專利名稱：一種用于活性電泳的高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于活性電泳的高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物。本發(fā)明還涉及微管蛋白作為高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物的用途。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種微管蛋白的用途。
微管蛋白是生物細(xì)胞中一種非常保持的水溶性球狀蛋白質(zhì)，分子量為55kDa。人們對(duì)微管蛋白的研究主要集中在它的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與功能的基礎(chǔ)研究上。過(guò)去一直認(rèn)為，微管蛋白在體外緩沖溶液中一般以二聚體形式存在；在25℃度至37℃溫度范圍，當(dāng)提供鳥嘌呤核苷三磷酸(GTP)時(shí)(或其他條件)，微管蛋白二聚體會(huì)不斷聚合，最后形成長(zhǎng)長(zhǎng)的微管。
我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)微管蛋白在水溶液(如純化微管蛋白用的PEM緩沖液，或常規(guī)電泳用的樣品緩沖液)中不僅有二聚體形式存在，還有單體和各種形式的寡聚體存在；而且這些不同形式的微管蛋白聚合體之間，分子量呈階梯狀增加，相鄰條帶差別為55kDa；微管蛋白的這些存在形式對(duì)溫度和pH的變化不敏感，在pH為7-10時(shí)，無(wú)論在普通冷柜(4-8°)條件下進(jìn)行電泳，還是在室溫條件進(jìn)行電泳，都能得到良好的結(jié)果。我們的研究證明從新鮮腦組織中純化的微管蛋白產(chǎn)品，非常適宜用作非變性蛋白質(zhì)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)物。
用聚合-解聚的方法從新鮮腦組織中純化微管蛋白，可參照Williams等報(bào)道的傳統(tǒng)方法(Meth.Enzymol，1982，85，Part B，376)。所用技術(shù)為常規(guī)技術(shù)，方法很成熟，已被國(guó)內(nèi)外專家、學(xué)者廣泛引用。
因而，本發(fā)明提供了一種用于活性電泳的高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物，它是微管蛋白的水溶液。其中，所述的水溶液的pH值最好為7-10?？梢允荘EM緩沖液，磷酸緩沖液，蛋白質(zhì)電泳緩沖液或者Tris-HCl緩沖液。對(duì)這些緩沖液沒(méi)有特別的限制，只要他們能夠?qū)⑷芤赫{(diào)節(jié)到所需要的pH值。
本發(fā)明還提供了微管蛋白作為高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物的用途。其中，所述的微管蛋白存在于水溶液中，例如，可以是PEM緩沖液，磷酸緩沖液，蛋白質(zhì)電泳緩沖液或者Tris-HCl緩沖液中。
較之目前市場(chǎng)上的其它分子量標(biāo)準(zhǔn)物，我們的產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)在于僅用一種材料、一套技術(shù)、一次實(shí)驗(yàn)，就能獲得含有6種不同分子量組分以上的產(chǎn)品。而其它分子量標(biāo)準(zhǔn)物必須用多種材料、多套技術(shù)、多次實(shí)驗(yàn)才能獲得。
圖2顯示不同pH條件下本產(chǎn)品的分子量分布(新制備的產(chǎn)品)。其中，A.用PIPES緩沖液配制的產(chǎn)品 B.含25％甘油的產(chǎn)品。MAmershamPharmacia Biotech公司高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物 1-5產(chǎn)品上樣pH值依次為5，7，9，10，12。
圖3顯示-20℃保存過(guò)的產(chǎn)品在不同pH條件下的電泳行為。其中，A.用PIPES緩沖液配制的產(chǎn)品 B.含25％甘油的產(chǎn)品。MAmershamPharmacia Biotech公司高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物 1-5本產(chǎn)品在不同pH值(5，7，9，10，12)下的電泳行為。
圖4顯示不同溫度電泳條件下本產(chǎn)品的電泳行為(-20℃保存過(guò)的產(chǎn)品)。其中，A.4℃下電泳 B.室溫下電泳。MAmersham PharmaciaBiotech公司高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物 1-5pH值分別為5，7，9，10，12
1mol/L PIPES，PH6.91.5mmol/L MgCl22mmol/L GTP20％DMSO二、所需儀器天平，勻漿器，冰箱，水浴鍋，高速冷凍離心機(jī)，超速離心機(jī)。三、工藝流程4℃勻漿→4℃高速離心→4℃超速離心→37℃水浴→30℃超速離心→冰浴→4℃超速離心→37℃水浴→30℃超速離心→冰浴→4℃超速離心→37℃水浴→30℃超速離心→冰浴→4℃超速離心四、操作步驟(一)天然高分子量標(biāo)準(zhǔn)物的初步純化1.取三個(gè)新鮮豬腦(約300克)，去除表面膜、血管及脂肪，然后用預(yù)冷的重蒸水沖洗。
2.在組織勻漿機(jī)中加入240ml 4℃預(yù)冷的PEM-4M緩沖液，將豬腦剪碎后置于其中，勻漿。勻漿液在4℃放置30分鐘。
3.將勻漿液在4℃下10,000g離心30分鐘。取上清液，4℃下100,000g離心1小時(shí)。
4.量取上清液體積V1，加ATP至2.5mmol/L，GTP至1mmol/L，37℃水浴1小時(shí)進(jìn)行聚合。
5.聚合溶液在30℃下100,000g離心1小時(shí)。
6.將沉淀溶解在1/4 V1冰冷的PEMG緩沖液中，冰水中解聚1小時(shí)(可用玻璃組織研磨器促進(jìn)解聚)。
7.將解聚溶液在4℃下100,000g離心1小時(shí)。取上清液，加入等體積PEM-8M緩沖液，并加入GTP至1mmol/L，37℃水浴1小時(shí)進(jìn)行二次聚合。
8.將二次聚合溶液在30℃下100,000g離心1小時(shí)。棄上清液，留沉淀。
9.將沉淀溶于4℃預(yù)冷的0.1M PEM緩沖液中，冰水中解聚1小時(shí)。
10.將解聚溶液在4℃下100,000g離心20分鐘。上清液即為經(jīng)過(guò)兩個(gè)聚合—解聚循環(huán)的粗產(chǎn)品。(二)天然高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物的進(jìn)一步純化1.在粗產(chǎn)品中加入等體積PMGD緩沖液，37℃水浴30分鐘進(jìn)行聚合。
2.將聚合溶液在30℃下50,000g離心30分鐘。棄上清液，量出沉淀體積(V2)3.在沉淀中加入4V2的0.1M PEM緩沖液，冰水水浴中解聚1小時(shí)。
4.將解聚溶液在4℃下50,000g離心20分鐘，上清液即為高純度終產(chǎn)品。(三)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定按常規(guī)方法對(duì)終產(chǎn)品進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，計(jì)算總得量。一般100克腦組織至少獲得16mg純品。五、產(chǎn)品保存和使用說(shuō)明(一)產(chǎn)品保存純化獲得的產(chǎn)品為水溶液，根據(jù)上面測(cè)得的蛋白質(zhì)濃度結(jié)果，將產(chǎn)品稀釋為2mg/ml(稀釋過(guò)程中注意加入甘油，使甘油終濃度為25％，因?yàn)楦视途哂斜Ｗo(hù)作用)，然后分裝，-20℃保存、待售。(二)產(chǎn)品說(shuō)明此高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物含一種蛋白，即微管蛋白，為水溶性。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠活性電泳分離顯示，該產(chǎn)品實(shí)際有效組分為6種以上，分子量由低到高依次為55kDa、110kDa、165kDa、220kDa、275kDa、330kDa等。相鄰條帶相差55kDa。(三)使用方法使用時(shí)，加入5倍的普通非變性電泳加樣緩沖液(0.31MTris-HCl，pH6.8；甘油50％，溴酚蘭0.05％)。使高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物濃度達(dá)1.5mg/ml。上樣量10μg-20μg/道，視電泳膠大小不同。六、產(chǎn)品鑒定(一)產(chǎn)品純度及分子量鑒定利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠變性電泳法鑒定純度。分離膠濃度7.5％。從

圖1(道2)看出，粗產(chǎn)品中尚有微量高分子量雜蛋白。但經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化，終產(chǎn)品為電泳一條帶(圖1，道3)，亞基分子量為55kDa。(二)產(chǎn)品分子量活性電泳分析活性電泳分離膠為7.5％。
從圖2(道2，道3)看出，在pH為7-9時(shí)，產(chǎn)品自下而上出現(xiàn)至少6條清晰的帶，比Sigma公司產(chǎn)品帶型分布(道M)均勻，且分子量范圍適中，分別為55kDa、110kDa、165kDa、220kDa、275kDa、330kDa。此外上面還可以看到分子量為385kDa，440kDa的條帶。(三)產(chǎn)品pH穩(wěn)定性分析用pH值分別為5.0，7.0，9.0，10.0，12的0.1M PEM緩沖液溶解產(chǎn)品沉淀，冰水中解聚后離心，所得上清即為不同pH條件下的樣品。4℃下對(duì)其進(jìn)行活性電泳。從圖2，3，4的道1-5看出，產(chǎn)品對(duì)酸堿不敏感，表現(xiàn)出很好的pH穩(wěn)定性。因此，可以保證在常規(guī)電泳pH的情況下標(biāo)準(zhǔn)物不發(fā)生組分解離等變化。(四)產(chǎn)品對(duì)冷凍儲(chǔ)存穩(wěn)定性的分析一般活性蛋白質(zhì)產(chǎn)品在25％甘油中能長(zhǎng)期冷凍保存。本產(chǎn)品在沒(méi)有甘油(圖3，A)和有甘油的情況下(圖3，B)，蛋白質(zhì)分子量圖譜分布不變。產(chǎn)品對(duì)-20℃凍存表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，證明可以-20℃凍存。(五)產(chǎn)品對(duì)電泳溫度的穩(wěn)定性分析上述結(jié)果已經(jīng)證明，產(chǎn)品在4℃條件下電泳時(shí)，表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性。在室溫下電泳時(shí)，從圖4B看出，產(chǎn)品的分子量分布沒(méi)有變化，證明產(chǎn)品對(duì)電泳溫度適應(yīng)性廣。七、附其它類似產(chǎn)品參考價(jià)格(一)Sigma(1999年)MW-ND-500KIT FOR Molecular Weights(14,000-500,000)，5mg包裝，價(jià)格為80.30美元。含7種組分，分子量分別為14kDa-29kDa-45kDa-66kDa-132kDa-272kDa-545kDa。(二)Amersham Pharmacia Biotech(2001年)HMW Native Marker kit，2.5mg包裝，價(jià)格為115美元。含5種組分，分子量分別為66kDa-140kDa-232kDa-440kDa-669kDa。
權(quán)利要求
1.一種用于活性電泳的高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物，它是微管蛋白的水溶液。
2.按照權(quán)利要求1所述的高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物，其中，所述的水溶液的pH值為7-10。
3.按照權(quán)利要求1所述的高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物，其中，所述的水溶液是PEM緩沖液，磷酸緩沖液，蛋白質(zhì)電泳緩沖液或者Tris-HCl緩沖液。
4.微管蛋白作為高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物的用途。
5.按照權(quán)利要求4所述的用途，其中，所述的微管蛋白存在于水溶液中。
6.按照權(quán)利要求4所述的用途，其中，所述的微管蛋白存在于PEM緩沖液，磷酸緩沖液，蛋白質(zhì)電泳緩沖液或者Tris-HCl緩沖液中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于活性電泳的高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物，它是微管蛋白的水溶液。本發(fā)明還提供了微管蛋白作為高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物的用途。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1412558SQ0113653
公開日2003年4月23日 申請(qǐng)日期2001年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月15日
發(fā)明者劉國(guó)琴, 曹勤紅, 任東濤 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)