專利名稱：一種小麥優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基基因及其表達(dá)的蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種小麥優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基基因及其表達(dá)的蛋白。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)鞘澜绲谝淮蠹Z食作物，而小麥高分子量谷蛋白亞基是直接影響小麥品質(zhì) 的重要因子。小麥高分子量谷蛋白亞基(High-Molecular-Weight-Glutenin Subunit, HMW-GS)的類型和數(shù)量直接關(guān)系到面筋的彈性和強(qiáng)度，對(duì)面粉的烘烤品質(zhì)具有重要作用。 Payne等(1984)發(fā)現(xiàn)僅占全部谷蛋白10%的HMW-GS就決定了面包烘烤品質(zhì)的43%，而與 蛋白總量一起則共同決定了面包加工品質(zhì)變異的68%左右。小麥基因組中編碼HMW-GS的 Glu-I復(fù)合基因位點(diǎn)(Glu-Al、Glu-Bl、Glu-Dl)及其不同等位基因編碼的HMW-GS對(duì)烘烤品 質(zhì)的貢獻(xiàn)大小不同，其中以5+10亞基組合對(duì)面包烘烤品質(zhì)貢獻(xiàn)最大，具有決定性作用，因 此5亞基被認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)亞基。但是，我國(guó)目前小麥面粉的烘烤品質(zhì)普遍較差，這與我國(guó)品種缺少優(yōu)質(zhì)的HMW-GS 有關(guān)，因此創(chuàng)造與發(fā)掘新的優(yōu)質(zhì)谷蛋白亞基編碼基因，并開展相關(guān)生化、農(nóng)學(xué)、分子生物學(xué) 等方面研究、探討優(yōu)質(zhì)的分子機(jī)理，對(duì)于培育優(yōu)質(zhì)小麥新品種具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種小麥優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白業(yè)基基因及 其表達(dá)的蛋白，具有該基因的小麥能夠提高其面粉的烘烤品質(zhì)，在濕面筋含量、Zeleny沉降 值、粉質(zhì)儀面團(tuán)形成時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間等面粉烘烤加工品質(zhì)主要指標(biāo)上都具有明顯的提高。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種具有SEQID NO 1所示核酸 序列的小麥優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基基因。本發(fā)明的從小麥品系W958中克隆一個(gè)高分子量麥谷蛋白亞基新基因1Dx5’，該基 因編碼亞基5，，全長(zhǎng)為2505bp (含有1個(gè)終止密碼子)，該基因長(zhǎng)度比1Dx5 (長(zhǎng)度為2520bp) 要小18bp，同時(shí)比1Dx2(長(zhǎng)度為2517bp)要小15bp。研究表明，該基因編碼的蛋白具有833 個(gè)氨基酸，分子量為774. SKDa0蛋白的1_21氨基酸為信號(hào)肽區(qū)域，N-端為含有88個(gè)氨基 酸殘基非重復(fù)區(qū)，686個(gè)氨基酸殘基的高度重復(fù)的中央?yún)^(qū)，C-端為含有1個(gè)Cys (半胱氨酸) 的42個(gè)氨基酸殘基非重復(fù)區(qū)。中央?yún)^(qū)含有χ-型、y_型亞基所具有的重復(fù)結(jié)構(gòu)，有22個(gè)六 肽PGQGQQ，有3個(gè)GYYPTS/PLQQ九肽。W958是我們培育的種間遠(yuǎn)緣雜交(四倍體硬粒小麥 T. durum Desf. X六倍體普通小麥T. aestivum L)優(yōu)良品系，該品系在ID染色體上具有父 母本沒有的新型亞基，由于此亞基在SDS-PAGE電泳中具有和5亞基一樣的電泳遷移率，因 此我們將該亞基命名為5’亞基，將其編碼基因命名為1Dx5’。一種具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的小麥優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基基因 所表達(dá)的蛋白。與1Dx2編碼的蛋白相比，本蛋白在80位氨基酸殘基處為脯氨酸，346位氨 基酸為精氨酸，394位氨基酸為谷氨酸，451位氨基酸為精氨酸，而在673位則與1Dx5編碼的蛋白相同，比1Dx2編碼的蛋白少6個(gè)氨基酸。SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺 凝膠電泳)結(jié)果表明1Dx5’編碼的蛋白亞基5’電泳遷移率與1Dx5編碼的亞基5相似，與 1Dx2編碼的亞基2有顯著差別。同時(shí)，蛋白飛行時(shí)間質(zhì)譜(MOLDI-TOLF)結(jié)果表明該成熟蛋白的準(zhǔn)確分子量為86815Da，明顯小于1Dx5 (87188Da)和1Dx2 (87023Da)。這與蛋白序列的推導(dǎo)結(jié)果相似。一種具有SEQ ID NO :1所示核酸序列的小麥優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基基因的制備方法，包括下述步驟1.種子基因組DNA提取。a.干種子30mg(取胚乳部分)，研成粉沫，轉(zhuǎn)入2ml離心管中。b.加入 200μ 1 提取緩沖液(200mM Tris-HCl pH7. 5,2. 88M NaCl,25mM EDTA, 0. 5% SDS)浸泡 30min。c.加入600μ 1提取緩沖液，劇烈震蕩lmin，4°C 12000rpm離心lOmin，取上清液
至新管。d.加入等體積預(yù)冷的Tris飽和酚/氯仿/異戊醇(Tris飽和酚、氯仿、異戊醇的 體積比為25 24 1)，混勻，4°C 12000rpm離心lOmin，小心將上清轉(zhuǎn)入新管。e.加入等體積預(yù)冷氯仿/異戊醇(氯仿、異戊醇的體積比為24 1)，混勻，4°C 12000rpm離心lOmin，上清至新管。f.向上清液中加入600 μ 1預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒幾次，-20°C沉淀30min，4°C IOOOOrpm離心，棄上清。g.用500μ1 70%的乙醇清洗DNA沉淀，4°C 8000rpm離心5min，重復(fù)一次。h.沉淀放超凈工作臺(tái)中室溫干燥。i.加入 50 μ 1 滅菌 ddH20，4°C溶解 12h。j. 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度。2. PCR 擴(kuò)增(1)引物設(shè)計(jì)HMW-GS的N-端和C-端序列高度保守，根據(jù)已知IDx-型基因(Halford等，1987 ； Mackie等，1996)的序列，運(yùn)用Primer Premier5. O軟件自行設(shè)計(jì)了特異性引物:DX_1和 DX-2，用于擴(kuò)增IDx亞基編碼基因的序列，從起始密碼子ATG開始，至下游15個(gè)堿基處結(jié) 束。引物序列如下DX-I 5' -ATGGCTAAGCGGTTAGTC-3‘DX-2 5' -GCTGCAGAGAGTTCTATC-3‘(2) PCR 反應(yīng)a.反應(yīng)體系為ΙΟΟμ 1 TaKaRa LA Taq (5U/ul)1 μ 12 X GC Buffer II50 μ 1dNTP 混合物(各 2. 5mM)16 μ 1DX-I (20uM)2 μ 1DX-2 (20uM)2μ 1DNA 模板(IOOng)8μ 1
ddH2021 μ 1Total100 μ 1b.反應(yīng)條件94°C預(yù)變性2分鐘；94°C變性45秒，59°C退火1分鐘，72°C延伸2. 5分鐘，共35個(gè) 循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。1 %瓊脂糖膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物，Ikb DNA Ladder Markers為鼎國(guó)生物公司生產(chǎn)。(3) PCR產(chǎn)物的回收純化瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下切下目的條帶，用TaKaRa公司的DNA凝膠回收試劑 盒Ver 2. 0進(jìn)行回收，步驟如下a.凝膠切碎放入2ml離心管，稱重，以Img = 1 μ 1計(jì)算，加入3倍膠塊體積量的膠 塊融化液 DR-I buffer，75°C加熱 lOmin，加 1/2 體積的 DR-II buffer，混勻。b.將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上，溶液轉(zhuǎn)至Spin Column 中，3600rpm離心lmin，棄濾液。c.加入 500 μ 1 的 Rinse A 至 Spin Column 中，3600rpm離心 30 秒，棄濾液。d.加入 700 μ 1 的 Rinse B 至 Spin Column 中，3600rpm 離心 30 秒，棄濾液，重復(fù)1次。e. 12000rpm 再離心 lmin。f.將Spin Column置于新的1. 5ml離心管上，在Spin Column膜的中央加入25 μ 1 的滅菌ddH20，60°C加熱lmin，12000rpm離心lmin，即得到回收產(chǎn)物，可立即使用或于_20°C保存。3. PCR產(chǎn)物的克隆(1)連接反應(yīng)回收的PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy vector (Promega) 4°C連接，反應(yīng)體系如下2Xrapid ligation buffer5. 0 μ 1pGEM-T Eesy Vector0. 5 μ 1T4 DNA Ligase1·0μ1PCR 回收產(chǎn)物3·5μ1Total10 μ 1(2)感受態(tài)細(xì)胞的制備與大腸桿菌的轉(zhuǎn)化a.劃板復(fù)壯宿主菌DH-5 α。b.挑取1個(gè)生長(zhǎng)良好的單菌落(直徑2-3mm)至含有30ml LB液體養(yǎng)基的錐形瓶 中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。c.取500 μ 1菌液接種50ml LB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)至0D600 = 0. 3-0. 4。d.菌液轉(zhuǎn)入無菌一次性使用冰預(yù)冷的50ml離心管中，冰上放置lOmin。e. 4°C 4100rpm 離心 lOmin，收集細(xì)胞。f.棄上清，用IOml冰預(yù)冷的0. IM CaCl2溶液懸浮細(xì)胞，冰上放置10min，4°C 4100rpm離心lOmin，重復(fù)此步驟一次。g.用2ml冰預(yù)冷的0. IM CaCl2溶液懸浮細(xì)胞，加入滅菌甘油至終濃度30%，分裝 后放至0°C備用或存于-70°c。
h.力卩5 μ 1連接產(chǎn)物至200 μ 1的感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁混勻內(nèi)含物，冰上放置30minoi. 42°C熱激90秒，立即插入冰中冷卻2min。j.加入800 μ 1 37°C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37260°C rpm,搖培45分鐘。k. 3600rpm離心30秒，吸掉800 μ 1上清，剩下的吹散細(xì)胞，均勻的鋪于涂有IPTG， X-Gal和Amp 80 μ g/ml LB平板，37°C倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)，置4°C冰箱中顯色4_6小時(shí)。(3)質(zhì)粒的小量提取用于酶切驗(yàn)證或PCR檢測(cè)a.挑取單菌落于IOml LB+(Amp 80 μ g/ml)液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜。b.取1.5ml菌液至的2ml離心管中，12000rpm離心2分鐘，棄上清，收集菌體，重
復(fù)一次。c.加 100μ 1 冰預(yù)冷的溶液 I(50mM 葡萄糖、25mM Tris-HCl pH8. OUOmM EDTA pH8. 0)，震蕩，充分懸浮菌液，室溫放置5分鐘。d.加新鮮配制的200 μ 1的溶液II (0. 2Μ NaOH, 1 % SDS)，上下顛倒不超過5次，冰
上放置5分鐘。e.加 150 μ 1 冰預(yù)冷的溶液 III (60ml 5M 乙酸鉀、11. 5ml 冰乙酸、28. 5ml ddH20)上下顛倒不超過5次，冰上放置，直至形成緊實(shí)的團(tuán)塊，12000rpm離心10分鐘，上
清移至新離心管。f.加等體積的酚/氯仿(1 1)抽提一次，12000rpm離心5分鐘，上清移至新離心管。g.加2倍體積的無水乙醇，混勻，_20°C放置1小時(shí)，12000rpm離心10分鐘。h.用75%乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心5分鐘，重復(fù)一次。i.吹干，溶于50 μ 1滅菌ddH20 (含0. 02mg/ml RNase)中，做電泳檢測(cè)。(4)重組質(zhì)粒PCR和酶切鑒定a.按3. 2PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行重組質(zhì)粒鑒定。b.酶切鑒定體系如下EcoRI1 μ 1IOXH Buffer2μ 1重組質(zhì)粒5 μ 1滅菌水12 μ 1Total20 μ 137°C酶切4小時(shí)，然后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，限制性內(nèi)切酶EcoRI購(gòu)自大連寶 生物工程公司(TaKaRa)。(5)序列測(cè)定與拼接以上經(jīng)鑒定的質(zhì)粒，以SP6和T7為引物，由TaKaRa公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定和拼接。綜上，本發(fā)明的有益效果是在遺傳背景相似的條件下，具有本發(fā)明5’亞基(由 1Dx5’基因編碼)的小麥在濕面筋含量、Zeleny沉降值、粉質(zhì)儀面團(tuán)形成時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間等 面粉加工品質(zhì)主要指標(biāo)上部明顯優(yōu)于具有5亞基的小麥。因此，我們認(rèn)為小麥高分子量麥 谷蛋白新亞基5’對(duì)小麥面粉的加工品質(zhì)的貢獻(xiàn)優(yōu)于亞基5，其編碼基因1Dx5’在小麥品種的加工品質(zhì)改良方面具有重要的利用價(jià)值和開發(fā)潛力。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 具有基因IDx 5’(編碼亞基5’)的小麥W958與具有基因IDx 5 (編碼亞基5)的小麥W168相比，W958濕面筋含量為39. 3%，W168濕面筋含量為26. 1%，具有基因IDx 5，的小麥W958比具有基因1Dx5的小麥W168的濕面筋含量提高了 50. 6%。實(shí)施例2 具有基因IDx 5，的小麥W958與具有基因IDx5的小麥品種川麥107相比，W958濕面筋含量為39.6%，川麥107濕面筋含量為31.2%，具有基因IDx 5，的小麥W958比具有基因IDx 5的小麥川麥107的濕面筋含量提高了 26. 9%。實(shí)施例3 具有基因IDx 5，的小麥W958與具有基因IDx 5的小麥W168相比，W958的Zeleny 沉降值為40. 5ml,W168的Zeleny沉降值為27. 4ml，前者提高了 47.8%。實(shí)施例4 具有基因IDx 5，的小麥W958與具有基因IDx 5的小麥W7相比，W958的Zeleny 沉降值為40. 2ml, W7的Zeleny沉降值為30. 1ml，前者提高了 33.6%。實(shí)施例5 具有基因IDx 5，的小麥W958與具有基因IDx 5的小麥W168相比，W958粉質(zhì)儀面團(tuán)形成時(shí)間為5分鐘，W168面團(tuán)形成時(shí)間為1. 5分鐘，前者形成時(shí)間比后者長(zhǎng)3. 5分鐘。實(shí)施例6:具有基因IDx 5，的小麥W958與具有基因IDx 5的小麥W168相比，W958粉質(zhì)儀 面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間為4分鐘，W168面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間為1分鐘，前者穩(wěn)定時(shí)間比后者長(zhǎng)3分鐘。實(shí)施例7:具有基因IDx 5，的小麥W958與具有基因IDx 5的小麥川麥107相比，W958粉質(zhì)儀面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間為4. 5分鐘，川麥1078面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間為2分鐘，前者穩(wěn)定時(shí)間比后者長(zhǎng)2. 5 分鐘。序列表<110>中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所<120> 一種小麥優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基基因及其表達(dá)的蛋白<130> 一種小麥優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基基因及其表達(dá)的蛋白<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>2505<212>DNA<213> 小麥<400>1atggctaagc ggttagtcct ctttgtggcg gtagtcgtcg ccctcgtggc tctcaccgtc 60
gctgaaggtg aggcctctga gcaactacag tgtgagcgcg agctccagga gctccaggag120cgcgagctca aggcatgcca gcaggtcatg gaccagcagc tccgagacat tagccccgag180tgccaccccg tcgtcgtcag cccggtcgcg ggacaatacg agcagcaaat cgtggtgccg240cccaagggcg gatctttcta ccccggcgag accacgccac cgcagcaact ccaacaacgt300atattttggg gaatacctgc actactaaaa aggtattacc caagtgtaac ttctccgcag360caggtttcat actatccagg ccaagcttct ccgcaacggc caggacaagg tcagcagcca420ggacaagggc aacaatcagg acaaggacaa caagggtact acccaacttc tccgcaacag480ccaggacaat ggcaacaacc ggaacaaggg caaccagggt actacccaac ttctccgcag540cagccaggac aattgcaaca accagcacaa gggcagcaac caggacaagg acaacaaggt600cggcagccag gacaagggca accagggtac tacccaactt cttcgcagct gcagccagga660caattgcaac aaccagcaca agggcaacaa gggcagcaac caggacaagg gcaacaaggt720caacagccag gacaagggca acaaccagga caaggacaac aaggtcaaca gccaggacaa780gggcaacaac caggacaagg gcaacaaggt cagcagctcg gacaaggaca acaagggtac840tacccaactt ctctgcaaca gtcgggacaa gggcaaccag ggtactaccc aacttctctg900cagcagctag gacaagggca atcagggtac tacccaactt ctccgcagca accaggacaa960gggcagcagc caggacaatt gcaacaacca gcacaagggc agcaaccaga acaagggcaa1020caaggtcagc agccacgaca agggcaacaa ggccagcagc caggacaagg gcagcaaccg1080ggacaagggc aaccagggta ctacccaact tctccgcagc agtcaggaca agggcaacca1140gggtactacc caacttcttc gcagcagcca acacaatcgc agcaaccaga acaagggcaa1200caaggtcagc aggtaggaca agggcaacaa gctcagcagc caggacaggg gcagcaaccg1260ggacaagggc agccagggta ctacccaact tctccgctgc agtcaggaca agggcaacca1320gggtactacc taacttctcc gcagcagtca ggacgagggc agcagccagg acaattgcaa1380caatcagcac aagggcaaaa aggacagcaa ccaggacaag gtcaacagcc agggcaaggg1440caacaaggtc agcagccagg acaagggcaa caaggtcagc aaccggggca agggcagcca1500gggtactacc caacttctcc gcagcaatca ggacaagggc aacagccagg acaatggcaa1560caaccaggac aagggcaacc aggatactac ccaacttctc cgttgcagcc aggacaaggg1620caaccagggt acgacccaac ttctccgcaa cagccaggac aagggcagca accaggacaa1680ttgcaacaac cagcacaagg gcaacaaggg cagcaactag cacaagggca acaagggcag1740caaccagcac aagtgcaaca agggcagcag ccagcacaag ggcaacaagg tcagcagcta1800ggacaagggc aacaaggtca gcagccagga caagggcagc aaccagcaca agggcaacaa1860ggtcagcagc caggacaagg gcaacaaggt cagcagccag gacaagggca gcaaccggga1920caagggcagc catggtacta cccaacttct ccgcaacagc caggacaatg gcaacaacca1980ggacaatggc aacaaccagg acaagggcaa ccagggtact acctaacttc tccgttgcag2040ctaggacaag ggcaacaagg gtactaccca acttctctgc aacaaccagg acaagggcag2100caaccaggac aatggcaaca atcgggacaa gggcaacatg ggtactaccc aacttctccg2160cagctgtcag gacaagggca acggccagga caatggctgc aaccaggaca agggcaacaa2220gggtactacc caacttctcc gcaacagtca ggacaagggc aacaactagg acaatggctg2280caaccaggac aagggcaaca agggtactac ccaacttctc tgcaacagac aggacaaggg2340cagcaatcag gacaagggca acaaggctac tacagctcat accatgttag cgtggagcac 2400
caggcggcca gcctaaaggt ggcaaaggcg cagcagctcg cggcacagct gccggcaatg 2460tgccggctgg agggcggcga cgcattgtcg gccagccagt gatag 2505<210>2<211>833<212>PRT<213> 小麥<400>2Met Ala Lys Arg Leu Val Leu Phe Val Ala Val Val Val Ala Leu Val151015Ala Leu Thr Val Ala Glu Gly Glu Ala Ser Glu Gln Leu Gln Cys Glu202530Arg Glu Leu Gln Glu Leu Gln Glu Arg Glu Leu Lys Ala Cys Gln Gln354045Val Met Asp Gln Gln Leu Arg Asp lie Ser Pro Glu Cys His Pro Val505560Val Val Ser Pro Val Ala Gly Gln Tyr Glu Gln Gln lie Val Val Pro65707580Pro Lys Gly Gly Ser Phe Tyr Pro Gly Glu Thr Thr Pro Pro Gln Gln859095Leu Gln Gln Arg lie Phe Trp Gly lie Pro Ala Leu Leu Lys Arg Tyr100105110Tyr Pro Ser Val Thr Ser Pro Gln Gln Val Ser Tyr Tyr Pro Gly Gln115120125Ala Ser Pro Gln Arg Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln130135140Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln145150155160Pro Gly Gln Trp Gln Gln Pro Glu Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro165170175Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Leu Gln Gln Pro Ala Gln Gly Gln180185190Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Arg Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro195200205Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Ser Gln Leu Gln Pro Gly Gln Leu Gln Gln210215220Pro Ala Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly225230235240Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln245250255
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565570575Gln Gln Gly Gln Gln Pro Ala Gln Val Gln Gln Gly Gln Gln Pro Ala580585590Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln595600605Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Ala Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Pro610615620Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly625630635640Gln Gly Gln Pro Trp Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln645650655Trp Gln Gln Pro Gly Gln Trp Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro Gly660665670Tyr Tyr Leu Thr Ser Pro Leu Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr675680685Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln690695700Trp Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln His Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro705710715720Gln Leu Ser Gly Gln Gly Gln Arg Pro Gly Gln Trp Leu Gln Pro Gly725730735Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Ser Gly Gln740745750Gly Gln Gln Leu Gly Gln Trp Leu Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly755760765Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Thr Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly770775780Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Ser Ser Tyr His Val Ser Val Glu His785790795800Gln Ala Ala Ser Leu Lys Val Ala Lys Ala Gln Gln Leu Ala Ala Gln805810815Leu Pro Ala Met Cys Arg Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Ser Ala Ser820825830 Gln
權(quán)利要求
一種具有SEQ ID NO1所示核酸序列的小麥優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基基因。
2.一種具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的小麥優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基基因所 表達(dá)的蛋白。
3.—種權(quán)利要求1所述小麥優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基基因的制備方法，其特征在 于，包括下述步驟1)種子基因組DNA提取a.取小麥品種W958干種子30mg，研成粉沫，轉(zhuǎn)入2ml離心管中；b.加入200μ1提取緩沖液浸泡30min，提取緩沖液的組成成分及含量為200mM Tris-HCl ρΗ7· 5,2. 88Μ NaCl,25mM EDTA，0. 5% SDS ；c.加入600μ 1提取緩沖液，劇烈震蕩Imin, 40C 12000rpm離心lOmin，取上清液至新管；d.加入等體積預(yù)冷的Tris飽和酚/氯仿/異戊醇，混勻，4°C12000rpm離心lOmin，小 心將上清轉(zhuǎn)入新管，Tris飽和酚、氯仿、異戊醇的體積比為25 24 1 ；e.加入等體積預(yù)冷氯仿/異戊醇，混勻，4°C12000rpm離心lOmin，取上清液至新管，冷 氯仿、異戊醇的體積比為24 1 ；f.向上清液中加入600μ 1預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒幾次，-20 V沉淀30min， 4°C IOOOOrpm離心lOmin，棄上清液；g.用500μ 1 70%的乙醇清洗DNA沉淀，4°C 8000rpm離心5min，重復(fù)一次；h.沉淀放超凈工作臺(tái)中室溫干燥；i.加入50 μ 1 滅菌 ddH20,4°C溶解 12h ； j. 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度；2)PCR擴(kuò)增(1)引物設(shè)計(jì) 引物序列如下DX-I 5' -ATGGCTAAGCGGTTAGTC-3‘ DX-2 5 ‘ -GCTGCAGAGAGTTCTATC-3‘(2)PCR反應(yīng)a.反應(yīng)體系為ΙΟΟμ1 TaKaRa LA Taq (5U/ul)1 μ 12XGC Buffer II50 μ 1dNTP 混合物(各 2. 5mM)16 μ 1DX-I(20uM)2 μ 1DX-2(20uM)2 μ 1DNA 模板(IOOng)8μ 1ddH2021 μ 1Total100 μ 1b.反應(yīng)條件94°C預(yù)變性2分鐘；94°C變性45秒，59°C退火1分鐘，72°C延伸2. 5分鐘，共35個(gè)循 環(huán)；最后72°C延伸10分鐘；瓊脂糖膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物； (3) PCR產(chǎn)物的回收純化瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下切下目的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，步驟如下a.凝膠切碎放入2ml離心管，稱重，以Img= 1 μ 1計(jì)算，加入3倍膠塊體積量的膠塊融 化液 DR-I buffer，75°C加熱 IOminJ 1/2 體積的 DR-II buffer，混勻；b.將試劑盒中的SpinColumn安置于Collection Tube上，溶液轉(zhuǎn)至Spin Column中， 3600rpm離心lmin，棄濾液；c.加入500 μ 1 的 Rinse A 至 Spin Column 中，3600rpm 離心 30 秒，棄濾液；d.加入700μ 1的Rinse B至Spin Column中，3600rpm離心30秒，棄濾液，重復(fù)1次；e.12000rpm 再離心 Imin ；f.將SpinColumn置于新的1. 5ml離心管上，在Spin Column膜的中央加入25 μ 1的 滅菌ddH20，60°C加熱lmin，12000rpm離心lmin，即得到回收產(chǎn)物，可立即使用或于_20°C保 存；3) PCR產(chǎn)物的克隆(1)連接反應(yīng)回收的PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy vector 4°C連接，反應(yīng)體系如下2Xrapid ligation buffer5. 0 μ 1pGEM-T Easy Vector0. 5 μ 1T4DNA Ligase1·0μ1PCR回收產(chǎn)物3. 5μ1Total10 μ 1(2)感受態(tài)細(xì)胞的制備與大腸桿菌的轉(zhuǎn)化a.劃板復(fù)壯宿主菌DH-5ci；b.挑取1個(gè)生長(zhǎng)良好的單菌落至含有30mlLB液體養(yǎng)基的錐形瓶中，37°C 200rpm振蕩 培養(yǎng)過夜；c.取500μ 1菌液接種50ml LB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)至0D600 = 0. 3-0. 4 ；d.菌液轉(zhuǎn)入無菌一次性使用冰預(yù)冷的50ml離心管中，冰上放置IOmin；e.40C 4100rpm 離心 IOmin,收集細(xì)胞；f.棄上清，用IOml冰預(yù)冷的0.IM CaCl2溶液懸浮細(xì)胞，冰上放置10min，4°C 4100rpm 離心lOmin，重復(fù)此步驟一次；g.用2ml冰預(yù)冷的0.IM CaCl2溶液懸浮細(xì)胞，加入滅菌甘油至終濃度30%，分裝后放至0°C備用或存于-70°C ；h.加5μ1連接產(chǎn)物至200μ 1的感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁混勻內(nèi)含物，冰上放置 30min ；i.42°C熱激90秒，立即插入冰中冷卻2min ；j.加入800 μ 1 37°C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37°C 260rpm,搖培45分鐘； k. 3600rpm離心30秒，吸掉800 μ 1上清，剩下的吹散細(xì)胞，均勻的鋪于涂有IPTG， X-Gal和Amp 80 μ g/ml的LB平板，37°C倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)，置4°C冰箱中顯色4_6小時(shí)；(3)質(zhì)粒的小量提取用于酶切驗(yàn)證或PCR檢測(cè)a.挑取單菌落于IOml含Amp80 μ g/ml的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜；b.取1.5ml菌液至2ml離心管中，12000rpm離心2分鐘，棄上清，收集菌體，重復(fù)一次；c.加100μ 1冰預(yù)冷的溶液I，震蕩，充分懸浮菌液，室溫放置5分鐘，溶液I的組成成 分及含量為50mM 葡萄糖、25mM Tris-HCl pH8. OUOmM EDTA pH8. 0 ；d.加新鮮配制的200μ 1的溶液II，上下顛倒不超過5次，冰上放置5分鐘，溶液II組 成成分及含量為0. 2Μ NaOH, 1 % SDS ；e.加150μ 1冰預(yù)冷的溶液III，溶液III的組成成分及含量為60ml 5M乙酸鉀、 11. 5ml 冰乙酸、28. 5ml ddH20 ；上下顛倒不超過5次，冰上放置，直至形成緊實(shí)的團(tuán)塊，12000rpm離心10分鐘，上清移 至新離心管；f.加等體積的酚/氯仿抽提一次，12000rpm離心5分鐘，上清移至新離心管，酚、氯仿 的體積比為1:1;g.加2倍體積的無水乙醇，混勻，_20°C放置1小時(shí)，12000rpm離心10分鐘；h.用75%乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心5分鐘，重復(fù)一次；i.自然吹干，溶于50μ1含0. 02mg/ml RNase的滅菌ddH20中，做電泳檢測(cè)；(4)重組質(zhì)粒PCR和酶切鑒定；a.按上述PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行重組質(zhì)粒鑒定；b.酶切鑒定體系如下EcoR I1 μ 1IOXH Buffer2μ 1重組質(zhì)粒5 μ 1滅菌水12 μ 1Total20 μ 137°C酶切4小時(shí)，然后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(5)序列測(cè)定與拼接以上經(jīng)鑒定的質(zhì)粒，以SP6和T7為引物，進(jìn)行DNA序列測(cè)定和拼接。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述小麥優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基基因的制備方法，其特征在 于，所述小麥品種W958由四倍體硬粒小麥T. durum Desf. X六倍體普通小麥Τ. aestivum L 種間遠(yuǎn)緣雜交獲得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小麥優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基基因及其表達(dá)的蛋白。小麥優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基基因序列如SEQ ID NO1所示，小麥優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基基因所表達(dá)的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。在遺傳背景相似的條件下，具有本發(fā)明5’亞基(1Dx5’基因編碼)的小麥在濕面筋含量、Zeleny沉降值、粉質(zhì)儀面團(tuán)形成時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間等面粉加工品質(zhì)主要指標(biāo)上都明顯優(yōu)于具有5亞基的小麥。因此，我們認(rèn)為小麥高分子量麥谷蛋白新亞基5’對(duì)小麥面粉的加工品質(zhì)的貢獻(xiàn)優(yōu)于亞基5，其編碼基因1Dx5’在小麥品種的加工品質(zhì)改良方面具有重要的利用價(jià)值和開發(fā)潛力。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101798575SQ20091021663
公開日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2009年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月8日
發(fā)明者馮波, 吳寧, 徐智斌, 王濤 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所