本發(fā)明涉及中藥質(zhì)量控制領(lǐng)域，具體涉及尪痹片指紋圖譜的建立方法以及利用指紋圖譜法鑒定尪痹片的方法。
背景技術(shù)：
：尪痹片是由地黃、熟地黃、續(xù)斷、附子(制)、獨活、骨碎補、桂枝、淫羊藿、防風、威靈仙、皂刺、羊骨、白芍、狗脊(制)、知母、伸筋草、紅花十七味藥材組成，具有補肝腎、強筋骨、祛風濕、通經(jīng)絡(luò)的功效，用于肝腎不足、久痹體虛、關(guān)節(jié)疼痛、局部腫大、僵硬畸形、去伸不利及類風濕性關(guān)節(jié)炎見有上述癥候者。該制劑現(xiàn)執(zhí)行標準(2015版《中國藥典》)對成分進行定量分析，但其有效化學(xué)成分復(fù)雜，單個化學(xué)成分的定量分析不能全面反映該藥品的整體信息，中藥指紋圖譜是指某些中藥材或中藥制劑經(jīng)適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖。中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評價中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。"整體性"和"模糊性"為其顯著特點。為了更好地對尪痹片的質(zhì)量進行控制，亟需提供精確有效地尪痹片指紋圖譜。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種尪痹片指紋圖譜的建立方法以及一種利用指紋圖譜法鑒定尪痹片的方法。本發(fā)明所述的尪痹片由地黃、熟地黃、續(xù)斷、附子(制)、獨活、骨碎補、桂枝、淫羊藿、防風、威靈仙、皂刺、羊骨、白芍、狗脊(制)、知母、伸筋草、紅花17味藥物組方，經(jīng)多次水提，醇沉，濃縮至稠膏后，加適量輔料混勻，制成顆粒、干燥，壓制成片，而得。優(yōu)選地，所述尪痹制劑的處方具體為：地黃20份、熟地黃20份、續(xù)斷15份、附片或黑順片15份、獨活10份、骨碎補15份、桂枝10份、淫羊藿15份、白芍12份、防風10份、威靈仙15份、皂角刺10份、羊骨20份、制狗脊15份、知母15份、伸筋草10份、紅花10份。本發(fā)明提供的尪痹片指紋圖譜的建立方法，采用高效液相色譜法獲得多個生產(chǎn)批次尪痹片的色譜圖，選擇各批次尪痹片色譜圖中均存在的色譜峰作為共有峰，用平均值計算法生成尪痹片的指紋圖譜。所述生產(chǎn)批次優(yōu)選為10個。所述高效液相色譜法中：固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相由有機相和水相組成，所述有機相為乙腈，所述水相為濃度0.05～0.15％的磷酸水溶液。為了獲得分離效果好的色譜圖，所述流動相的洗脫方式為梯度洗脫；具體為：0～40min，所述有機相的體積百分比由5％增加至18％；40～60min，所述有機相的體積百分比由18％增加至25％；60～80min，所述有機相的體積百分比由25％增加至40％；80～90min，所述有機相的體積百分比由40％增加至80％；90～95min，所述有機相的體積百分比維持在80％。所述方法中，進樣體積為5～15μl，優(yōu)選為10μl。所述方法中，流動相流速為0.8～1.2ml/min，優(yōu)選為1.0ml/min。所述方法中，采用紫外檢測器進行檢測，檢測波長為230～240nm，優(yōu)選為235nm。本發(fā)明所述方法還包括樣品溶液的配制，具體為：取尪痹片樣品，研磨成粉末狀，以1g：20～30ml溶于乙醇，經(jīng)超聲處理后靜置放冷，過濾后收集濾液，用乙醇定容，即得。其中，所述尪痹片樣品粉末與乙醇的比例優(yōu)選為1g：25ml。為了確保所述尪痹片樣品中的主要成分有效溶出且減少破壞和損失，所述超聲處理的頻率優(yōu)選為35～45kHz。本發(fā)明所述方法獲得的色譜圖中，理論塔板數(shù)按淫羊藿苷峰計算應(yīng)不低于3000。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述尪痹片指紋圖譜的建立方法包括以下步驟：(1)取尪痹片樣品，取包衣后研磨成粉末，精密稱定1.0g，置具塞錐形瓶中精密加入稀乙醇溶液25ml，稱定重量，以頻率40kHz超聲處理60min，取出放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取濾液，即得樣品溶液；按照上述方法分別配制多個生產(chǎn)批次尪痹片的樣品溶液；(2)將所述樣品溶液以10μl進樣，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈和0.1％磷酸水溶液組成流動相，在流動相流速1ml/min、柱溫30℃條件下按以下方式進行梯度洗脫，并在波長235nm條件下進行檢測，獲得色譜圖：0～40min，所述乙腈的體積百分比由5％增加至18％；40～60min，所述乙腈的體積百分比由18％增加至25％；60～80min，所述乙腈的體積百分比由25％增加至40％；80～90min，所述乙腈的體積百分比由40％增加至80％；90～95min，所述乙腈的體積百分比維持在80％；(3)分別獲得各個生產(chǎn)批次尪痹片色譜圖，選擇各批次尪痹片色譜圖中均存在的色譜峰作為共有峰，用平均值計算法生成尪痹片的指紋圖譜。采用本發(fā)明優(yōu)選方案獲得的尪痹片指紋圖譜中，包括以下特征峰(相對保留時間)：1(0.10)，2(0.13)，3(0.14)，4(0.19)，5(0.21)，6(0.22)，7(0.26)，8(0.32)，9(0.35)，10(0.41)，11(0.42)，12(0.43)，13(0.48)，14(0.49)，15(0.51)，16(0.66)，17(0.70)，18(0.74)，19(0.79)，20(0.98)，21(S峰)(1.00)，22(1.08)，23(1.09)，24(1.24)。其中，第1～4、8～12、17、19～24號峰均為單峰，基本達到基線分離，5～6、13～14、16、18號峰不是單峰，未達到基線分離；且1～2、7～8、10、12、17～21號峰峰高較高，其余號峰較低。本發(fā)明同時保護所述方法建立的尪痹片指紋圖譜。本發(fā)明進一步提供一種利用指紋圖譜法鑒定尪痹片的方法，該方法采用高效液相色譜法獲得待測樣品的色譜圖，將所述色譜圖與尪痹片的指紋圖譜進行比較。本發(fā)明所述鑒定包括針對尪痹片的真?zhèn)舞b別、生產(chǎn)過程控制和成品質(zhì)量評價。所述尪痹片的指紋圖譜優(yōu)選采用本發(fā)明提供的方法建立。所述獲得待測樣品的色譜圖的高效液相色譜法中：固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相由有機相和水相組成，所述有機相為乙腈，所述水相為濃度0.05～0.15％的磷酸水溶液。所述流動相的洗脫方式為梯度洗脫；具體為：0～40min，所述有機相的體積百分比由5％增加至18％；40～60min，所述有機相的體積百分比由18％增加至25％；60～80min，所述有機相的體積百分比由25％增加至40％；80～90min，所述有機相的體積百分比由40％增加至80％；90～95min，所述有機相的體積百分比維持在80％。所述方法中，進樣體積為5～15μl，優(yōu)選為10μl。所述方法中，流動相流速為0.8～1.2ml/min，優(yōu)選為1.0ml/min。所述方法中，采用紫外檢測器進行檢測，檢測波長為230～240nm，優(yōu)選為235nm。本發(fā)明所述方法還包括待測樣品溶液的配制，具體為：取待測樣品，研磨成粉末狀，以1g：20～30ml溶于乙醇，經(jīng)超聲處理后靜置放冷，過濾后收集濾液，用乙醇定容，即得。其中，所述待測樣品粉末與乙醇的比例優(yōu)選為1g：25ml。為了確保所述待測樣品中的主要成分有效溶出且減少破壞和損失，所述超聲處理的頻率優(yōu)選為35～45kHz。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述利用指紋圖譜法鑒定尪痹片的方法包括以下步驟：(1)取待測樣品，取包衣后研磨成粉末，精密稱定1.0g，置具塞錐形瓶中精密加入稀乙醇溶液25ml，稱定重量，以頻率40kHz超聲處理60min，取出放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取濾液，即得待測樣品溶液；(2)將所述待測樣品溶液以10μl進樣，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈和0.1％磷酸水溶液組成流動相，在流動相流速1ml/min、柱溫30℃條件下按以下方式進行梯度洗脫，并在波長235nm條件下進行檢測，獲得色譜圖：0～40min，所述乙腈的體積百分比由5％增加至18％；40～60min，所述乙腈的體積百分比由18％增加至25％；60～80min，所述乙腈的體積百分比由25％增加至40％；80～90min，所述乙腈的體積百分比由40％增加至80％；90～95min，所述乙腈的體積百分比維持在80％；(3)將步驟(2)所得色譜圖與尪痹片的指紋圖譜進行比較，以鑒定所述待測樣品的真?zhèn)位騼?yōu)劣。本發(fā)明提供的方法采用高效液相色譜法，建立的尪痹片指紋圖譜中共有峰至少有24個，能有效地表征尪痹片的質(zhì)量，補充了HPLC含量測定以外的成分，有利于全面監(jiān)控藥物的質(zhì)量；且指紋圖譜注重各個構(gòu)成指紋特征峰的前后順序和相互關(guān)系，注重整體面貌特征，既避免了因測定個別化學(xué)成分而判定尪痹片質(zhì)量的片面性，又減少了為質(zhì)量達標而人為處理的可能性，可應(yīng)用于尪痹片產(chǎn)品的真?zhèn)舞b別，生產(chǎn)過程控制和成品質(zhì)量評價。本發(fā)明方法具有簡便、精密度高、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好的優(yōu)點。附圖說明圖1為實施例1所得尪痹片指紋圖譜；圖2為實驗例1所得不同色譜柱考察圖譜；圖3為實驗例1所得全波長掃描圖譜；圖4為實驗例1所得提取溶劑考察圖譜；圖5為實驗例1所得提取方法考察圖譜；圖6為實驗例1所得提取時間考察圖譜；圖7為實驗例1所得洗脫系統(tǒng)考察圖譜；圖8為實驗例1所得洗脫流速考察圖譜；圖9為實驗例1所得不同柱溫考察圖譜；圖10為實驗例3所得的原始圖譜；圖11為實驗例3所得的匹配后圖譜；圖12為實驗例3所得的流動相、溶劑空白、二倍保留時間的供試品圖譜；圖13為實驗例3所得的相關(guān)性研究色譜圖。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實施例以及實驗例中，采用的儀器為：高效液相色譜儀，Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)；紫外檢測器，VWDG1314A。采用的試劑為：淫羊藿苷對照品，中國藥品生物制品檢定所，批號110737-200415；乙腈，色譜純，CaledoninCanada產(chǎn)品；甲醇，色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；乙醇，分析純北京化工廠產(chǎn)品；水，超純水。藥品來源：本發(fā)明用尪痹片的批號分別為160107、151107、151214、160102、160201、160109、151208、151102、151101、151103，均由遼寧好護士集團有限公司生產(chǎn)。參照物：通過調(diào)研尪痹片17味組方藥水提取后的化學(xué)成分特點，在結(jié)合《中國藥典》2015年版淫羊藿苷為尪痹片含量測定下指標成分，含量較穩(wěn)定，且在圖譜中保留時間適中、分離度較好，因此選擇淫羊藿苷作為參照物。實施例1本實施例提供一種尪痹片指紋圖譜的建立方法，其中包括：參照物溶液的制備：精密稱取淫羊藿苷5.01mg，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻；再從中精密量取1ml，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得0.05mg/ml參照物溶液。樣品溶液的制備：取尪痹片樣品(去包衣，研細)約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中精密加入稀乙醇溶液25ml，稱定重量，超聲處理(功率200W，頻率40kHz)1h，取出放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得樣品溶液；分別制備各批次尪痹片的樣品溶液。測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，記錄95min的色譜圖，并將色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，選擇不同批次尪痹片的色譜圖中均存在的色譜峰作為共有峰，用平均值計算法生成尪痹片指紋圖譜。尪痹片指紋圖譜測定的色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以0.1％磷酸水為流動相B，按下表1進行梯度洗脫；流速1ml/min；柱溫30℃；檢測波長235nm；理論塔板數(shù)按淫羊藿苷峰計算應(yīng)不低于3000。表1：梯度洗脫參數(shù)本實施例獲得的尪痹片指紋圖譜如圖1所示。實施例2本實施例提供一種利用實施例1所得尪痹片指紋圖譜鑒定尪痹片的方法，具體為：(1)取待測樣品，取包衣后研磨成粉末，精密稱定1.0g，置具塞錐形瓶中精密加入稀乙醇溶液25ml，稱定重量，以頻率40kHz超聲處理60min，取出放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取濾液，即得待測樣品溶液；(2)將所述待測樣品溶液以10μl進樣，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈和0.1％磷酸水溶液組成流動相，在流動相流速1ml/min、柱溫30℃條件下按以下方式進行梯度洗脫，并在波長235nm條件下進行檢測，獲得色譜圖：0～40min，所述乙腈的體積百分比由5％增加至18％；40～60min，所述乙腈的體積百分比由18％增加至25％；60～80min，所述乙腈的體積百分比由25％增加至40％；80～90min，所述乙腈的體積百分比由40％增加至80％；90～95min，所述乙腈的體積百分比維持在80％；(3)將步驟(2)所得色譜圖與實施例1所得尪痹片指紋圖譜進行比較，以鑒定所述待測樣品的真?zhèn)位騼?yōu)劣。實驗例1：色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗1)色譜柱的考察選擇了AgilentExtend-C18(250×4.6mm,5μm)色譜柱、AgelaDurashellC18(250×4.6mm,5μm)色譜柱和Luna(2)C18(250×4.6mm,5μm)色譜柱三種色譜柱進行了考察，結(jié)果AgelaDurashellC18(250×4.6mm,5μm)色譜柱分離效果及峰形較好，故選用AgelaDurashellC18(250×4.6mm,5μm)色譜柱。色譜圖見圖2。2)檢測波長的考察除檢測波長條件為其他與供試品進行色譜檢測步驟基本相同。通過對樣品進行190～600nm全波長掃描，并對等吸收圖進行比較，發(fā)現(xiàn)在235nm下各個峰均能較好的體現(xiàn)，且基線平穩(wěn)，故選235nm作為尪痹片飲片指紋圖譜的檢測波長。色譜圖見圖3。3)提取溶劑的考察除提取溶劑條件外其他與供試品進行色譜檢測的條件基本步驟相同。取樣品(批號：160107)，約1g，精密稱定3份，分別精密加入95％乙醇、甲醇、稀乙醇溶液25ml，稱定重量，超聲1h，取出放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，測定，以色譜峰峰形、色譜峰個數(shù)和主峰峰面積為評價指標進行分析，結(jié)果，稀乙醇溶液提取的有效成分最多，且峰面積較大，故選稀乙醇溶液作為提取溶劑。色譜圖見圖4。4)提取方法的考察除提取方法條件外其他與供試品進行色譜檢測的條件基本步驟相同。取樣品(批號：160107)，約1g，精密稱定3份，精密加入稀乙醇溶液25ml，稱定重量，分別選擇選擇了溫浸法、超聲法和回流提取法提取1h，取出放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，測定。結(jié)果，三種方法提取的有效成分相近，且峰面積相差不大，故選擇操作最為簡便的超聲法提取尪痹片樣品。色譜圖見圖5。5)超聲時間的考察除提取時間條件外其他與供試品進行色譜檢測的條件基本步驟相同。取樣品(批號：160107)，約1g，精密稱定3份，精密加入稀乙醇溶液25ml，稱定重量，分別超聲法提取30min、60min、90min，取出放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，測定。結(jié)果以超聲60min提取的大多數(shù)有效成分峰面積最大，故選擇超聲時間為60min。色譜圖見圖6。6)洗脫系統(tǒng)的選擇除洗脫系統(tǒng)外其他與供試品進行色譜檢測的條件基本步驟相同。選擇三種流動相系統(tǒng)：乙腈-水梯度系統(tǒng)、乙腈：0.5％磷酸水-0.4％三乙胺水梯度系統(tǒng)和乙腈-0.1％磷酸水梯度系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-0.1％磷酸水梯度系統(tǒng)為佳，各色譜峰分離度好，保留時間適中，故選擇乙腈-0.1％磷酸水梯度系統(tǒng)為流動相。色譜圖見圖7。7)流速的考察除流速條件外其他與供試品進行色譜檢測的條件基本步驟相同。流速對分離的影響較小，以1.0mL/min流速較為合適。色譜圖見圖8。8)柱溫的考察除柱溫條件外其他與供試品進行色譜檢測的條件基本步驟相同。柱溫對分離的影響較小，以30℃柱溫較為合適。色譜圖見圖9。實驗例2：方法學(xué)考察1)穩(wěn)定性試驗取尪痹片樣品(批號：160107)，按正文供試品溶液的制備方法制備，分別在0、2、4、6、12、24小時進樣，檢測指紋圖譜，共測定6個時間點，計算各主要色譜峰的相對保留時間和相似度，計算結(jié)果見表2。結(jié)果表明供試品溶液在室溫條件下24小時穩(wěn)定性良好，各色譜峰的相似度均符合指紋圖譜的要求。表2：穩(wěn)定性考察各色譜峰的相似度2)精密度實驗取尪痹片樣品(批號：160107)，按正文供試品溶液的制備方法制備，連續(xù)進樣6次，檢測指紋圖譜，計算主要色譜峰的相對保留時間和相似度，計算結(jié)果見表3。結(jié)果表明儀器精密度良好，各色譜峰的相似度均符合指紋圖譜的要求。表3：精密度考察各色譜峰的相似度S1S2S3S4S5S6指紋圖譜S11.0000.9880.9890.9960.9890.9770.996S20.9881.0000.9970.9860.9930.9690.995S30.9890.9971.0000.9890.9950.9700.996S40.9960.9860.9891.0000.9880.9800.996S50.9890.9930.9950.9881.0000.9730.996S60.9770.9690.9700.9800.9731.0000.984指紋圖譜0.9960.9950.9960.9960.9960.9841.0003)重現(xiàn)性試驗取尪痹片樣品(批號：160107)，按正文供試品溶液的制備方法制備供試品6份，檢測指紋圖譜，計算主要色譜峰的相對保留時間和相似度，結(jié)果見表4。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好，各色譜峰的相對保留時間和色譜峰的相似度均符合指紋圖譜的要求。表4：重復(fù)性考察各色譜峰的實驗例3：尪痹片指紋圖譜的測定通過方法學(xué)驗證，證明此方法可行，因此我們對10批尪痹片飲片進行了指紋圖譜的檢測。取批號分別為160107、151107、151214、160102、160201、160109、151208、151102、151101、151103的尪痹片，按照樣品溶液進行處理，得樣品溶液，分別精密吸取各批次樣品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，記錄95min的色譜圖，并將色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，選擇各批次尪痹片的色譜圖中均存在的色譜峰作為共有峰，用平均值計算法生成尪痹片的指紋圖譜，色譜圖見圖10和11，結(jié)果見表5。表5：尪痹片10批樣品指紋圖譜相似度以下分別是流動相、空白溶劑、二倍保留時間的供試品(圖12)(批號：160107)的圖譜。二倍保留時間的供試品的圖譜證明供試品在95min后再無其他色譜峰。1)參照指紋圖譜的選擇對10批尪痹片樣品指紋圖譜的檢測結(jié)果進行了分析、比較，選擇飲片批號為160107的供試品的指紋圖譜作為參照指紋圖譜，因為該供試品相對保留時間較接近于各批供試品的平均相對保留時間，且分離度較好，為較典型的指紋圖譜。2)共有指紋峰的標定對10批尪痹片樣品指紋圖譜的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10批尪痹片比較相似，沒有特別明顯的差異。取每批供試品指紋圖譜中都出現(xiàn)的典型色譜峰作為共有指紋峰，共24個共有峰，其中21號峰為淫羊藿苷的色譜峰，以“S”表示，各色譜峰分別以1～24的序號表示。共有峰的峰號(相對保留時間)：1(0.10)，2(0.13)，3(0.14)，4(0.19)，5(0.21)，6(0.22)，7(0.26)，8(0.32)，9(0.35)，10(0.41)，11(0.42)，12(0.43)，13(0.48)，14(0.49)，15(0.51)，16(0.66)，17(0.70)，18(0.74)，19(0.79)，20(0.98)，21(S峰)(1.00)，22(1.08)，23(1.09)，24(1.24)。部分共有峰的峰形描述：1-4、8-12、17、19-24均為單峰，基本達到基線分離，5-6、13-14、18號峰不是單峰，未達到基線分離，1-2、7-8、10、12、17-21號峰峰高較高，其余號峰較低。3)尪痹片的指紋圖譜相似度檢測按樣品指紋圖譜檢測方法，對10批尪痹片的指紋圖譜進行了檢測，結(jié)果，10批尪痹片的指紋圖譜與共有模式比較的相似度均大于0.90，故規(guī)定尪痹片的指紋圖譜相似度不低于0.90。4)相關(guān)性研究尪痹片是由地黃、熟地黃、續(xù)斷、附子(制)、獨活、骨碎補、桂枝、淫羊藿、防風、威靈仙、皂刺、羊骨、白芍、狗脊(制)、知母、伸筋草、紅花17味藥物組方而成。為了更明確尪痹片的物質(zhì)基礎(chǔ)組成來源，本研究對尪痹片成品的指紋圖譜與處方組成中17味藥材的相應(yīng)的指紋圖譜進行了對比研究，結(jié)果表明尪痹片指紋圖譜的各色譜峰，在相應(yīng)的藥材中均有良好的體現(xiàn)，色譜圖見圖13。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實施方式及試驗，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當前第1頁1 2 3