專(zhuān)利名稱(chēng)：構(gòu)建肝癌蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法及其血清檢測(cè)應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及惡性腫瘤檢測(cè)領(lǐng)域，為一種新的非侵入性的檢測(cè)方法，利用人血清在體外對(duì)肝癌進(jìn)行早期發(fā)現(xiàn)，早期檢測(cè)，其敏感性和特異性均達(dá)到90％以上。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球每年約發(fā)生26萬(wàn)例，其中42％在中國(guó)。根據(jù)衛(wèi)生部的統(tǒng)計(jì)資料，近20年來(lái)我國(guó)每年約有11萬(wàn)人死于該病，在部分城市中占惡性腫瘤死亡率的第二位，部分農(nóng)村居第一位。由于肝癌起病多隱匿早期癥狀不明顯，一旦出現(xiàn)臨床癥狀多已屬中晚期常因此而錯(cuò)失治療良機(jī)。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是提高肝癌治療效果及長(zhǎng)期生存率的有效措施。
早期診斷是在疾病的早期確定其性質(zhì)、部位的過(guò)程。但肝癌早期常常沒(méi)有明確的癥狀，病人亦不主動(dòng)就診，直至癥狀出現(xiàn)時(shí)常常已非早期。在原發(fā)性肝癌的各種治療方法中，手術(shù)切除的療效已得到公認(rèn)。小肝癌切除后5年生存率可達(dá)50～60％；大肝癌也達(dá)到30％。然而，有80％左右的患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于晚期，從而喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)。因此，確定高危人群、尋找靈敏的篩查方法是早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療從而改善肝癌病人預(yù)后的關(guān)鍵。
原發(fā)性肝癌患者絕大部分伴有肝硬化，而乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染，食物中含有黃曲霉素，長(zhǎng)期嗜酒等目前已被公認(rèn)是肝癌發(fā)生的最危險(xiǎn)因素。我國(guó)對(duì)3631例肝癌患者統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，其中有乙型肝炎病史5年以上占87.9％，合并肝硬化者占85.5％，HBsAg陽(yáng)性者占74.8％，因此在我國(guó)，HBsAg陽(yáng)性者或有慢性肝炎病史者是發(fā)生肝癌的主要高危人群。應(yīng)用靈敏度高，特異度好，經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的方法篩選高危人群是提高肝癌患者預(yù)后的最佳方式。
甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)是一種肝癌相關(guān)抗原，它的出現(xiàn)帶動(dòng)了肝癌診斷和治療水平的改善，其臨床價(jià)值已得到肯定。但是近年來(lái)由于存在以下原因，使得AFP診斷肝癌的價(jià)值似乎較以往有所下降1)近年來(lái)二級(jí)預(yù)防工作取得了可喜成果，越來(lái)越多的早期肝癌不斷地被發(fā)現(xiàn)，而有大量研究表明PHC患者血清AFP含量一般與腫瘤大小呈正相關(guān)[5，6]。所以這些早期肝癌常常因?yàn)槟[瘤體積小而血清AFP含量不高或增高不明顯，造成臨床上AFP陰性肝癌病例所占的比重較前增加；2)AFP產(chǎn)量與肝癌細(xì)胞分化程度有關(guān)。高分化級(jí)癌細(xì)胞形態(tài)和功能與正常肝細(xì)胞相近，所以不合成或少合成AFP；低分化級(jí)的肝癌細(xì)胞由于喪失了合成AFP能力，所以血清AFP常呈陰性，只有中度分化級(jí)的肝癌細(xì)胞在形態(tài)和功能上近似胚肝細(xì)胞，因而合成AFP較多[7]。這可能是臨床上仍有部分中晚期肝癌患者血清AFP呈陰性的原因；3)隨著檢測(cè)方法靈敏度提高，在部分慢性肝炎和肝硬化等疾病患者血清中也可以檢測(cè)出一定含量的AFP。盡管在肝炎、肝硬化病例中，AFP達(dá)到肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)(＞400μg/L)的不多，有報(bào)道僅約3％，但AFP升高(20μg/L)的則可高達(dá)30％，使AFP在肝癌與良性肝占位鑒別診斷的價(jià)值下降。前兩者主要影響AFP診斷肝癌的敏感性，即假陰性增加；而后者則主要影響其特異性，即假陽(yáng)性增加。由于AFP存在上述缺點(diǎn)，使得其在肝癌的血清學(xué)診斷價(jià)值受到了一定的限制。顯然，尋找出比AFP更敏感，更特異的肝癌特異性指標(biāo)成為目前迫在眉睫的問(wèn)題。
20多年來(lái)肝癌其他標(biāo)志物的研究曾十分活躍，都希望能找到一個(gè)可靠的標(biāo)志物彌補(bǔ)AFP的不足。文獻(xiàn)報(bào)道較多的有γ2谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶同工酶II(GGT II)，異常凝血酶原(DCP)，α2L2巖藻糖苷酶，α12抗胰蛋白酶及5′2核苷酸磷酸二酯酶同工酶V等?？上н@些標(biāo)志物大多特異性不高。目前除GGT II、DCP等尚有應(yīng)用外，其余已少問(wèn)津。20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)AFP糖鏈結(jié)構(gòu)在肝癌與肝炎中有所不同，可藉植物凝集素親和電泳法加以區(qū)別，使用較多的如小扁豆凝集素(LCA)親和電泳法，即AFP異質(zhì)體的檢測(cè)，若LCA結(jié)合型AFP＞25％，則可提示為肝癌產(chǎn)生的AFP，對(duì)肝癌與肝炎的鑒別診斷有一定的作用。惟此法檢測(cè)僅適用于AFP濃度較高的患者。AFP單克隆抗體的檢測(cè)雖可用于AFP低濃度患者，但方法較為復(fù)雜而未能廣泛應(yīng)用。
人類(lèi)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，為腫瘤診斷提供了新的思路和手段。蛋白質(zhì)組學(xué)是現(xiàn)代科技前沿，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)的分析可以探察出疾病早期最微小的指標(biāo)和征兆。而實(shí)現(xiàn)這種診斷，首先要找出各種疾病的特殊標(biāo)志分子，其次需要有適合于臨床診斷的儀器設(shè)備。
目前對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究仍采用傳統(tǒng)技術(shù)，例如雙向電泳、質(zhì)譜。雙向電泳是一種癌癥早期鑒別腫瘤標(biāo)記物的新方法。雙向凝膠電脈雖然仍是目前可以分辨最多蛋白質(zhì)種類(lèi)的技術(shù)，并在技術(shù)上已有了很大的改進(jìn)，使其重復(fù)性和靈敏度大大提高，但這種方法不適于大規(guī)模的普查或臨床檢驗(yàn)，因?yàn)樗且环N費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且在實(shí)驗(yàn)室很難標(biāo)準(zhǔn)化的方法，無(wú)法將其做大量樣品的常規(guī)分析。質(zhì)譜在蛋白質(zhì)分析方面雖然具有高分辨率和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，但它需要在檢測(cè)之前對(duì)樣品進(jìn)行必要的純化，因而無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量的蛋白質(zhì)分析。
美國(guó)Ciphergen公司研發(fā)的基質(zhì)輔助激光解析離子化系統(tǒng)(SELDI)集分離純化和質(zhì)譜檢測(cè)于一身，這種技術(shù)是利用經(jīng)過(guò)特殊處理的固相支持物或芯片的基質(zhì)表面，根據(jù)蛋白質(zhì)物理、化學(xué)性質(zhì)的不同，選擇性地從待測(cè)生物樣品中捕獲配體，將其結(jié)合在芯片的固相基質(zhì)表面上，經(jīng)原位清洗和濃縮后，結(jié)合TOF-MS技術(shù)，對(duì)結(jié)合的多肽或蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析的原理是利用激光脈沖輻射使芯池中的分析物解吸形成荷電離子，根據(jù)不同質(zhì)荷比這些離子在儀器中飛行的時(shí)間長(zhǎng)短不一，由此繪制出一繞質(zhì)譜圖來(lái)。該圖經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件外理還可形成模擬譜圖，宇數(shù)據(jù)庫(kù)中的譜圖進(jìn)行對(duì)照，我們還能夠最終發(fā)現(xiàn)和捕獲新的疾病異性相關(guān)蛋白及其特征。整個(gè)測(cè)定過(guò)程一般可以在幾分鐘內(nèi)就全部完成，十分迅速，同時(shí)不會(huì)破壞所測(cè)定的蛋白質(zhì)。該技術(shù)除具有質(zhì)譜在分辨率和靈敏度方面的特別優(yōu)勢(shì)外，它還可以直接檢測(cè)相對(duì)原始的生物樣品，并可同時(shí)進(jìn)行多樣品、多蛋白的檢測(cè)。其最新型號(hào)的儀器已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的自動(dòng)化，每天可以進(jìn)行近千次的標(biāo)本檢測(cè)，從而提供了適合于臨床檢驗(yàn)的蛋白質(zhì)組研究工具。
SELDI進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)定所使用的是一種新的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，實(shí)際上是蛋白質(zhì)芯片和質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用的蛋白質(zhì)譜分析平臺(tái)，其核心是一系列稱(chēng)為Protein chip的蛋白質(zhì)芯片。蛋白質(zhì)芯片是以色譜原理設(shè)計(jì)的蛋白芯片，該芯片由金屬鋁制成，其長(zhǎng)度為8厘米，寬度為1厘米，上面刻有8個(gè)直徑2毫米的芯片點(diǎn)，其上覆蓋有不同性質(zhì)的介質(zhì)。根據(jù)芯片表面介質(zhì)的不同化學(xué)成分，可將其分為化學(xué)表面芯片和生物表面芯片。其中化學(xué)表面芯片又可分為疏水、親水、陽(yáng)離子、陰離子和金屬離子螯合芯片五種，用于檢測(cè)未知蛋白，并獲取蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜；生物表面分為抗體-抗原、受體-配體和DNA-蛋白質(zhì)芯片等種類(lèi)，可顯示與之相結(jié)合的抗原或配體的不同分子量亞型。蛋白質(zhì)芯片相當(dāng)于在質(zhì)譜分析前增加了一步色譜分離。在檢測(cè)過(guò)程中使用不同類(lèi)型的芯片對(duì)同一樣品進(jìn)行檢測(cè)可以獲得完全不同的結(jié)果，原因相當(dāng)于采用了不同的分離方法處理樣品。
SELDI可以克服二維凝膠電泳存在的內(nèi)在問(wèn)題，包括疏水性問(wèn)題、強(qiáng)酸性、強(qiáng)堿性的蛋白質(zhì)的分離、膜蛋白的分離問(wèn)題、低分子量檢測(cè)的靈敏性、低豐度蛋白質(zhì)的靈敏性問(wèn)題。蛋白質(zhì)只要與SELDI蛋白質(zhì)芯片陣列結(jié)合，就可通過(guò)電離——解吸飛行時(shí)間——質(zhì)譜儀檢測(cè)，并根據(jù)蛋白質(zhì)的質(zhì)量和電荷比(m/z)每一個(gè)蛋白質(zhì)的峰值明顯地分離并形成一個(gè)蛋白質(zhì)(保留在芯片上的蛋白質(zhì))的圖譜。
蛋白芯片在癌癥相關(guān)蛋白的研究領(lǐng)域內(nèi)進(jìn)展最快，國(guó)外學(xué)者將前列腺癌、卵巢癌患者與非癌對(duì)照者的血清或排泄物的樣本通過(guò)蛋白芯片儀進(jìn)行了研究，Petricoin III EF等用C16疏水性蛋白芯片分析了66例健康婦女、50例卵巢癌患者，圖譜采用534、989、2 111、2 251、2 465質(zhì)荷比(M/Z)蛋白峰綜合分析，靈敏度100％、特異性95％、預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率94％，同樣的標(biāo)本用CA125陰性預(yù)測(cè)值只有35％，且主要反映在年輕人組中，而CA125在良性盆腔疾病中的假陽(yáng)性率亦很高。Bao-Ling Adam應(yīng)用SELDI蛋白芯片系統(tǒng)在金屬表面芯片上確定了4.475kD，5.074kD，5.382kD，7.024kD，7.82kD，8.141kD，9.149kD，9.507kD，9.656kD等九個(gè)蛋白質(zhì)用于檢測(cè)前列腺癌，其靈敏度為83％，特異性為97％；而用PSA的靈敏度高于90％，但其特異性?xún)H僅為25％。
目前，在非侵入性肝癌的診斷中常有以下幾種方法1.血清學(xué)檢測(cè)甲胎蛋白(AFP)由Bergstrand于1956年在人胎兒血清中首次發(fā)現(xiàn)，于1964年在肝細(xì)胞癌病人血清中首次測(cè)得，現(xiàn)已成為臨床診斷肝癌方面最常用的腫瘤標(biāo)記物。其通常使用的截?cái)嘀禐?0ng/ml，其敏感性為65％，特異性為89％。AFP在臨床上應(yīng)用時(shí)間較長(zhǎng)，檢驗(yàn)方法成熟，在高危人群篩查方面有一定的優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)它也存在著一些不足，其一是敏感性較低(70％左右)，容易造成漏診。其二在一些良性肝病(病毒性肝炎，肝硬化等)、生殖性畸胎瘤、肝母細(xì)胞癌、胰腺癌、肺癌、腎癌、白血病患者中也可有升高，而我國(guó)病毒性肝炎、肝硬化患者較多，容易造成誤診。其余腫瘤標(biāo)志物如a-L-巖藻糖苷酶(AFU)、鐵蛋白(Ferritin)、CA19-9等的檢測(cè)結(jié)果未得到公認(rèn)。
2.B超檢測(cè)肝癌早期肝癌的聲像圖有如下幾個(gè)方面的特點(diǎn)(1)比較孤立的單個(gè)或兩個(gè)低回聲結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)反射明顯弱于周?chē)谓M織，形成一個(gè)類(lèi)圓形低回聲團(tuán)，邊界清晰，但邊緣不規(guī)則，內(nèi)部回聲不均勻[2]。(2)結(jié)節(jié)周?chē)Ｓ?62.5％)圓環(huán)狀低回聲暈。(3)肝臟的其它聲像圖表現(xiàn)常無(wú)明顯異常。但其對(duì)2厘米以下小肝癌無(wú)法檢測(cè)。并且檢測(cè)結(jié)果必須得到AFP檢測(cè)驗(yàn)證。
由于肝癌癌從細(xì)胞發(fā)生癌變到形成臨床病灶需較長(zhǎng)時(shí)間，如果能夠在人體甚至細(xì)胞未出現(xiàn)任何病變前診斷出肝癌前兆，將大大提高肝癌患者的生存期。由于血清具有取材方便，無(wú)創(chuàng)傷性，并可連續(xù)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，因此從血清中發(fā)現(xiàn)并檢測(cè)肝癌早期生物標(biāo)志物將把肝癌的早期診斷提高到一個(gè)新的水平，從而最終降低肝癌的發(fā)病率和死亡率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型，該模型為早期診斷肝癌提供了新的途徑和方法，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)記物提供了基礎(chǔ)。該模型能夠在人體甚至細(xì)胞未出現(xiàn)任何病變前診斷出肝癌前兆，大大提高肝癌患者的生存期；由于血清具有取材方便，無(wú)創(chuàng)傷性，并可連續(xù)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，因此從血清中發(fā)現(xiàn)并檢測(cè)肝癌早期生物標(biāo)志物將把肝癌的早期診斷提高到一個(gè)新的水平，從而最終降低肝癌的發(fā)病率和死亡率。
本發(fā)明提供的血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型由人血清蛋白質(zhì)組質(zhì)譜圖譜及生物信息學(xué)-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析方法組成。
本發(fā)明提供的肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型，其特征是該蛋白質(zhì)組指紋圖譜由5個(gè)質(zhì)荷比(M/Z)位于4064±20、5182±20、8815±20、8942±20和14046±20的蛋白質(zhì)(包括磷酸化，甲基化，乙?；揎椙盎蛐揎椇?所組成。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型構(gòu)建方法，包括①血清準(zhǔn)備；②血清標(biāo)本的質(zhì)譜檢測(cè)和數(shù)據(jù)的收集；③質(zhì)譜數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析。
本發(fā)明提供的構(gòu)建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法，血清準(zhǔn)備包括取一定量臨床病理確診的肝癌患者及正常對(duì)照人員外周血，室溫15℃～25℃析出血清后，離心吸取血清，分裝，-80℃冷凍備用；或直接進(jìn)行檢測(cè)處理；檢測(cè)時(shí)按一定濃度稀釋。
本發(fā)明提供的構(gòu)建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法，血清標(biāo)本的質(zhì)譜檢測(cè)和數(shù)據(jù)的收集包括用美國(guó)賽弗吉公司的弱陽(yáng)離子蛋白質(zhì)芯片WCX2；置入美國(guó)賽弗吉公司飛行質(zhì)譜儀，分析樣品血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜；利用表面增強(qiáng)激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)收集，激光強(qiáng)度為185，檢測(cè)敏感性為8。
本發(fā)明提供的構(gòu)建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析包括采用反向傳播(BP)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析。對(duì)比分析肝癌患者及健康人員血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜，獲得肝癌患者血清中特異的蛋白質(zhì)波峰；將發(fā)現(xiàn)的血清中特異的蛋白質(zhì)波峰進(jìn)行組合后形成肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型，采用反向傳播(BP)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析。采用肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型雙盲法進(jìn)行臨床篩選實(shí)驗(yàn)，確定該圖譜的靈敏度、特異度。
本發(fā)明與其他非侵入性肝癌的診斷方法比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明提供的質(zhì)譜模型，為早期診斷肝癌提供了新的途徑和方法，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)記物提供了基礎(chǔ)。(2)與以往的傳統(tǒng)的非侵入性方法比較具有較高的特異性與敏感性，其敏感性和特異性均達(dá)到90％以上，是一種在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上的診斷，對(duì)肝癌的早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷提供了新的方法和標(biāo)準(zhǔn)。(3)本發(fā)明模型的構(gòu)建方法設(shè)計(jì)合理，可行，是為降低我國(guó)肝癌的病死率、提高肝癌的治愈率、進(jìn)一步篩查肝癌提供了一種新的方法。(4)操作簡(jiǎn)便，成本低，可重復(fù)性好，患者痛苦小，可大幅度提高早期肝癌患者的檢出率，使肝癌患者的生存期進(jìn)一步延長(zhǎng)，甚至治愈。便于對(duì)高危人群進(jìn)行大規(guī)模的檢測(cè)。


圖1是利用血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型測(cè)定的病人與正常人在質(zhì)荷比為8815±20處的蛋白質(zhì)含量的差別示意圖。圖中字母C代表肝癌患者血清，N代表正常人血清。經(jīng)方差分析，肝癌組和正常人組蛋白質(zhì)含量差異有顯著性(P≤0.01)。
圖2是利用血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型測(cè)定的病人與正常人在質(zhì)荷比為4064±20處的蛋白質(zhì)含量的差別示意圖。圖中字母B代表肝癌患者血清，A代表正常人血清。經(jīng)方差分析，肝癌組和正常人組蛋白質(zhì)含量差異有顯著性(P≤0.01)。
圖3是為人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明將結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例1 本發(fā)明的一種檢測(cè)肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型及構(gòu)建方法1.血清的預(yù)處理血清標(biāo)本在冰浴中解凍后3000r/min離心5min，取6μl血清加入18μl尿素，充分混勻后冰浴30m，以WCX2結(jié)合緩沖液稀釋成120μl。
2.WCX-2蛋白芯片的預(yù)處理用5μl 10mmol/L HCI預(yù)處理WCX-2蛋白芯片點(diǎn)10min，用M-Q水洗芯片3次，將芯片安裝于Bioprocessor上，芯片每點(diǎn)加150uL結(jié)合緩沖液(50mmol/L乙酸鈉，pH4.0)，振蕩室溫下孵育5min，棄掉液體，重復(fù)1次。
3.芯片與樣品的結(jié)合加100μl稀釋好的樣品于芯片上，振蕩孵育。加入結(jié)合緩沖液進(jìn)行洗脫連續(xù)兩次，每次5min。卸去Bioprocessor，芯片用M-Q水洗滌2次，待芯片表面自然晾干后，各點(diǎn)加兩次0.5μl基質(zhì)，芯片表面干后，用蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)(PBS II型)進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析。
4.數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析蛋白質(zhì)芯片采用蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)PBSII型讀取數(shù)據(jù)。儀器每天用All-in-one蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行分子量校正，系統(tǒng)的質(zhì)量偏差為0.1％。檢測(cè)芯片時(shí)蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)設(shè)置如下激光強(qiáng)度180，檢測(cè)敏感度8，優(yōu)化分子質(zhì)量范圍3~10kD，最高分子量20kD，每個(gè)樣品收集30個(gè)點(diǎn)，采用Ciphergen proteinchip 3.0版本的分析軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù)，結(jié)果采用Biomarker Wizard分析肝癌和正常人血清的蛋白質(zhì)組指紋圖譜差異。
5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與正常人血清相比，對(duì)肝癌病人不表達(dá)或低表達(dá)的標(biāo)志蛋白分子，其敏感性定義為無(wú)或低表達(dá)標(biāo)志分子的病人數(shù)與全部肝癌病人數(shù)之百分比，特異性定義為有高表達(dá)標(biāo)志分子的正常人數(shù)與全部正常人數(shù)之百分比。采用Ciphergen proteinchip 3.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，不同組之間蛋白峰比較采用r檢驗(yàn)，確定兩組之間p值小于0.001時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
6.網(wǎng)絡(luò)參數(shù)的優(yōu)化對(duì)訓(xùn)練集用這多個(gè)變量建立一個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)采用反向傳播算法(用共軛梯度學(xué)習(xí)函數(shù)改進(jìn)Trainscg)。具體設(shè)置為共有4層，輸入輸出層，和兩個(gè)隱含層，每個(gè)隱含層有20個(gè)神經(jīng)元。每一層都采用正切S形傳遞函數(shù)(Tansig)。隨機(jī)初始化。輸出神經(jīng)元為1個(gè)，對(duì)應(yīng)健康人和肝癌患者的期望輸出值，分別設(shè)為-1和1。首先對(duì)訓(xùn)練標(biāo)本進(jìn)行人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練，得出一個(gè)模型，對(duì)模型進(jìn)行檢驗(yàn)，并利用此模型對(duì)未知血清進(jìn)行盲法分析。
實(shí)施例2 部分實(shí)例
1.試劑及芯片乙腈，三氟乙酸，尿素，蛋白酶抑制劑，Hepes，Tris-HCl，CHAPS和OGP均購(gòu)自Sigma公司。WCX2蛋白質(zhì)芯片購(gòu)于美國(guó)Ciphergen公司。蛋白標(biāo)準(zhǔn)品Aβ-(1-42)購(gòu)自Sigma公司。
2.標(biāo)本來(lái)源160例血清標(biāo)本中，60例肝細(xì)胞癌患者的血清標(biāo)本來(lái)自2002年8月～2003年8月廣州市各大醫(yī)院外科系統(tǒng)收治的初治患者；100例健康人的血清標(biāo)本取自經(jīng)體檢的志愿健康人群，觀察半年未見(jiàn)腫瘤發(fā)生。60例肝癌經(jīng)術(shù)后病理確診為肝細(xì)胞癌。肝細(xì)胞癌中男性85例，女性15例，年齡32～75歲，平均59.6歲。根據(jù)中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專(zhuān)業(yè)委員會(huì)《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》，Ia16例，Ib22例，Iia36例，Iib16例，IIIa10例。所有患者均于入院后第二天留取標(biāo)本，全部血清標(biāo)本均在清晨空腹治療前抽取，室溫放置2小時(shí)，3000r/min離心10min，吸取血清，按每管100μl分裝，血清儲(chǔ)存于-80℃低溫冰箱中。所有腫瘤患者在留取標(biāo)本前未接受過(guò)放化療。
3.蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)(美國(guó)Ciphergen公司生產(chǎn))實(shí)際上是一臺(tái)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜。它可以檢測(cè)IkD小分子物質(zhì)以及多肽，也可檢測(cè)500kD以下的大分子。它與蛋白質(zhì)芯片結(jié)合在一起構(gòu)成了蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)系統(tǒng)。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)軟件采用Matlab的NNTools，預(yù)先將數(shù)據(jù)進(jìn)行矩陣轉(zhuǎn)換后輸入NNTools。
4.蛋白質(zhì)芯片采用化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)芯片WCX2(弱陽(yáng)離子交換芯片)芯片，其表面結(jié)合有弱型陰離子羧基，可以和被分析物表面的正電荷基團(tuán)相互作用(如賴(lài)氨酸、精氛酸和組氛酸)而捕獲蛋白，可用于檢測(cè)高等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)和生物標(biāo)記分子。
實(shí)驗(yàn)方法1.血清的預(yù)處理血清標(biāo)本在冰浴中解凍后3000r/min離心5min，取6μl血清加入18μl尿素，充分混勻后冰浴30m，以WCX2結(jié)合緩沖液稀釋成120μl。
2.WCX-2蛋白芯片的預(yù)處理用5μl 10mmol/L HCI預(yù)處理WCX-2蛋白芯片點(diǎn)10min，用M-Q水洗芯片3次，將芯片安裝于Bioprocessor上，芯片每點(diǎn)加150uL結(jié)合緩沖液(50mmol/L乙酸鈉，pH4.0)，振蕩室溫下孵育5min，棄掉液體，重復(fù)1次。
3.芯片與樣品的結(jié)合加100μl稀釋好的樣品于芯片上，振蕩孵育。加入結(jié)合緩沖液進(jìn)行洗脫連續(xù)兩次，每次5min。卸去Bioprocessor，芯片用M-Q水洗滌2次，待芯片表面自然晾干后，各點(diǎn)加兩次0.5μl基質(zhì)，芯片表面干后，用蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)(PBS II型)進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析。
4.數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析蛋白質(zhì)芯片采用蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)PBSII型讀取數(shù)據(jù)。儀器每天用All-in-one蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行分子量校正，系統(tǒng)的質(zhì)量偏差為0.1％。檢測(cè)芯片時(shí)蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)設(shè)置如下激光強(qiáng)度185，檢測(cè)敏感度8，優(yōu)化分子質(zhì)量范圍3~10kD，最高分子量20kD，每個(gè)樣品收集30個(gè)點(diǎn)，采用Ciphergen proteinchip 3.0版本的分析軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù)，結(jié)果采用Biomarker Wizard分析肝癌和正常人血清的蛋白質(zhì)組指紋圖譜差異。
5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與正常人血清相比，對(duì)肝癌病人不表達(dá)或低表達(dá)的標(biāo)志蛋白分子，其敏感性定義為無(wú)或低表達(dá)標(biāo)志分子的病人數(shù)與全部肝癌病人數(shù)之百分比，特異性定義為有高表達(dá)標(biāo)志分子的正常人數(shù)與全部正常人數(shù)之百分比。采用Ciphergen proteinchip 3.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，不同組之間蛋白峰比較采用r檢驗(yàn)，確定兩組之間p值小于0.001時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。取4064±20、5182±20、8815±20、8942±20和14046±20的蛋白質(zhì)作為鑒別肝癌與健康人血清蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組指紋圖譜。
6、網(wǎng)絡(luò)參數(shù)的優(yōu)化對(duì)訓(xùn)練集用這5個(gè)變量建立一個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，參見(jiàn)圖3。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)采用反向傳播算法(用共軛梯度學(xué)習(xí)函數(shù)改進(jìn)Trainscg)。具體設(shè)置為共有4層，輸入層2、輸出層3，和兩個(gè)隱含層3-2、3-2，每個(gè)隱含層有20個(gè)神經(jīng)元，有3個(gè)連接權(quán)重值5、6、7，每一層都采用正切S形傳遞函數(shù)(Tansig)。隨機(jī)初始化。輸出神經(jīng)元為1個(gè)，對(duì)應(yīng)健康人和肝癌患者的期望輸出值，分別設(shè)為健康人-1和肝癌1。首先對(duì)100例標(biāo)本進(jìn)行人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練，得出一個(gè)模型，對(duì)模型進(jìn)行檢驗(yàn)，并利用此模型對(duì)60例未知血清進(jìn)行盲法分析。
5、盲法分析方法對(duì)60例血清標(biāo)本(包括肝癌患者與健康人)進(jìn)行盲法預(yù)測(cè)，應(yīng)用相同的技術(shù)路線與收集數(shù)據(jù)的方法，用已確定的聚類(lèi)模型對(duì)60例血清的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜進(jìn)行聚類(lèi)，同樣得到5個(gè)分子量的峰值，將數(shù)據(jù)導(dǎo)出后，進(jìn)行矩陣轉(zhuǎn)換，再導(dǎo)入已建立的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，輸出預(yù)測(cè)值。
一結(jié)果1.血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜所有芯片在PBS-II SELDI質(zhì)譜儀(Ciphergen)進(jìn)行數(shù)據(jù)的讀取，每個(gè)標(biāo)本均收集30次，共檢測(cè)到160個(gè)不同質(zhì)荷比(M/Z)的峰值，所有數(shù)據(jù)均保存在同一個(gè)文件中，部分圖譜參見(jiàn)圖1，在圖1中共有24例樣本，N代表的12例為健康人的血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖，C代表的12例為肝癌患者的。原始數(shù)據(jù)先用Proteinchip Software 3.0(Ciphergen)做校正(總離子強(qiáng)度及分子量的均一化)。對(duì)2k-20k的峰值，用Proteinchip Software 3.0的biomark wizard過(guò)濾噪音，設(shè)置初始的噪音過(guò)濾值為5，第二次的噪音過(guò)濾值為2，以10％為最小閾值。聚類(lèi)共產(chǎn)生54個(gè)分子量的峰值圖譜。
2.人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)100例訓(xùn)練組的血清標(biāo)本的蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)經(jīng)矩陣轉(zhuǎn)換后，輸入MATLAB的NNTools中，進(jìn)行訓(xùn)練，經(jīng)過(guò)254次后模型達(dá)到我們?cè)O(shè)定的值，檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷恼`差低于1×10-8。將100例血清標(biāo)本的蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)用此模型進(jìn)行檢驗(yàn)，輸出值為-1和1，-1為健康人，1為肝癌患者，結(jié)果所有肝癌患者和健康人都被準(zhǔn)確地分類(lèi)。(見(jiàn)表1)表1 100例血清標(biāo)本應(yīng)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的輸出值

3.盲法分析結(jié)果60例未知的血清標(biāo)本應(yīng)用已確定的方法進(jìn)行血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜的測(cè)定，對(duì)每例血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入已建立的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型中，進(jìn)行預(yù)測(cè)，30例肝癌病人中28例，30例健康人中有29例被準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2表2 60例未知的血清標(biāo)本應(yīng)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型輸出值

計(jì)算該方法的敏感性為93％(28/30)，特異性為97％(29/30)。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建肝癌蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法及其在肝癌患者血清檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征是該血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型由人血清蛋白質(zhì)組質(zhì)譜圖譜及生物信息學(xué)-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析方法組成，可以應(yīng)用于肝癌患者的血清學(xué)早期檢測(cè)和篩查。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型，其特征是該蛋白質(zhì)組指紋圖譜由4064±20、5182±20、8815±20、8942±20和14046±20的5個(gè)質(zhì)荷比峰的蛋白質(zhì)所組成。
3.如權(quán)利要求1和2所述的構(gòu)建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法，其特征是①血清準(zhǔn)備；②血清標(biāo)本的質(zhì)譜檢測(cè)和數(shù)據(jù)的收集；③質(zhì)譜數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析。
4.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法，其特征是取一定量臨床病理確診的肝癌患者及正常對(duì)照人員外周血，室溫15℃～25℃析出血清后，離心吸取血清，分裝，-80℃冷凍備用；或直接進(jìn)行檢測(cè)處理；檢測(cè)時(shí)按一定濃度稀釋。
5.如權(quán)利要求3構(gòu)建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法，其特征是用美國(guó)賽弗吉公司的弱陽(yáng)離子蛋白質(zhì)芯片WCX2；置入美國(guó)賽弗吉公司飛行質(zhì)譜儀，分析樣品血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜；利用表面增強(qiáng)激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)收集，激光強(qiáng)度為185，檢測(cè)敏感性為8。
6.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法，其特征是采用反向傳播(BP)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析。對(duì)比分析肝癌患者及健康人員血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜，獲得肝癌患者血清中特異的蛋白質(zhì)波峰；將發(fā)現(xiàn)的血清中特異的蛋白質(zhì)波峰進(jìn)行組合后形成肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型，采用反向傳播(BP)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析。采用肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型雙盲法進(jìn)行臨床篩選實(shí)驗(yàn)，確定該圖譜的靈敏度、特異度。
7.如權(quán)利要求1和2所述的構(gòu)建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法，其特征是該模型可用于肝癌患者的血清學(xué)檢測(cè)和篩查。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對(duì)肝癌進(jìn)行檢測(cè)的非侵入性新方法構(gòu)建肝癌蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型及并應(yīng)用于肝癌患者的血清檢測(cè)。該血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型由人血清蛋白質(zhì)組質(zhì)譜圖譜及生物信息學(xué)—人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析方法組成，可以應(yīng)用于肝癌患者的血清學(xué)早期檢測(cè)和篩查。該蛋白質(zhì)組指紋圖譜由五個(gè)質(zhì)荷比(M/Z)4064±20、5182±20、8815±20、8942±20和14046±20的蛋白質(zhì)所組成。肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型構(gòu)建方法包括①血清準(zhǔn)備；②血清標(biāo)本的質(zhì)譜檢測(cè)和數(shù)據(jù)的收集；③質(zhì)譜數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)—人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析。該模型能夠在人體甚至細(xì)胞未出現(xiàn)任何病變前診斷出肝癌前兆，大大提高肝癌患者的生存期；由于血清具有取材方便，無(wú)創(chuàng)傷性，并可連續(xù)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，因此從血清中發(fā)現(xiàn)并檢測(cè)肝癌早期生物標(biāo)志物將把肝癌的早期診斷提高到一個(gè)新的水平，其對(duì)肝癌檢測(cè)的敏感性和特異度均達(dá)到90％以上，從而為最終降低肝癌的發(fā)病率和死亡率提供了新的方法與標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號(hào)G01N30/88GK1654953SQ20051003325
公開(kāi)日2005年8月17日 申請(qǐng)日期2005年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月24日
發(fā)明者郭愛(ài)林 申請(qǐng)人:郭愛(ài)林