專(zhuān)利名稱(chēng)：利用電荷排斥作用制備同二聚體蛋白混合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用電荷排斥作用制備同二聚體蛋白混合物的方法。
背景技術(shù)：
單克隆抗體藥物在近十五年內(nèi)增長(zhǎng)迅速，成為制藥行業(yè)的成長(zhǎng)點(diǎn)。自1996年起，一共有30個(gè)左右單抗藥物被批準(zhǔn)上市。其中有九個(gè)單抗藥物年銷(xiāo)售超過(guò)十億美元。2010年單抗藥物總銷(xiāo)售超過(guò)300億美元，并且年增長(zhǎng)率超過(guò)10%。由于單克隆抗體的靶標(biāo)特異性強(qiáng)，只能抑制單一靶點(diǎn)。而在腫瘤、自體免疫等多種疾病中，需要抑制多重信號(hào)通路來(lái)避免代償效應(yīng)。對(duì)于病毒感染疾病，由于病毒的高突變率，往往需要抑制多抗原位點(diǎn)來(lái)防止逃逸。因此，有以下幾種備選方案可以解決此類(lèi)問(wèn)題。一種備選方案是使用多克隆抗體，或通過(guò)改造抗體Fe段獲得異二聚體如雙特異抗體。還有一種方案是使用抗體混合物來(lái)治療，抗體混合物可包含兩種或更多種針對(duì)同一靶物上不同表位的抗體，或針對(duì)不同靶物的抗體的 混合物。US7262028記載了一種通過(guò)表達(dá)一種輕鏈和不同重鏈從單一宿主細(xì)胞克隆生成二價(jià)抗體或者二價(jià)抗體混合物的方法。US7262028中披露的發(fā)明提供了一種用于生成抗體組合的方法，可以對(duì)該抗體組合篩選在多種應(yīng)用中的有用性。W0/2010/084197則描述了一種從單一宿主細(xì)胞克隆生產(chǎn)包含兩種或者更多種不同抗體混合物的方法。其中一個(gè)實(shí)施方案中，為不同單價(jià)抗體的混合物。另外一種實(shí)施方案中，則為單價(jià)和二價(jià)抗體的混合物。US5789208和US6335163曾描述過(guò)一種表達(dá)多克隆抗體文庫(kù)的方法，用噬菌體展示載體表達(dá)抗體Fab片段的多克隆文庫(kù)，然后選擇對(duì)抗原的反應(yīng)性。所選擇的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因組合被以鏈接配對(duì)的方式大量轉(zhuǎn)移至提供恒定區(qū)基因的真核表達(dá)載體，以獲得完整多克隆抗體的子文庫(kù)。這一子文庫(kù)轉(zhuǎn)染入骨髓瘤細(xì)胞后，穩(wěn)定克隆便可以產(chǎn)生能被混合以獲得單克隆抗體混合物的多克隆抗體。盡管使用這一方法通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的混合群在理論上有可能直接從一個(gè)重組生產(chǎn)過(guò)程中獲得多克隆抗體，但在混合細(xì)胞群的穩(wěn)定性以及因此帶來(lái)的所產(chǎn)生的多克隆抗體的一致性方面可能存在潛在的問(wèn)題。在藥學(xué)上可接受的大規(guī)模(工業(yè))的方法中對(duì)整群不同細(xì)胞進(jìn)行控制是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。例如，細(xì)胞生長(zhǎng)速率和抗體產(chǎn)生速率等特性對(duì)非克隆群中所有單個(gè)克隆來(lái)說(shuō)應(yīng)保持穩(wěn)定，才能使多克隆抗體混合物中的抗體比率多少保持恒定。因此，盡管在本領(lǐng)域可能已經(jīng)認(rèn)識(shí)到混合抗體的需求，但還不存在可接受的解決方案以用藥學(xué)可接受的方式經(jīng)濟(jì)地制造抗體混合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于在單一重組宿主細(xì)胞中生成包含兩種或多種同二聚體蛋白或抗體混合物的方法，包括在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)至少兩種編碼具有不同CH3區(qū)的多肽的核酸構(gòu)建體；所述具有不同CH3區(qū)的多肽之間不含有形成二硫鍵或共價(jià)或穩(wěn)定非共價(jià)多肽鏈間鍵的氨基酸殘基；具有相同CH3區(qū)的所述多肽通過(guò)穩(wěn)定非共價(jià)多肽鏈間鍵形成所述同二聚體蛋白或抗體；所述穩(wěn)定非共價(jià)多肽鏈間鍵包括離子鍵。在上述方法中，所述多肽的CH3區(qū)均來(lái)源于人免疫球蛋白Fe段的CH3區(qū)，且其中最多有一種所述多肽的CH3區(qū)未經(jīng)改造，其余所述多肽的CH3區(qū)均經(jīng)過(guò)改造。在上述方法中，所述改造按照包括如下步驟的方法進(jìn)行I)獲得所述人免疫球蛋白Fe段CH3區(qū)第一鏈和/或第二鏈的界面氨基酸；2)從步驟I)獲得的所述界面氨基酸中選擇正負(fù)電荷配對(duì)的帶電氨基酸；3)從步驟2)獲得的所述正負(fù)電荷配對(duì)的帶電氨基酸中任選一對(duì)、兩對(duì)、三對(duì)或三對(duì)以上，將具有同一種CH3區(qū)的所述多肽上所選中的所述正負(fù)電荷配對(duì)的帶電氨基酸替換為帶相反電荷的帶電氨基酸；所述帶電氨基酸為L(zhǎng)ys(K)、Arg (R)、Asp⑶或Glu(E)。
在上述方法中，所述人免疫球蛋白的類(lèi)型為IgGl。在上述方法中，所述人免疫球蛋白Fe段的CH3區(qū)的所述正負(fù)電荷配對(duì)的帶電氨基酸為如下a)_h)的8對(duì)氨基酸a)第一鏈的第356位Glu (E)與第二鏈的第439位Lys⑷；b)第一鏈的第357位Glu(E)與第二鏈的第370位Lys(K)；c)第一鏈的第370位Lys(K)與第二鏈的第357位Glu(E)；d)第一鏈的第392位Lys⑷與第二鏈的第399位Asp⑶；e)第一鏈的第399位Asp⑶與第二鏈的第392位Lys⑷；f)第一鏈的第399位Asp⑶與第二鏈的第409位Lys⑷；g)第一鏈的第409位Lys⑷與第二鏈的第399位Asp⑶；h)第一鏈的第439位Lys(K)與第二鏈的第356位Glu(E)；上述8對(duì)氨基酸的位置是根據(jù)抗體Fe的KABAT編號(hào)所命名的。在上述方法中，所述人免疫球蛋白Fe段的CH3區(qū)的所述正負(fù)電荷配對(duì)的帶電氨基酸在序列表序列2中的位置為如下al)-hl)的8對(duì)氨基酸al)第一鏈的第161位Asp⑶與第二鏈的第244位Lys⑷；bl)第一鏈的第162位Asp⑶與第二鏈的第175位Lys⑷；Cl)第一鏈的第175位Lys (K)與第二鏈的第163位Glu (E)；dl)第一鏈的第197位Lys⑷與第二鏈的第204位Asp⑶；el)第一鏈的第204位Asp (D)與第二鏈的第197位Lys (K)；Π)第一鏈的第204位Asp⑶與第二鏈的第214位Lys⑷；gl)第一鏈的第214位Lys⑷與第二鏈的第204位Asp⑶；hi)第一鏈的第244位Lys(K)與第二鏈的第161位Glu(E)。在上述方法中，所述人免疫球蛋白Fe段的CH3區(qū)的所述正負(fù)電荷配對(duì)的帶電氨基酸在序列表序列4中的位置為如下a2)-h2)的8對(duì)氨基酸a2)第一鏈的第482位Lys⑷與第二鏈的第399位Asp⑶；b2)第一鏈的第413位Lys⑷與第二鏈的第400位Asp⑶；c2)第一鏈的第400位Glu (E)與第二鏈的第413位Lys⑷；d2)第一鏈的第442位Asp⑶與第二鏈的第435位Lys⑷；e2)第一鏈的第435位Lys⑷與第二鏈的第442位Asp⑶；f2)第一鏈的第452位Lys⑷與第二鏈的第442位Asp⑶；
g2)第一鏈的第442位Asp⑶與第二鏈的第452位Lys⑷；h2)第一鏈的第399位Glu (E)與第二鏈的第482位Lys⑷。在上述方法中，所述具有不同CH3區(qū)的多肽具體可為序列表序列2所示的多肽和序列表序列4中的第435位Lys (K)替換為Asp (D)、第452位Lys (K)替換為Asp (D)和第442位Asp (D)替換為L(zhǎng)ys (K)的多肽。本發(fā)明保護(hù)利用上述任一所述方法獲得的同二聚體蛋白或抗體混合物。所述的同二聚體FC包括人免疫球蛋白FC。同二聚體蛋白分子可以用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)手段從宿主細(xì)胞中純化。例如，當(dāng)同二聚體蛋白包含了 FC，蛋白則可以用蛋白A來(lái)純化。純化方法包括但不限于色譜技術(shù)如體積排阻、離子交換、親和色譜法及超濾法。本發(fā)明的同二聚體混合物的分離純化方法也包括上述各 種方法的適當(dāng)組合。所述的同二聚體蛋白包括FC，優(yōu)選人免疫球蛋白FC。在一般情況下，人免疫球蛋白FC區(qū)域的CH3區(qū)域多肽來(lái)源于野生型的人免疫球蛋白FC區(qū)域。野生型的人免疫球蛋白FC指發(fā)生在人群中的氨基酸序列，當(dāng)然FC序列在個(gè)體中會(huì)有一些細(xì)微的差異。本發(fā)明中人免疫球蛋白FC也包括對(duì)于野生型人免疫球蛋白FC序列的氨基酸個(gè)別的改變，比如，F(xiàn)C區(qū)域局部某些氨基酸的改變，如包括某些在糖基化位點(diǎn)突變的氨基酸，或者其他無(wú)義的突變；術(shù)語(yǔ)“人免疫球蛋白FC”指的是人免疫球蛋白鏈恒定區(qū)，特別是免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的羧基端或其中的一部分。例如，免疫球蛋白FC區(qū)可包括重鏈CH1、CH2、CH3、CH4的兩個(gè)或更多結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的組合。根據(jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類(lèi)，主要有5類(lèi)免疫球蛋白IgA，IgD, IgE, IgG和IgM，其中一些還可進(jìn)一步分成亞類(lèi)(同種型)，如IgG-1, IgG-2，IgG-3，IgG-4，IgA-I和IgA-2。從特定的免疫球蛋白類(lèi)別和亞類(lèi)中選擇特定的免疫球蛋白FC區(qū)在本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的范圍之內(nèi)。在具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明所用的人免疫球蛋白FC包括至少一個(gè)免疫球蛋白絞鏈區(qū)，一個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域和一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域，具體為人IgGl FC (圖I)。本發(fā)明涉及的宿主細(xì)胞為人上皮細(xì)胞系如293H，也可為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系(DHO)、骨髓瘤細(xì)胞、酵母細(xì)胞或原核細(xì)胞如E. Coli。本發(fā)明所述的用于生成同二聚體蛋白混合物的抗體原型，不僅僅是雙特異性抗體，也可以是雙特異性多肽抗體，雙特異性多肽等(見(jiàn)圖2)。本發(fā)明還涉及按照上述方法突變產(chǎn)生的同二聚體蛋白混合物，以及組成同二聚體抗體FC的單獨(dú)的多肽。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及編碼這些多肽的核酸序列。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及包含突變產(chǎn)生的組成同二聚體FC抗體混合物的單獨(dú)的多肽的藥物組合物。安驗(yàn)證明，在序列表序列4所示的ScFv-Fc蛋白上引入三個(gè)突變位點(diǎn)K435D/K452D/D442K時(shí)，與同一宿主細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)Fe蛋白后，經(jīng)非還原條件下SDS-PAGE電泳檢測(cè)，蛋白是以ScFv-Fc/ScFv-Fc和Fc/Fc同二聚體蛋白混合物的形式存在。本發(fā)明所提供的方法可在增加同二聚體含量的同時(shí)降低其他不需要的產(chǎn)物如異源二聚體的含量。同二聚體蛋白混合物可以同時(shí)作用于同一靶標(biāo)的不同表位，也可以通過(guò)不同形式的抗體結(jié)合不同來(lái)源的抗體同時(shí)抑制多個(gè)抗原的作用等，為腫瘤的免疫診斷及免疫治療方面提供新的方法和途徑。


圖I. IgGl抗體結(jié)構(gòu)及不同區(qū)域示意圖。圖2.包含F(xiàn)C單鏈的不同異二聚體蛋白組合現(xiàn)象。圖3為重組載體pcDNA3. I-SP-Fc的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為重組載體pcDNA3. I-ScFv-Fc的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5 為電泳檢測(cè)同二聚體(ScFv-Fc/ScFv-Fc, Fc/Fc)和異二聚體((ScFv-Fc/Fe)的結(jié)果。其中，泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)(最上面的3個(gè)片段從上到下依次為104KD、78KD、50KD)，泳道WT為表5中的組合I (未經(jīng)突變)，泳道1-5分別為表5中組合2_6。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、抗體Fe段上CH3區(qū)域突變氨基酸的選擇I、序列及結(jié)構(gòu)獲得從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)G3DB, www. pdb. org)中共獲得48個(gè)包含F(xiàn)e區(qū)域的人IgGl抗體晶體結(jié)構(gòu)，通過(guò)結(jié)構(gòu)相似性搜索算法(參考文獻(xiàn)Yuzhen Ye and Adam Godzik. FATCAT aweb server for flexible structure comparison and structure similaritysearching.Nucleic Acids Res. ,2004, 32 (Web Server issue) :W582_585.)，得出這 48 個(gè)抗體的 Fe 段的來(lái)自1DN2(PDB編號(hào))。2、界面氨基酸獲取用蛋白質(zhì)接觸氨基酸識(shí)別軟件CMA(網(wǎng)址為http://liRin. weizmann. ac. il/eimZ)，根據(jù)氨基酸作用的距離篩選并識(shí)別抗體(PDB編號(hào)1DN2)中CH3-CH3之間的氨基酸接觸。根據(jù)氨基酸接觸規(guī)則，界面氨基酸指?jìng)?cè)鏈重原子與另外一條鏈的任何一個(gè)氨基酸的重原子之間的距離小于一個(gè)閾值的一些氨基酸。本實(shí)施例的閾值選擇為4. 5A，也可以選擇5. 5 A (如文獻(xiàn)B· Erman, I. Bahar andR. L. Jernigan. Equilibrium states of rigidbodies with multiple interactionsites. Application to protein helices. J. Chem.Phys. 1997，107 :2046-2059.)。表I為通過(guò)氨基酸接觸篩選(即氨基酸距離小于4. 5A )的抗體1DN2的34個(gè)界面氨基酸，其中，鏈A和鏈B分別代表抗體1DN2的第一鏈和第二鏈。以下氨基酸位置是根據(jù)抗體Fe的KABAT編號(hào)所命名的。表I.抗體1DN2的CH3-CH3界面氨基酸列表
權(quán)利要求
1.一種用于在單一重組宿主細(xì)胞中生成包含兩種或多種同二聚體蛋白或抗體混合物的方法，包括在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)至少兩種編碼具有不同CH3區(qū)的多肽的核酸構(gòu)建體，所述具有不同CH3區(qū)的多肽之間不含有形成二硫鍵或共價(jià)或穩(wěn)定非共價(jià)多肽鏈間鍵的氨基酸殘基；具有相同CH3區(qū)的所述多肽通過(guò)穩(wěn)定非共價(jià)多肽鏈間鍵形成所述同二聚體蛋白；所述穩(wěn)定非共價(jià)多肽鏈間鍵包括離子鍵。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述多肽的CH3區(qū)均來(lái)源于人免疫球蛋白Fe段的CH3區(qū)，且其中最多有一種所述多肽的CH3區(qū)未經(jīng)改造，其余所述多肽的CH3區(qū)均經(jīng)過(guò)改造。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述改造按照包括如下步驟的方法進(jìn)行 1)獲得所述人免疫球蛋白Fe段CH3區(qū)第一鏈和第二鏈的界面氨基酸； 2)從步驟I)獲得的所述界面氨基酸中選擇正負(fù)電荷配對(duì)的帶電氨基酸； 3)從步驟2)獲得的所述正負(fù)電荷配對(duì)的帶電氨基酸中任選一對(duì)、兩對(duì)、三對(duì)或三對(duì)以上，將具有同一種CH3區(qū)的所述多肽上所選中的所述正負(fù)電荷配對(duì)的帶電氨基酸替換為帶相反電荷的帶電氨基酸；所述帶電氨基酸為L(zhǎng)ys(K)、Arg (R)、Asp(；D)和Glu(E)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述人免疫球蛋白的類(lèi)型為IgGl。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述人免疫球蛋白Fe段的CH3區(qū)的所述正負(fù)電荷配對(duì)的帶電氨基酸為如下a)_h)的8對(duì)氨基酸 a)第一鏈的第356位Glu(E)與第二鏈的第439位Lys⑷； b)第一鏈的第357位Glu(E)與第二鏈的第370位Lys(K)； c)第一鏈的第370位Lys(K)與第二鏈的第357位Glu(E)； d)第一鏈的第392位Lys⑷與第二鏈的第399位Asp⑶； e)第一鏈的第399位Asp⑶與第二鏈的第392位Lys⑷； f)第一鏈的第399位Asp⑶與第二鏈的第409位Lys⑷； g)第一鏈的第409位Lys⑷與第二鏈的第399位Asp⑶； h)第一鏈的第439位Lys⑷與第二鏈的第356位Glu(E)； 上述8對(duì)氨基酸的位置是根據(jù)抗體Fe的保守位置編號(hào)所命名的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5述的方法，其特征在于所述具有不同CH3區(qū)的多肽為序列表序列2所示的多肽和序列表序列4中的第435位Lys (K)替換為Asp (D)、第452位Lys (K)替換為Asp (D)和第442位Asp (D)替換為L(zhǎng)ys (K)的多肽。
7.利要求1-6任一所述方法獲得的同二聚體蛋白或抗體混合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了利用電荷排斥作用制備同二聚體蛋白混合物的方法。實(shí)驗(yàn)證明，在序列表序列4所示的ScFv-Fc蛋白上引入三個(gè)突變位點(diǎn)K435D/K452D/D442K時(shí)，與同一宿主細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)Fc蛋白后，經(jīng)非還原條件下SDS-PAGE電泳檢測(cè)，蛋白是以ScFv-Fc/ScFv-Fc和Fc/Fc同二聚體蛋白混合物的形式存在。本發(fā)明所提供的方法可在增加同二聚體含量的同時(shí)降低其他不需要的產(chǎn)物如異源二聚體的含量。同二聚體蛋白混合物可以同時(shí)作用于同一靶標(biāo)的不同表位，也可以通過(guò)不同形式的抗體結(jié)合不同來(lái)源的抗體同時(shí)抑制多個(gè)抗原的作用等，為腫瘤的免疫診斷及免疫治療方面提供新的方法和途徑。
文檔編號(hào)C12P21/00GK102851338SQ20121025859
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月25日
發(fā)明者徐霆, 須濤, 汪皛皛, 孫興魯, 范英, 曾燕 申請(qǐng)人:蘇州康寧杰瑞生物科技有限公司