一種小電珠蛋白酶解反應(yīng)器的制備方法及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬蛋白質(zhì)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小電珠蛋白酶解反應(yīng)器及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]相對(duì)于基因組學(xué)，蛋白組學(xué)可以在更深層次對(duì)生物體進(jìn)行研究，解決基因組學(xué)不能回答的問(wèn)題，目前已經(jīng)成為化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展最快的研究領(lǐng)域之一 [I]。蛋白組學(xué)最重要的任務(wù)之一就是建立廣泛生物來(lái)源的大量蛋白質(zhì)的快速高效鑒定技術(shù)，肽譜分析是蛋白組研究策略中通常采用的方法。通常，蛋白被酶解成多肽，然后用質(zhì)譜分析酶解液中的多肽，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜，與蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后可對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定。常規(guī)溶液酶解需要時(shí)間為12-16小時(shí)，耗時(shí)較長(zhǎng)，不適合蛋白大批量分析和鑒定。而且溶液酶解會(huì)導(dǎo)致蛋白酶的自我分解，產(chǎn)生干擾多肽片段，故建立高效的蛋白酶解新技術(shù)對(duì)基于質(zhì)譜的肽譜分析具有十分重要的意義[2，3]。
[0003]最近的研究主要集中在將蛋白酶固定在不同的基體表面以提高酶解效率[3?6]，酶解時(shí)間可顯縮短到幾分鐘，而酶解結(jié)果與傳統(tǒng)溶液酶解結(jié)果相當(dāng)。采用固定化酶技術(shù)來(lái)酶解和鑒定蛋白效率高，可顯著提高酶的穩(wěn)定性，最大限度地降低酶的自我分解，此外，固定的蛋白酶可重復(fù)使用。通常蛋白酶(主要是胰蛋白酶)被固定在芯片、毛細(xì)管和磁性納米顆粒表面，然后與蛋白溶液作用進(jìn)行酶解[3?6 ]，酶解時(shí)間可大幅縮短。
[0004]目前，各種電磁波也被用于促進(jìn)溶液中的蛋白酶解[7，8]。電磁波是由同相且互相垂直的電場(chǎng)與磁場(chǎng)在空間中衍生發(fā)射的震蕩粒子波，是以波動(dòng)的形式傳播的電磁場(chǎng)，電磁波是能量的一種重要形式，根據(jù)波長(zhǎng)電磁波可分為無(wú)線電波、微波、紅外線、可見(jiàn)光、紫外線、X-射線和伽馬射線等，其中微波已被廣泛用于促進(jìn)蛋白溶液酶解[8]。由于溶液酶解使用的蛋白酶直接與蛋白溶液混合，酶不能重復(fù)使用。此外，蛋白酶的自降解也會(huì)產(chǎn)生干擾多肽片段。于是，建立基于固定化酶的蛋白快速酶解新技術(shù)具有十分重要的實(shí)際意義。小電珠通常作為手電筒和儀器電源指示燈的光源，主要由玻璃燈泡、燈絲和金屬底座等構(gòu)成，燈泡內(nèi)抽成真空后填充少量惰性氣體以防止鎢燈絲的蒸發(fā)和氧化。小電珠屬白熾燈，是熱輻射光源，具有連續(xù)的光譜能量分布，當(dāng)電流通過(guò)鎢燈絲時(shí)，燈絲被加熱到很高的溫度，釋放出以紅外線為主的電磁波。但其僅將15%左右的電能轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生可見(jiàn)光，其余約75%的電能被轉(zhuǎn)換為紅外線輻射到環(huán)境中去[9~10]。于是，我們想到將胰蛋白酶等蛋白酶酶固定到小電珠玻璃燈泡表面，利用小電珠發(fā)出的紅外線作為能量來(lái)源加速燈泡表面的蛋白酶解。
[0005]本項(xiàng)目將蛋白酶通過(guò)共價(jià)鍵固定在小電珠燈泡外的殼聚糖涂層表面，制備用于紅外輔助蛋白高效酶解的反應(yīng)器。小燈珠不僅是固定蛋白酶的載體，還可產(chǎn)生紅外線。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未發(fā)現(xiàn)有基于小電珠的蛋白酶解反應(yīng)器的報(bào)道。該反應(yīng)器已與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用，成功用于幾種蛋白和人血清的酶解。由于酶通過(guò)共價(jià)鍵固定，其自身酶解被抑制，故可使用較大的酶量，使酶解效率大幅提高。該反應(yīng)器可將蛋白質(zhì)的酶解時(shí)間從傳統(tǒng)的溶液酶解的12小時(shí)以上大幅度降低到5分鐘，大大節(jié)約了酶解時(shí)間，提高了工作效率。本發(fā)明提出的小電珠蛋白酶解反應(yīng)器具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低廉、制作簡(jiǎn)便、操作簡(jiǎn)便、酶解效率高和樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，可為蛋白組學(xué)中蛋白的高效酶解和高通量鑒定提供新的技術(shù)手段。
[0006]參考文獻(xiàn)
[1]P.Kahn, Science 270(1995)369?370.[3]ff.Qu, H.Bao, L.Y.Zhang, G.Chen, Chem.Eur.J.18(2012)15746-15752.[2]G.ff.Slysz, D.F.Lewis, D.C.Schriemer, J.Proteome.Res.5(2006)1959-
1966.[3]S.Wang, Z.Chen, P.Y.Yang, G.Chen, Proteomics 8(2008)1785-1788.[4]J.Chen, Z.Y.Yu, L.Y.Zhang, G.Chen, Curr.Chem.B1l.3(2009)291-
301.[5]H.Z.Fan, F.N.Yao, S.Y.Xu, G.Chen, Talanta.117(2013)119-126.[6]S.Lin, G.P.Yao， D.ff.Qi, Y.Li, C.H.Deng, P.Y.Yang, X.M.Zhang,Anal.Chem.80(2008)3655-3665.[7]G.P.Yao, C.H.Deng, X.M.Zhang, P.Y.Yang, Angew.Chem.1nt.Ed.49(2010)8185-8189.[8]Q.ff.Chen, T.Liu, Curr.Genomics 12(2011)380-390.[9]J.J.Greffet, R.Carminati , K.Joulain, J.P.Mulet, S.P.Mainguy, Y.Chen, Nature 416(2002 61-64.[10]B.ff.Kim, K.P.Chang, H.N.Chang, B1process Eng.17(1997)343-348.0

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提出一種能夠批量、低成本加工，且可顯著提高蛋白酶解效率的小電珠蛋白酶解反應(yīng)器及其制備方法。
[0008]本發(fā)明提出的小電珠蛋白酶解反應(yīng)器的制備方法，具體步驟為:
(1)將小電珠玻璃燈泡焊接兩根電源導(dǎo)線后，插入塑料管中，使玻璃燈泡部分裸露在夕卜，在塑料管口和玻璃燈泡接觸處通過(guò)涂絕緣膠使小電珠密封固定在塑料管中；
(2)將安裝在塑料管中的小電珠玻璃燈泡依此用乙醇和水清洗后晾干，浸于殼聚糖浸涂液中，殼聚糖浸涂液由殼聚糖溶解于乙酸水溶液中得到;浸涂后取出，自然晾干或通電點(diǎn)亮小電珠使浸涂溶液在電珠表面干燥成膜;然后放入氫氧化鈉溶液處理，得含游離伯氨基的殼聚糖涂層;將帶有殼聚糖涂層的小電珠燈泡浸于交聯(lián)劑戊二醛溶液中一定時(shí)間，使其醛基化，并用水清洗;最后將其浸于含蛋白酶溶液中一定時(shí)間，使蛋白酶共價(jià)鍵固定，制得小電珠酶反應(yīng)器。
[0009]將小電珠酶解反應(yīng)器接通電點(diǎn)亮，插入直徑略大于玻璃燈泡部分直徑的盛有蛋白質(zhì)溶液的小管或多孔板的小圓孔中，即構(gòu)成基于小電珠的紅外輔助蛋白高效酶解系統(tǒng)。
[0010]電珠發(fā)出的紅外線可啟動(dòng)并加速電珠表面的異相蛋白酶解，酶解時(shí)間從傳統(tǒng)水浴酶解的12小時(shí)以上大幅縮短到5分鐘。
[0011]本發(fā)明，步驟(I)中所述小電珠的額定電壓為1-15V，額定功率為0.1-2 W，小電珠的電源可為交流電和直流電。小電珠玻璃燈泡可為圓柱形或球形，直徑為2-10 _。
[0012]本發(fā)明，步驟(I)中所述的塑料管材質(zhì)可為聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、高密度聚乙稀、有機(jī)玻璃或ABS塑料(S卩丙稀腈-丁二稀-苯乙稀共聚物)等多種材質(zhì)，與小電珠金屬底座連接一端內(nèi)部直徑略大于金屬底座直徑。
[0013]本發(fā)明，步驟(I)中所述的絕緣膠可為502膠水(S卩α-氰基丙烯酸乙酯)、環(huán)氧樹(shù)脂、EVA(乙烯-乙酸乙烯共聚物)熱熔膠以及單組份或雙組分硅橡膠等。
[0014]本發(fā)明，步驟(2)中所述殼聚糖浸涂液的質(zhì)量百分濃度為0.1%_2%，溶解殼聚糖的乙酸溶液中乙酸濃度為殼聚糖濃度的1-2倍。
[0015]本發(fā)明，步驟(2)中所述小電珠玻璃燈泡表面的殼聚糖涂層厚度為1-200微米，可通過(guò)殼聚糖溶液的濃度和浸涂次數(shù)控制，浸涂次數(shù)為ι-?ο次。
[0016]本發(fā)明，步驟(2)中所述小電珠玻璃燈泡表面每次浸涂殼聚糖溶液的時(shí)間為0.5-2分鐘，每次浸涂后需取出并于室溫放置10-20分鐘或?qū)葱‰娭轭~定電壓通電點(diǎn)亮1-5分鐘，使浸涂溶液在電珠表面干燥成膜。
[0017]本發(fā)明，步驟(2)中所述的氫氧化鈉溶液濃度為0.01-0.3mol/L，有涂層的小電珠在氫氧化鈉溶液中的處理時(shí)間為0.5-10分鐘，溫度為10-30 °C，可得含大量游離伯氨基的殼聚糖涂層。
[0018]本發(fā)明，步驟(2)中所述的交聯(lián)劑戊二醛溶液的濃度為1-20mg/mL。有殼聚糖涂層的小電珠在戊二醛溶液中浸制時(shí)間為2-20分鐘，溫度為10-300C，可得含醛基的醛基化殼聚糖涂層。
[0019]本發(fā)明，步驟(2)中所述蛋白酶可為胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白水解酶。
[0020]本發(fā)明，步驟(2)中所述的蛋白酶的濃度為0.5-20mg/mL，修飾有醛基化殼聚糖涂層的小電珠玻璃燈泡在蛋白酶中的浸制時(shí)間為10-60分鐘，溫度為0