí)例性抗⑶F-8抗體重鏈的氨 基酸序列。
[0055] 圖12B提供含有在本文中稱(chēng)作VLO的輕鏈可變區(qū)的實(shí)例性抗GDF-8抗體輕鏈的氨 基酸序列。
[0056] 詳細(xì)說(shuō)明
[0057] 本發(fā)明提供人源化抗GDF-8抗體的改良形式，其能在細(xì)胞中以與所述抗體的先前 形式相比顯著較高的水平表達(dá)。因此，預(yù)期本文所述抗⑶F-8抗體的改良形式與先前形式 相比能在相同投入下以更大量及更低商品成本來(lái)產(chǎn)生。本發(fā)明還描述使用改良抗體進(jìn)行治 療或預(yù)防的各種方法。因此，在某些實(shí)例性非限制性實(shí)施方案中，改良的抗GDF-8抗體可用 于治療肌營(yíng)養(yǎng)不良、惡病質(zhì)及其它病癥，其中增加對(duì)象的肌肉質(zhì)量或強(qiáng)度預(yù)期產(chǎn)生治療益 處。
[0058] 抗體結(jié)構(gòu)及多樣件
[0059] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)抗體是指完整免疫球蛋白（Ig)或其任意抗原結(jié)合片段、部位 (part)或部分（portion)，并尤其涵蓋任何包含完整或部分抗原結(jié)合位點(diǎn)且保留至少一定 抗原結(jié)合特異性的多肽?？贵w還可以指衍生自完整抗體的抗原結(jié)合片段、部位或部分與另 一分子（包括不同抗體、來(lái)自Ig超家族的蛋白質(zhì)或并非源于免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)或其它類(lèi)型 的分子）的組合。這些抗體衍生物可包括非蛋白質(zhì)性部分（portion)或部分（moiety)。
[0060] 抗原指能被抗體特異性結(jié)合的物質(zhì)、蛋白質(zhì)或其它?？乖删哂幸粋€(gè)以上抗原決 定簇或表位，其是抗原中被抗體結(jié)合的部分。
[0061] 免疫球蛋白（Ig)是異四聚蛋白質(zhì)，其包含兩條各自約50kDa的重鏈及兩條各自約 25kDa的輕鏈。每條鏈包含多個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域。自氨基末端開(kāi)始，重鏈含有單一可變區(qū)（VH)， 根據(jù)Ig亞型，之后是三個(gè)或四個(gè)稱(chēng)作CHl、CH2、CH3及（在存在時(shí)）CH4的恒定區(qū)。類(lèi)似地， 在輕鏈中，單一可變區(qū)（VL)位于多肽的氨基末端，之后是單一恒定區(qū)（CL)。在CHl與CH2 區(qū)之間是長(zhǎng)度可變的鉸鏈區(qū)，根據(jù)同種型，其給予分子撓性。CHl的重鏈羧基末端（包括鉸 鏈）、CH2、CH3及（在存在時(shí)）CH4構(gòu)成Fc區(qū)。每一可變區(qū)或恒定區(qū)包含單一 Ig結(jié)構(gòu)域。
[0062] Ig輕鏈經(jīng)由二硫鍵結(jié)合至Ig重鏈，且Ig重鏈對(duì)經(jīng)由二硫鍵彼此結(jié)合。非共價(jià)相 互作用還可有助于穩(wěn)定重鏈和輕鏈之間及配對(duì)重鏈之間的鏈間四級(jí)結(jié)構(gòu)。在完整Ig分子 中，配對(duì)重鏈和輕鏈的VH及VL區(qū)的位置彼此相鄰且相互作用并合作形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。因 為完整Ig分子含有兩對(duì)配對(duì)重鏈和輕鏈，即總計(jì)兩條重鏈及兩條輕鏈，Ig分子含有兩個(gè)抗 原結(jié)合位點(diǎn)。鉸鏈區(qū)的存在使抗原結(jié)合位點(diǎn)與分子的其余部分之間具有撓性。
[0063] 重鏈和輕鏈恒定區(qū)不直接參與抗原識(shí)別。然而，重鏈尤其Fc區(qū)含有能與免疫系統(tǒng) 的效應(yīng)子分子及細(xì)胞相互作用的序列，從而使得重鏈恒定區(qū)介導(dǎo)Ig分子的重要的生物學(xué) 功能。
[0064] 重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有三個(gè)氨基酸差異性增強(qiáng)的間隔區(qū)域（稱(chēng)作超變區(qū)或互 補(bǔ)決定區(qū)（CDR))，其與CDR周?chē)Ｊ匦愿叩目蚣軈^(qū)（FR)相比在不同Ig分子之間廣泛變 化。自可變區(qū)的氨基末端起，F(xiàn)R及⑶R的連續(xù)順序和編號(hào)是FRl、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3 及FR4。框架區(qū)主要負(fù)責(zé)決定可變區(qū)Ig結(jié)構(gòu)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)。與之相比，⑶R形成自每一可 變區(qū)向外延伸的環(huán)。相鄰VH及VL區(qū)的CDR合作形成抗原結(jié)合表面，其主要負(fù)責(zé)限定具體 Ig分子的抗原結(jié)合特異性。
[0065] 研究抗體結(jié)構(gòu)及功能的研究者已研發(fā)出不同方案來(lái)鑒別存于任何具體VH或VL區(qū) 的氨基酸序列內(nèi)的重鏈和輕鏈CDR。這些方案中的多者根據(jù)與重鏈和輕鏈可變區(qū)的周?chē)?架相關(guān)的不變或幾乎不變的模式鑒別CDR。然后使用對(duì)應(yīng)于其組成殘基在VH及VL區(qū)范圍 內(nèi)的位置的數(shù)字范圍來(lái)限定CDR。因?yàn)镃DR、尤其第三CDR的長(zhǎng)度可變，方案有時(shí)還使用字 母來(lái)限定組成殘基。第一種這些方案中的一個(gè)稱(chēng)為Kabat編號(hào)系統(tǒng)，其基于比對(duì)隨后已知 的VH及VL序列以確定可變CDR子序列在保守性更高的框架區(qū)范圍內(nèi)的位置。用于限定 ⑶R的其它方案包括AbM編號(hào)系統(tǒng)及Chothia編號(hào)系統(tǒng)。其它方案也有可能。例如，可將 CDR限定為那些接觸抗原的可變區(qū)殘基，即使這些殘基不完全符合CDR的更正式的限定（例 如 Kabat 或 Chothia 編號(hào)方案）。例如，參見(jiàn) Y. Ofran 等人，Automated identification of complementarity determining regions (CDRs) reveals peculiar characteristics of CDRs and B cell 印itopes, J Immunol. 2008 年 11月 I 日；181 (9) :6230-5,其以引用 方式并入。Kabat編號(hào)方案及某些其它抗體編號(hào)方案更詳細(xì)地描述于（例如）Handb〇〇k of Therapeutic Antibodies (2007), Stefan Dubel 編輯，Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, Weinheim，其以引用方式并入。
[0066] 重鏈和輕鏈可變區(qū)的CDR內(nèi)的氨基酸接觸抗原中的殘基且主要負(fù)責(zé)限定抗體對(duì) 抗原的結(jié)合特異性。根據(jù)所研究的抗體-抗原對(duì)，所有或少于所有的CDR殘基可直接接觸 抗原。此外，某些接觸可比其它接觸更有助于限定特異性和/或親和性。
[0067] 抗體及抗原中的接觸殘基的身份可使用X射線結(jié)晶學(xué)或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的方法來(lái)測(cè)定。這些接觸殘基的突變通常（但并非總是）會(huì)對(duì)抗原結(jié)合特異性和/或親 和性造成負(fù)面影響。相反，可能使非接觸CDR殘基以及FR殘基突變且不顯著影響抗原結(jié)合 特異性或親和性。盡管預(yù)期保守氨基酸變化更可能保留抗原結(jié)合特異性及親和性，但任何 具體CDR或框架突變的實(shí)際效果可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的技術(shù)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定。
[0068] 盡管VH及VL區(qū)中通過(guò)其各自框架區(qū)支撐的⑶R通常負(fù)責(zé)建立抗原結(jié)合特異性及 親和性，但可能有例外。例如，在某些Ig分子中，F(xiàn)R殘基可能還有助于抗原結(jié)合，而在某些 其它Ig分子中，一或多個(gè)CDR可能不直接接觸抗原。此外，在其它Ig分子中，分離VH區(qū)及 VL區(qū)的CDR即使在不存在通常會(huì)與其配對(duì)的相應(yīng)可變區(qū)時(shí)還可具有顯著的抗原結(jié)合特異 性。某些分離Ig分子可變區(qū)特異性結(jié)合抗原的能力類(lèi)似于鯊魚(yú)或駱駝抗體的抗原結(jié)合特 異性，這些抗體包含配對(duì)重鏈，但不包含輕鏈。
[0069] 某些物種的Ig分子可根據(jù)不同同種型來(lái)分類(lèi)。例如，在人類(lèi)中，Ig同種型包括 IgA、IgG、IgD、IgE及IgM。此外，IgA及IgG同種型可分類(lèi)為多種亞型，其分別稱(chēng)作IgAl 及IgA2,以及IgGl、IgG2、IgG3及IgG4。同種型及亞型依照重鏈恒定區(qū)氨基酸序列的差異 來(lái)限定。因此，不同同種型及亞型能與不同免疫細(xì)胞上的不同效應(yīng)子分子相互作用，由此產(chǎn) 生不同效應(yīng)子功能。例如，IgA分子有助于黏膜免疫，而IgE分子有助于抗某些寄生蟲(chóng)的免 疫。IgM及IgE的重鏈含有四個(gè)串聯(lián)排列的CH Ig結(jié)構(gòu)域，其自氨基末端CH區(qū)開(kāi)始編號(hào)為 CHI、CH2、CH3及CH4。然而，IgA、IgD及IgG僅含有三個(gè)串聯(lián)排列的CH區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包 含兩個(gè)同種型（稱(chēng)作 K及λ)，其不具有已知生物學(xué)效應(yīng)子功能。天然Ig分子將僅具有單 一輕鏈恒定區(qū)同種型。
[0070] 表達(dá)抗體重鏈和輕鏈的基因在活體內(nèi)經(jīng)由稱(chēng)為V(D)J重組的多次基因重排來(lái)構(gòu) 建。此過(guò)程負(fù)責(zé)從位于基因組中的相當(dāng)有限的基因序列庫(kù)生成大型抗原結(jié)合蛋白質(zhì)庫(kù)。關(guān) 于此過(guò)程的更多信息描述于Abbas, A. Κ.、Lichtman, A. Η.及Pillai, S.，2010, Cellular and Molecular Immunology，第 6 版，第 8 章，Saunders, Philadelphia, PA 中，其全文以引用方 式并入。
[0071] 在人類(lèi)生殖細(xì)胞系DNA中，三個(gè)單獨(dú)基因座編碼構(gòu)建免疫球蛋白重鏈、κ輕鏈及 入輕鏈所需的外顯子。重鏈基因座位于染色體14上，κ鏈基因座位于染色體2上且λ鏈 基因座位于染色體22上。在每一基因座的5'端處具有多個(gè)可變（V)基因區(qū)段，每一區(qū)段 長(zhǎng)約300個(gè)堿基對(duì)，其編碼構(gòu)成抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)（包括第一及第二互補(bǔ)決定區(qū)（CDRl 及CDR2))的大部分氨基酸。在人類(lèi)中，在重鏈基因座中有約100個(gè)V基因，在κ鏈基因座 中有約35個(gè)V基因，且在λ鏈基因座中有約30個(gè)V基因。V基因區(qū)段是通過(guò)內(nèi)含子彼此 隔開(kāi)。
[0072] 位于人類(lèi)重鏈基因座及κ輕鏈基因座中的V區(qū)段下游及恒定（C)基因區(qū)段上游 的是連接（J)區(qū)段的簇，其通常長(zhǎng)約30-50個(gè)堿基對(duì)且彼此及與鄰近V及C基因通過(guò)非編 碼序列隔開(kāi)。重鏈基因座在與不同Ig同種型相關(guān)的9個(gè)功能性C基因的上游含有6個(gè)功 能性J區(qū)段的簇，且κ輕鏈基因座在單一 Ck基因上游含有5個(gè)J區(qū)段的簇。人類(lèi)λ輕鏈 基因座還含有4個(gè)功能性J區(qū)段，但各自定位于4個(gè)相應(yīng)功能性C a基因中的一個(gè)的5'處。 人類(lèi)重鏈基因座還含有定位于V基因下游及J區(qū)段簇上游的超過(guò)20個(gè)多樣性（D)基因區(qū) 段的簇。兩個(gè)輕鏈基因座均均不含D基因區(qū)段。
[0073] 在成熟Ig輕鏈基因中，V區(qū)由V及J基因區(qū)段編碼，而在Ig重鏈中，V區(qū)由V、J及 D基因區(qū)段編碼。重鏈和輕鏈中的⑶Rl及⑶R2由V基因區(qū)段編碼。然而，構(gòu)建⑶R3更復(fù) 雜。對(duì)于重鏈，⑶R3由包括D及J區(qū)段及連接殘基的VDJ接點(diǎn)編碼。類(lèi)似地，輕鏈的⑶R3 由包括J區(qū)段及連接殘基的VJ接點(diǎn)編碼。
[0074] 在不成熟B細(xì)胞中，所有V、D及J基因區(qū)段均單獨(dú)位于生殖細(xì)胞系中且無(wú)法用于 表達(dá)功能性Ig蛋白質(zhì)。相反，隨著B(niǎo)細(xì)胞成熟，這些基因區(qū)段經(jīng)歷稱(chēng)作V(D) J重組的復(fù)雜 的DNA重排過(guò)程，所述過(guò)程使隨機(jī)選擇的重鏈V、D及J基因區(qū)段或輕鏈V及J基因區(qū)段相 互接近。在V、D及J基因區(qū)段的連接期間，負(fù)責(zé)實(shí)施V(D) J重組的分子隨機(jī)添加或移除區(qū) 段之間的核苷酸。以此方式，在成熟B細(xì)胞的基因組中生成完整可變區(qū)外顯子，其隨后與編 碼功能性Ig重鏈和輕鏈蛋白質(zhì)的mRNA中的其它外顯子（包括那些編碼C區(qū)的外顯子）組 合。
[0075] 不同V、D及J基因區(qū)段隨機(jī)組合構(gòu)建V區(qū)外顯子，以及在所連接基因區(qū)段之間隨 機(jī)添加或移除核苷酸是免疫系統(tǒng)生成高多樣性抗原結(jié)合位點(diǎn)的兩個(gè)重要機(jī)制。這些現(xiàn)象分 別稱(chēng)作組合多樣性及連接多樣性。因?yàn)镃DR3自由V、D及J區(qū)段（對(duì)于重鏈）或V及J區(qū) 段（對(duì)于輕鏈）貢獻(xiàn)的序列形成，連接多樣性解釋為何CDR3在三種CDR中可變性最高且通 常與抗原形成的接觸最廣泛。
[0076] 由于Ig分子的結(jié)構(gòu)基本上模塊化，且不同區(qū)實(shí)施不同功能，因此可能制備保留 ⑶F-8結(jié)合能力的抗⑶F-8抗體的片段或衍生物。這些片段或衍生物涵蓋于本文所用術(shù)語(yǔ) 抗體中。自Ig分子制備的抗原結(jié)合片段或衍生物的非限制性實(shí)例包括Fab片段，其是包含 VH、CHI、VL及CL區(qū)的單價(jià)片段；F(ab'）2,其是包含兩個(gè)經(jīng)由鉸鏈區(qū)彼此連接的Fab的二 價(jià)片段；Fd片段，其包含VH及CHl區(qū)；Fv片段，其包含VL及VH區(qū)；dAb片段，其包含VH或 VL區(qū)。另一實(shí)例是單鏈Fv區(qū)（scFv)，其包含在單一多肽鏈中串聯(lián)排列且通過(guò)允許可變區(qū) 結(jié)合并形成單價(jià)抗原結(jié)合位點(diǎn)的多肽接頭間隔的VH及VL區(qū)。單鏈Fv區(qū)可經(jīng)設(shè)計(jì)，其中VH 區(qū)在VL區(qū)之前，或另一選擇為其中VL區(qū)在VH區(qū)之前。接頭的非限制性實(shí)例是15個(gè)殘基 (Gly4Ser) 3的肽（SEQ ID NO: 34)。其它接頭也有可能。其它片段或衍生物包括Fab'、替代 抗體（surrobody)、二硫鍵穩(wěn)定的Fv抗體（dsFv)、雙抗體、三鏈抗體及單結(jié)構(gòu)域抗體（例如 鯊魚(yú)抗體或駱駝化抗體或納米抗體）。其它片段或衍生物也有可能。抗原結(jié)合片段、部位或 部分（例如本文所述的那些）可以重組方式或通過(guò)完整抗體的酶促或化學(xué)切割來(lái)產(chǎn)生。
[0077] 實(shí)例件抗⑶F-8抗體
[0078] ⑶F-8指生長(zhǎng)分化因子-8,其是TGF- β超家族的成員。成熟人類(lèi)⑶F-8的氨基酸 序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0079] 先前研究鑒別能特異性結(jié)合GDF-8并中和其生物學(xué)活性的鼠類(lèi)單克隆抗體。該抗 體經(jīng)證實(shí)在小鼠中，包括在肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS)的小鼠模型中增加肌肉質(zhì)量及強(qiáng)度。 參見(jiàn)WO 2007/024535,其全文以引用方式并入。小鼠抗體的VH區(qū)具有氨基酸序列SEQ ID N0:3且其VL區(qū)具有氨基酸序列SEQ ID N0:4。這些VH及VL區(qū)分別顯示于圖IA及圖IB 中，其中VH及VL區(qū)CDR各自的氨基酸序列以粗體字型來(lái)描繪。在Kabat及AbM編號(hào)系統(tǒng) 中與每一 VH及VL⑶R相關(guān)的SEQ ID NO列于下文所示表1中。根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)限 定的CDR H1、H2及H3分別被指定為SEQ ID NO: 10、11及12,而CDR L1、L2及L3分別被指 定為SEQ ID NO: 13、14及15。根據(jù)AbM編號(hào)系統(tǒng)，CDR H1、H2及H3分別被指定為SEQ ID N0:20、21及22，而CDRL1、L2及L3分別被指定為SEQIDN0:23、24及25。
[0080] 表1 :通過(guò)序列標(biāo)識(shí)編號(hào)標(biāo)識(shí)的本發(fā)明的核酸和氨基酸序列
[0081]

【權(quán)利要求】
1. 特異性結(jié)合GDF-8的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或片段包含： 抗體重鏈可變（VH)區(qū)，其包含來(lái)自由氨基酸序列SEQ ID NO:44限定的所述VH區(qū)的第 一、第二及第三互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R);及 抗體輕鏈可變（VL)區(qū)，其包含來(lái)自由氨基酸序列SEQ ID NO:46限定的所述VL區(qū)的第 一、第二及第三互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R); 其中所述VH區(qū)在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:44的殘基編號(hào)111 (Kabat位置108)的氨基酸位 置處包含亮氨酸。
2. 權(quán)利要求1的抗體或片段，其中VH CDR1包含SEQ ID NO: 10或SEQ ID N0:20, VH 0)1?2包含3￡〇10勵(lì)：11或3￡〇10勵(lì)：21，￥110)1?3包含3￡〇10勵(lì)：12，￥10)1?1包含5￡〇 10勵(lì)：13，￥1〇)1?2包含5￡0 10勵(lì)：14且￥1〇)1?3包含5￡0 10勵(lì)：15。
3. 權(quán)利要求2的抗體或片段，其中在每一 CDR內(nèi)最多三個(gè)非接觸氨基酸殘基經(jīng)保守取 代。
4. 權(quán)利要求1的抗體或片段，其中所述VH區(qū)的第四框架區(qū)（FR4)包含SEQ ID N0:44 的氨基酸106至116。
5. 權(quán)利要求1的抗體或片段，其中所述VL區(qū)在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:46的殘基編號(hào) 100 (Kabat位置100)的氨基酸位置處包含甘氨酸。
6. 權(quán)利要求1的抗體或片段，其中所述VL區(qū)在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:46的殘基編號(hào) 100 (Kabat位置100)的氨基酸位置處包含谷氨酰胺。
7. 權(quán)利要求5的抗體或片段，其中所述VL區(qū)的第四框架區(qū)包含SEQ ID N0:46的氨基 酸98至107。
8. 權(quán)利要求6的抗體或片段，其中所述VL區(qū)的第四框架區(qū)包含SEQ ID N0:9的氨基酸 98 至 107。
9. 權(quán)利要求1的抗體或片段，其中所述VH區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO:44。
10. 權(quán)利要求9的抗體或片段，其中所述VL區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO:46。
11. 權(quán)利要求9的抗體或片段，其中所述VL區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID N0:9。
12. 權(quán)利要求1的抗體或片段，其進(jìn)一步包含衍生自選自IgA、IgG、IgD、IgE或IgM抗 體亞型的抗體重鏈恒定（CH)區(qū)。
13. 權(quán)利要求12的抗體或片段，其中所述IgG亞型進(jìn)一步選自IgGl、IgG2、IgG3及 IgG4。
14. 權(quán)利要求13的抗體或片段，其中所述IgG亞型是IgGl。
15. 權(quán)利要求13的抗體或片段，其中所述IgG亞型包含至少一個(gè)改變Fc結(jié)構(gòu)域功能的 突變。
16. 權(quán)利要求12的抗體或片段，其中所述抗體或片段的重鏈包含氨基酸序列SEQ ID N0:57。
17. 權(quán)利要求1的抗體或片段，其進(jìn)一步包含抗體輕鏈恒定（CL)區(qū)。
18. 權(quán)利要求17的抗體或片段，其中所述CL區(qū)是k或XCL區(qū)。
19. 權(quán)利要求17的抗體或片段，其中所述抗體或片段的輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO:17。
20. 權(quán)利要求9的抗體或片段，其中所述VH區(qū)是由核酸序列SEQ ID NO:43編碼。
21. 權(quán)利要求1的抗體或片段，其中所述抗體或片段以至少KT6M、l(T7M、l(r8M、l(r 9M、 lO'M或l(TnM的Kd結(jié)合⑶F-8。
22. 權(quán)利要求1的抗體或片段，其中所述抗體或片段選自Fab、F(ab'）2、scFv、scFv_Fc、 scFv-CH、scFab、scFv-拉鏈、雙抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微型抗體、Fv及雙特異性抗體。
23. 權(quán)利要求1的抗體，其中由轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的所述抗體的量大于在類(lèi)似條件下產(chǎn)生 的其中VH區(qū)在Kabat位置108處包含甲硫氨酸的其它方面均相同的抗體的量。
24. 權(quán)利要求23的抗體，其中由轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的所述抗體的量超過(guò)在類(lèi)似條件下產(chǎn)生 的所述其它方面均相同的抗體的量至少約以下的量：1. 5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、 8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍及30倍。
25. 特異性結(jié)合GDF-8的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或片段包含：與氨基酸序列 SEQ ID NO:44至少95%相同的VH區(qū)，及與氨基酸序列SEQ ID NO:46至少95%相同的VL 區(qū)，其中所述VH區(qū)在Kabat位置108處包含亮氨酸。
26. 特異性結(jié)合⑶F-8的抗體，其包含由氨基酸序列SEQ ID NO:58限定的抗體重鏈及 由氨基酸序列SEQ ID NO:59限定的抗體輕鏈。
27. 權(quán)利要求26的抗體，其中所述抗體基本上由兩條各自由氨基酸序列SEQ ID NO: 58 限定的抗體重鏈及兩條各自由氨基酸序列SEQ ID N0:59限定的抗體輕鏈組成。
28. 藥物組合物，其包含權(quán)利要求1的抗體及藥物學(xué)可接受的載體。
29. 分離多核苷酸，其包含編碼特異性結(jié)合GDF-8的抗體或其片段的至少一條多肽鏈 的核酸序列，所述抗體或片段包含： 抗體重鏈可變（VH)區(qū)，其包含來(lái)自由氨基酸序列SEQ ID NO:44限定的所述VH區(qū)的第 一、第二及第三互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)， 其中所述VH區(qū)在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:44的殘基編號(hào)111 (Kabat位置108)的氨基酸位 置處包含亮氨酸；及 抗體輕鏈可變（VL)區(qū)，其包含來(lái)自由氨基酸序列SEQ ID NO:46限定的所述VL區(qū)的第 一、第二及第三互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)， 其中所述VL區(qū)在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:46的殘基編號(hào)100(Kabat位置100)的氨基酸位 置處包含甘氨酸。
30. 權(quán)利要求29的分離多核苷酸，其中編碼所述VH區(qū)的核酸序列是核酸序列SEQ ID NO: 43或SEQ ID NO: 49,且其中編碼所述VL區(qū)的核酸序列是核酸序列SEQ ID NO: 45或SEQ ID N0:51。
31. 權(quán)利要求29的分離多核苷酸，其進(jìn)一步包含編碼人類(lèi)抗體CH區(qū)的核酸序列。
32. 權(quán)利要求29的分離多核苷酸，其進(jìn)一步包含編碼人類(lèi)抗體CL區(qū)的核酸序列。
33. 權(quán)利要求32的分離多核苷酸，其中所述CL區(qū)由核酸序列SEQ ID NO: 16編碼。
34. 表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求29的多核苷酸。
35. 宿主細(xì)胞，其包含可操作連接至調(diào)節(jié)序列的權(quán)利要求29的多核苷酸。
36. 產(chǎn)生特異性結(jié)合GDF-8的抗體或其片段的方法，其包含培養(yǎng)權(quán)利要求35的宿主細(xì) 胞及回收由此產(chǎn)生的所述抗體或片段的步驟。
37. 增加哺乳動(dòng)物的肌肉質(zhì)量或強(qiáng)度的方法，其包含向哺乳動(dòng)物施用有效增加所述哺 乳動(dòng)物的肌肉質(zhì)量或強(qiáng)度的量的權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合片段。
38. 權(quán)利要求37的方法，其中所述肌肉是骨骼肌或心肌。
39. 權(quán)利要求37的方法，其中所述骨骼肌在呼吸中發(fā)揮作用。
40. 治療肌肉病癥的方法，其包含向需要治療肌肉病癥的對(duì)象施用治療有效量的權(quán)利 要求1的抗體或其抗原結(jié)合片段。
41. 權(quán)利要求40的方法，其中所述肌肉病癥選自肌營(yíng)養(yǎng)不良、肌萎縮、少肌癥、惡病質(zhì)、 肌肉耗損綜合征、年齡相關(guān)性肌肉質(zhì)量或強(qiáng)度損失及衰弱癥。
42. 權(quán)利要求41的方法，其中所述肌肉病癥是肌營(yíng)養(yǎng)不良。
43. 權(quán)利要求42的方法，其中所述肌營(yíng)養(yǎng)不良是杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy)〇
44. 權(quán)利要求43的方法，其中治療是有效提高所述對(duì)象在6分鐘步行測(cè)試中的表現(xiàn)。
45. 權(quán)利要求43的方法，其中所述抗體被施用給還也在用糖皮質(zhì)素治療的對(duì)象。
46. 預(yù)防肌肉病癥的方法，其包含向需要預(yù)防肌肉病癥的對(duì)象施用有效預(yù)防所述肌肉 病癥的量的權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合片段。
47. 權(quán)利要求46的方法，其中所述肌肉病癥選自肌營(yíng)養(yǎng)不良、肌萎縮、少肌癥、惡病質(zhì)、 肌肉耗損綜合征、年齡相關(guān)性肌肉質(zhì)量或強(qiáng)度損失及衰弱癥。
48. 權(quán)利要求47的方法，其中所述肌肉病癥是肌營(yíng)養(yǎng)不良。
49. 權(quán)利要求48的方法，其中所述肌營(yíng)養(yǎng)不良是杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良。
50. 治療或預(yù)防神經(jīng)肌肉病癥的方法，其包含向需要治療神經(jīng)肌肉病癥的對(duì)象施用治 療有效量的權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合片段。
51. 權(quán)利要求50的方法，其中所述神經(jīng)肌肉病癥是ALS。
52. 治療或預(yù)防代謝紊亂的方法，其包含向需要治療代謝紊亂的對(duì)象施用治療有效量 的權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合片段。
53. 權(quán)利要求52的方法，其中所述代謝紊亂選自2型糖尿病、代謝綜合征、綜合征X、胰 島素抵抗及葡萄糖耐量降低。
54. 治療或預(yù)防脂肪組織病癥的方法，其包含向需要治療脂肪組織病癥的對(duì)象施用治 療有效量的權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合片段。
55. 權(quán)利要求54的方法，其中所述脂肪組織病癥是肥胖癥。
56. 治療或預(yù)防骨丟失病癥的方法，其包含向需要治療骨丟失病癥的對(duì)象施用治療有 效量的權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合片段。
57. 權(quán)利要求56的方法，其中所述骨丟失病癥選自骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)減少、骨關(guān)節(jié)炎及骨 質(zhì)疏松相關(guān)性骨折。
58. 特異性結(jié)合⑶F-8的抗體，其包含： 由SEQ ID N0:44組成的抗體VH區(qū)及由SEQ ID N0:46組成的抗體VL區(qū)， 其中所述抗體在類(lèi)似條件下的表達(dá)水平高于包含由SEQ ID N0:7組成的VH區(qū)及由SEQ ID N0:9組成的VL區(qū)的其它方面均相同的第二抗體。
59. 權(quán)利要求58的抗體，其中所述抗體的表達(dá)水平比所述第二抗體高至少約1. 5倍、2 倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍或30 倍的量。
60. 權(quán)利要求59的抗體，其中當(dāng)在COS細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，所述抗體以所述第二抗體約12 倍表達(dá)。
61.權(quán)利要求59的抗體，其中當(dāng)在CHO細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，所述抗體以所述第二抗體約6倍 表達(dá)。
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【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2013年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月15日
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