專利名稱：：異二聚體蛋白結(jié)合組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及來源于免疫球蛋白的異二聚體蛋白結(jié)合組合物，以及制備這種異二聚體蛋白結(jié)合組合物的方法及其應(yīng)用。更特別地，本發(fā)明的方法涉及通過替換IgGFab結(jié)構(gòu)域內(nèi)的重鏈與輕鏈之間的序列，以相對于抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域再調(diào)整(reorient)Fc結(jié)構(gòu)域，并提供更多的、可用的關(guān)鍵性結(jié)合位點，來制備異二聚體蛋白結(jié)合組合物以最大化免疫效應(yīng)因子功能，同時保持抗原結(jié)合。背景和相關(guān)技術(shù)由于抗體的特異性結(jié)合特性和高穩(wěn)定性，使其在研究和診斷中應(yīng)用已經(jīng)幾十年了，而且最近已將其用于疾病的治療。最初是通過融合選擇的B細(xì)胞系與無限增殖的骨髓瘤細(xì)胞系以生產(chǎn)雜交瘤來產(chǎn)生單克隆抗體，雜交瘤是只分泌選擇的B細(xì)胞無性系的選擇的抗體種類的無限增殖細(xì)胞。應(yīng)用重組DNA技術(shù)能產(chǎn)生生產(chǎn)抗體的新方法以及設(shè)計新的抗體結(jié)構(gòu)。在結(jié)構(gòu)上，每個抗體都由兩個相同的"重"鏈與兩個相同的"輕"鏈的相互作用形成，其中所有的都結(jié)合以形成Y形分子(重鏈跨越整個Y，輕鏈只跨越兩個臂)。免疫球蛋白G抗體分子包含決定抗原結(jié)合的互補決定區(qū)(CDR),決定效應(yīng)因子功能的恒定區(qū)和構(gòu)架區(qū)。各種恒定區(qū)可介導(dǎo)一整套的不同生物學(xué)作用。變態(tài)反應(yīng)，例如，緊接著IgE結(jié)合，而IgM結(jié)合可導(dǎo)致補體系統(tǒng)的激活。根據(jù)Y單元的數(shù)量和重鏈的類型，抗體可以分成5類IgG,IgM,IgA,IgD和IgE。任何抗體的輕鏈可以分為K(k)或入(l)類型(多肽的分子特征的一種描述)；但是，重鏈決定每個抗體的亞類。IgG,IgM,IgA,IgD和IgE的重《連分別稱為y，P,a,A和&。最普通使用的抗體是IgG，其可以被蛋白水解酶木瓜蛋白酶裂解成3個部分，2個F(ab)區(qū)域和1個Fc，或被蛋白水解酶胃蛋白酶裂解成2個部分，1個F(ab')2和1個Fc。F(ab)區(qū)域包括抗體的"臂"，其對抗原結(jié)合是關(guān)鍵的。Fc區(qū)域包括恒定區(qū)的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，其組成抗體的"尾巴"，并在免疫應(yīng)答中起作用，而且作為有用的"把手"用于在一些免疫化學(xué)方法中對抗體進(jìn)行操作?？贵w中F(ab)區(qū)域的數(shù)量，與它的亞類一致，決定抗體的"價"(不嚴(yán)格地講，"臂"的數(shù)量，抗體利用該臂結(jié)合它的抗原)。因此，抗體結(jié)構(gòu)可包括任何蛋白質(zhì)或肽，該蛋白質(zhì)或肽包括含有免疫球蛋白分子的至少一部分的分子，如但是不局限于重鏈或輕鏈的至少1個CDR或其配體結(jié)合部分，重鏈或輕鏈可變區(qū)，重鏈或輕鏈恒定區(qū)，構(gòu)架區(qū)，或其任何部分?？贵w片段可包括被稱為Fab的免疫球蛋白分子的片段，其包括使用蛋白酶木瓜蛋白酶裂解抗體產(chǎn)生的CDR抗原結(jié)合位點，木瓜蛋白酶在Y形抗體分子的"鉸鏈"區(qū)域切割產(chǎn)生2個Fab片段?？贵w可包括或源自于任何哺乳動物，如但是不局限于人類，小鼠，兔，老鼠，嚙齒類動物，靈長類動物，或其任何組合。結(jié)合細(xì)胞表面靶的許多治療性IgG抗體，依賴于在鄰近的細(xì)胞同時結(jié)合Fc受體(FcR)，以便實現(xiàn)它們的全部治療可能性。這是因為FcR和可導(dǎo)致效應(yīng)因子功能如抗體依賴細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)或抗原表達(dá)細(xì)胞的吞噬作用。然而，由于在體外ADCC分析中對更多抗體進(jìn)行了評估，變得愈加明顯的是，在存在FcR表達(dá)效應(yīng)細(xì)胞時，一些抗體可顯示與靶(抗原表達(dá))細(xì)胞系結(jié)合較好，而不引起靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性。雖然可以想象其他可能的解釋，但是很可能，對于至少一些抗體，當(dāng)這些抗體與它們的細(xì)胞表面抗原結(jié)合時，這些抗體上的FcR結(jié)合位點對于鄰近細(xì)胞上的FcR可能不是物理上能到達(dá)的(圖1)。目前的數(shù)據(jù)和模型表明，相對于Fab結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域需要彎曲大約90。以適應(yīng)絞鏈區(qū)中的FcR結(jié)合。對于取向與細(xì)胞表面"平行"的抗體，當(dāng)與抗原結(jié)合時，假定這種顯著的重新組合沒有來自原生質(zhì)膜或某些其它分子的位阻是不可能的，特別是如果抗原是剛性的而且不能"形成波形"。因為同樣的原因，抗體上的Clq結(jié)合位點對于Clq是不可能到達(dá)的，Clq是經(jīng)典補體固定通道的第一個部分，其導(dǎo)致缺乏補體裂解活性。IgG抗體是柔韌性分子，能在分子內(nèi)的幾個位點彎曲，特別是絞鏈區(qū)。已經(jīng)報道抗體也進(jìn)^"了Fab結(jié)構(gòu)域相對于Fc結(jié)構(gòu)域的^L曲/轉(zhuǎn)向。盡管這種扭曲/轉(zhuǎn)向能力可能影響鄰近細(xì)胞上的FcR對FcR結(jié)合位點的可及性，這種移動性是有限的，而且因此不可能充分地提供任何FcR能到達(dá)的FcR結(jié)合位點。因此，盡管假定的抗體對想要的細(xì)胞表面抗原具有高的親合力和特異性，它的全部治療可能性仍然是有限的，這是由于如果它緊接著結(jié)合抗原的定位則沒有促進(jìn)Fc介導(dǎo)的募集效應(yīng)因子的功能。這里描述的發(fā)明提供了解決對于這類抗體的這種問題的方法。發(fā)明概述本發(fā)明是一種異二聚體蛋白結(jié)合組合物，其具有免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈，其中異二聚體蛋白結(jié)合組合物具有用輕鏈序列替換的重鏈序列，和用重鏈序列替換的輕鏈序列。以下述方式結(jié)合細(xì)胞表面(或者不溶性的)抗原的抗體不具有充分利用它們固有的募集參與ADCC,FcR介導(dǎo)的吞噬作用和補體裂解的效應(yīng)因子的功能，上述的結(jié)合方式指不能使所述抗體的FcR結(jié)合位點達(dá)到鄰近細(xì)胞上的FcR，或不能使所述抗體的Clq結(jié)合位點達(dá)到可溶性Clq補體蛋白質(zhì)。這里描述的發(fā)明提供了一種通過重新調(diào)整FcR結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Clq結(jié)合結(jié)構(gòu)域相對于抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相對位置來解決這種問題的方法。其通過替換抗體(Ab)的重鏈與輕鏈之間的氨基酸序列，在保留抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)的同時把其余的Ab分子定位于非常不同的位置。能通過重鏈與輕鏈之間替換來實現(xiàn)本發(fā)明的序列的例子包括a)重鏈的全部Fd結(jié)枸域(Vh-CHl)和全部輕鏈(VL畫Cl),b)重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(VL),和c)Vh的互樸決定區(qū)(CDR)和Vl的CDR。相反地，也可用于修飾其FcR結(jié)合位點和Clq結(jié)合位點是相對容易達(dá)到的Ab，以使這些結(jié)合位點變得不易達(dá)到，例如，以便不引起效應(yīng)因子發(fā)揮功能。這也通過上述的、相同類型的序列替換方法來實現(xiàn)。因此，根據(jù)本發(fā)明為了重新調(diào)整Fc結(jié)構(gòu)域相對于抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的定位，將來自免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的不同亞型的序列在特定Ab的重鏈與輕鏈之間替換。已具有替換的這些序列的、適當(dāng)制備的Ab變體，將保留抗原結(jié)合親合力和特異性，但是具有相對于抗原"翻轉(zhuǎn)(flipped)"的Fc結(jié)構(gòu)域。至于細(xì)胞表面抗原，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的這種新的定位可能產(chǎn)生Ab的FcR結(jié)合位點的較差可及性(pooraccessibility)與FcR結(jié)合位點的較好可及性之間的差異(圖2B)?？杉靶詥栴}可能是由于原生質(zhì)膜或相鄰分子的干擾，使Ab不能呈現(xiàn)必要的構(gòu)象以暴露FcR結(jié)合位點。此外，本發(fā)明允許通過混合和搭配來自不同IgG同種型(例如，IgGlIgG2，IgG3或IgG4)或甚至不同Ig類(例如，IgA,IgD,IgG，IgE，或IgM)的Fc結(jié)構(gòu)域，來進(jìn)行另外的調(diào)整(tailoring)。另一方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包括編碼前述的異二聚體蛋白結(jié)合構(gòu)建體的多核苷酸，和至少一個指定的序列、結(jié)構(gòu)域、其部分或其變體。本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了包含這種核酸分子的重組載體，含有這種核酸和/或重組載體的宿主細(xì)胞，和制備和/或使用這種核酸，載體和/或宿主細(xì)胞的方法。本發(fā)明還提供了一種用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)這種異二聚體蛋白結(jié)合構(gòu)建體的方法，包括如在這里描述的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中至少一個這種異二聚體蛋白結(jié)合構(gòu)建體以可檢測的和/或可回收的量表達(dá)。宿主細(xì)胞可以選自COS-1，COS-7，HEK293,BHK21,CHO,BSC-1，HepG2，Ag653,SP2/0，HeLa,骨髓瘤，或淋巴瘤細(xì)胞，或其任何衍生物，無限增殖或轉(zhuǎn)化細(xì)胞。還提供了一種用于生產(chǎn)至少一個這種異二聚體蛋白結(jié)合構(gòu)建體的方法，包括在體外，體內(nèi)或原位的條件下翻譯編碼核酸的構(gòu)建體，以便異二聚體蛋白結(jié)合構(gòu)建體以可檢測的和/或可回收的量表達(dá)。本發(fā)明還提供了至少一種組合物，其包含編碼這里所述的核酸和/或蛋白質(zhì)的本發(fā)明的分離的異二聚體蛋白結(jié)合構(gòu)建體，和合適的載體或稀釋劑。載體或稀釋劑可以是藥學(xué)上可接受的，根據(jù)已知的載體或稀釋劑。組合物同時可包括至少一種另外的化合物、蛋白質(zhì)或組合物。本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了一種方法或組合物，其用于施用治療有效量的本發(fā)明異二聚體蛋白結(jié)合構(gòu)建體，來在相關(guān)的狀況之前，之后或期間，調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞，組織，器官，動物或患者中的至少一種疾病狀況，如本領(lǐng)域已知的和/或如這里所述的。本發(fā)明還提供了至少一種用于傳遞治療或預(yù)防有效量的至少一種本發(fā)明的異二聚體蛋白結(jié)合構(gòu)建體的組合物、裝置和/或方法。本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了至少一種異二聚體蛋白結(jié)合構(gòu)建體的方法或組合物，用于診斷在相關(guān)狀況之前，之后，或者期間，本領(lǐng)域已知的和/或這里描述的，細(xì)胞，組織，器官，動物或患者中的至少一種疾病狀況。還提供了一種醫(yī)學(xué)裝置，其包括至少一種本發(fā)明的異二聚體蛋白結(jié)合構(gòu)建體，其中該裝置適于通過至少一種選自下列的模式來接觸或施用抗體構(gòu)建體胃腸外，皮下，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，支氣管內(nèi)，腹內(nèi)，嚢內(nèi)，軟骨內(nèi)，腔內(nèi)，體腔內(nèi)，小腦內(nèi)，腦室內(nèi)，結(jié)腸內(nèi)，子宮頸內(nèi)，胃內(nèi)，肝內(nèi)，心肌內(nèi)，骨內(nèi)，盆腔內(nèi)，心包內(nèi)，腹膜內(nèi)，胸膜內(nèi)，前列腺內(nèi)，肺內(nèi)，直腸內(nèi)，腎內(nèi)，視網(wǎng)膜內(nèi)，脊柱內(nèi)，滑膜內(nèi)，胸內(nèi)，子宮內(nèi)，膀胱內(nèi)，快速注射，陰道，直腸，頰，舌下，鼻內(nèi)，或經(jīng)皮膚。還提供了一種用于人類藥物或診斷應(yīng)用的制品，包括包裝材料和容器，該容器含有溶液或凍干形式的至少一種本發(fā)明的分離的異二聚體蛋白結(jié)合構(gòu)建體。該制品任選地可包括容器作為胃腸外，皮下，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，支氣管內(nèi)，腹內(nèi)，嚢內(nèi)，軟骨內(nèi)，腔內(nèi)，體腔內(nèi)，小腦內(nèi)，腦室內(nèi)，結(jié)腸內(nèi)，子宮頸內(nèi)，胃內(nèi)，肝內(nèi)，心肌內(nèi)，骨內(nèi)，盆腔內(nèi)，心包內(nèi)，腹膜內(nèi)，胸膜內(nèi)，前列腺內(nèi)，肺內(nèi)，直腸內(nèi)，腎內(nèi)，視網(wǎng)膜內(nèi)，脊柱內(nèi)，滑膜內(nèi)，胸內(nèi)，子宮內(nèi)，膀胱內(nèi)，快速注射，陰道，直腸，頰，舌下，鼻內(nèi)，或經(jīng)皮膚傳遞裝置或系統(tǒng)的部分。還提供了一種用于生產(chǎn)至少一種本發(fā)明的分離的異二聚體蛋白結(jié)合構(gòu)建體的方法，包括能以可回收的量表達(dá)抗體的宿主，轉(zhuǎn)基因動物，轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了通過上述方法來生產(chǎn)至少一種異二聚體蛋白結(jié)合構(gòu)建體。本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了這里描述的任何發(fā)明。附圖簡述在附圖中，其構(gòu)成本說明書的一部分圖1描述了抗原的移動性和Ab的定位是如何影響Ab與細(xì)胞表面抗原與鄰近細(xì)胞上的FcR的同時結(jié)合。圖2顯示了Ab的重鏈與輕鏈之間替換序列的影響。Fd=HC的VH-CH1結(jié)構(gòu)域。圖3顯示了未經(jīng)修飾的Ab的相關(guān)氨基酸序列與本發(fā)明的經(jīng)修飾的Ab相比較。氨基酸以單字母代碼表示。來源于HC的氨基酸以大寫字母表示，來源于LC的氨基酸以小寫字母表示。"X"標(biāo)記了鏈交換(crossover)的點。圖4顯示了通過用涂有未經(jīng)修飾的Ab或陰性對照Ab的抗原結(jié)合區(qū)特異性的mAb(C508或C585)的平板，孵育來自轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞上清液來荻得結(jié)合數(shù)據(jù)。用經(jīng)純化的未經(jīng)修飾的Ab作為標(biāo)準(zhǔn)，使用抗人FcELISA,來預(yù)先測定細(xì)胞上清液中未修飾的與經(jīng)修飾的Ab的濃度。發(fā)明詳述A.定義技術(shù)人員通常理解的含義。而且，除非上下文中另外要求，單數(shù)術(shù)語將包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)術(shù)語將包括單數(shù)。通常，這里描述的細(xì)胞與組織培養(yǎng)，分子生物學(xué)，蛋白質(zhì)和寡或多核苷酸化學(xué)作用和雜交方面和技術(shù)中使用的術(shù)語是本領(lǐng)域熟知的而且常用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于重組DNA，寡核苷酸合成，組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如，電穿孔法，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法)。酶促反應(yīng)和純化技術(shù)根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行，如本領(lǐng)域普通進(jìn)行的，或如這里所述。上述技術(shù)和方法通常根據(jù)本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法進(jìn)行，而且描述于引用和論述的各種普通的和更特異性參考文獻(xiàn)中。(參見，例^t口，Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY1989,其引入這里作為參考。)這里描述的分析，合成有機(jī)，醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)的實驗方法和技術(shù)方面使用的術(shù)語，是本領(lǐng)域熟知和普通使用的那些術(shù)語。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于化學(xué)合成，化學(xué)分析，藥物制備，制劑和傳遞以及患者的治療。除非另作說明，本申請中使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域中通常使用的含義。如用于本申請，下列單詞或短語具有以下含義"抗體"，"Ab"或"抗體肽"指完整的抗體，或其結(jié)合片段，其與完整的抗體竟?fàn)幪禺愋越Y(jié)合。結(jié)合片段通過重組DNA技術(shù)，或通過完整抗體的酶促或化學(xué)裂解產(chǎn)生。結(jié)合片段包括Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(abl)2,Fv和單鏈抗體。除了"單特異性"或"雙功能"抗體之外，抗體理解為具有它的每個等同結(jié)合位點。當(dāng)過量的抗體降低至少大約20%,40%,60%或80%，而且更通常地，大于大約85%與反受體結(jié)合的受體的數(shù)量時(如體外竟?fàn)幮越Y(jié)合分析中測定的)，抗體基本上抑制受體對反受體的結(jié)合。此處所述的"異二聚體蛋白結(jié)合組合物"；"經(jīng)修飾的Ig分子"；或"替換的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體"指免疫球蛋白("Ig")分子，其不同于天然存在的Ig分子，因為修飾的抗體具有一個或多個與輕鏈上的結(jié)構(gòu)域交換的重鏈結(jié)構(gòu)域和/或一個或多個與重鏈的結(jié)構(gòu)域交換的輕鏈；其中替換的結(jié)構(gòu)域可以與原始的抗體同類或者是不同的Ig種類。修飾的Ig分子可以，例如，使用以選擇的陣列排列并在細(xì)胞中表達(dá)的編碼Ig結(jié)構(gòu)域或其部分的多核苷酸，通過常規(guī)的遺傳重組產(chǎn)生?？蛇x擇地，修飾的Ig分子可以使用多肽合成的傳統(tǒng)技術(shù)合成。Ig分子可以是IgA(其包括IgAl和lgA2),IgM,IgG，IgD或IgE分子。如這里使用的，"恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域"或"恒定結(jié)構(gòu)域"指Ig分子的恒定部分內(nèi)的結(jié)構(gòu)域，包括Cl,CHI，鉸鏈，CH2，CH和CH4。如這里使用的，"可變區(qū)結(jié)構(gòu)域"或"可變結(jié)構(gòu)域"指Ig分子的部分，其賦予Ig對特定抗原的特異性。如這里使用的，"抗原"指能與免疫球蛋白分子的抗原結(jié)合區(qū)結(jié)合或能引起免疫應(yīng)答的物質(zhì)。如這里使用的，"抗原"包括，但不限于，抗原決定簇，半抗原和免疫原。術(shù)語"抗原表位"包括能與免疫球蛋白或T細(xì)胞受體特異性結(jié)合的任何蛋白質(zhì)決定簇?？乖砦粵Q定簇通常由分子如氨基酸或糖側(cè)鏈的化學(xué)活性表面組組成，而且通常具有特異性的三維結(jié)構(gòu)特性，以及特異性的電荷特性。當(dāng)解離常數(shù)為lmM,優(yōu)選100nM,最優(yōu)選10nM時，認(rèn)為抗體能特異性地結(jié)合抗原。如這里使用的，"載體"指能在宿主細(xì)胞中傳遞，優(yōu)選表達(dá)，一個或多個感興趣的基因或多核苷酸序列的構(gòu)建體。載體的例子包括，但不限于，病毒載體，棵DNA或RNA表達(dá)載體，與陽離子凝聚劑相關(guān)的DNA或RNA表達(dá)載體，壓縮在脂質(zhì)體中的DNA或RNA表達(dá)載體，以及某些真核細(xì)胞，如生產(chǎn)細(xì)胞。如這里使用的，"多核苷酸"或"核酸"指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸聚合物，而且除非另外限定，包含以與天然存在的核苷酸相似的方式與核酸雜交的天然核苷酸的已知類似物。除非另有說明，特定的核酸序列任選地包括互補序列。多核苷酸序列可以編碼免疫球蛋白的可變和/或恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。如這里使用的術(shù)語"分離的多核香酸"將指基因組，cDNA，或合成來源的或其一些組合的多核苷酸。根據(jù)它的來源，"分離的多核苷酸"(1)與其中天然存在"分離的多核苷酸"的多核苷酸的全部或部分不相關(guān)，(2)可操作地與天然不連接的多核苷酸連接，或(3)不作為較大序列的的部分天然存在。如這里使用的，"藥學(xué)上可接受的載體"包括任何材料其，當(dāng)與Ig聯(lián)合時，允許Ig保留生物學(xué)活性，而且不與個體的免疫系統(tǒng)反應(yīng)。例子包括，但不限于，任何標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)載體如磷酸鹽緩沖鹽水溶液，水，乳劑如油/水乳膠，以及各種類型的濕潤劑。用于氣霧劑或腸胃外給藥的優(yōu)選稀釋劑包括磷酸鹽緩沖鹽水或正常(0.85%)鹽水。如附帶的權(quán)利要求中使用的，"a"指至少一個，而且可以包括復(fù)數(shù)。如這里使用的術(shù)語"可操作地連接"，指在容許它們以計劃的方式發(fā)揮作用的關(guān)系中的位置。調(diào)控序列與編碼序列"可操作地連接"，是連接。如這里使用的術(shù)語"調(diào)控序列"指影響與其連接的編碼序列的表達(dá)和加工所必需的多核苷酸序列。這種調(diào)控序列的性質(zhì)根據(jù)宿主生物體而不同，在原核生物中，這種調(diào)控序列通常包括啟動子，核糖體結(jié)合位點，和轉(zhuǎn)錄終止序列；在真核生物中，這種調(diào)控序列通常包括啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語"調(diào)控序列"意圖包括，至少，其存在對表達(dá)和加工必不可少的所有組件，而且還可以包括其存在是有利的另外的組分，例如，前導(dǎo)序列和融合伴體序列。如這里使用的，20種常規(guī)的氨基酸和它們的縮寫遵循常規(guī)的應(yīng)用。組成本發(fā)明的修飾抗體的氨基酸常?？s寫。氨基酸命名可以如本領(lǐng)域熟知的，通過它的單字母代碼，3字母代碼，名稱，或3核苷酸密碼子來命名氨基酸進(jìn)行命名(參見，Alberts,B.,etal.,MolecularBiologyofTheCell,3rdEd.,GarlandPublishing,Inc.,NewYork,1994)。如應(yīng)用于多肽，術(shù)語"基本相同"指兩個肽序列，當(dāng)進(jìn)行最佳序列比對時，具有至少80%序列同一性，優(yōu)選至少90%序列同一性，更優(yōu)選至少95%序列同一性，最優(yōu)選至少99%序列同一性。優(yōu)選地，不相同的殘基位置由于保守氨基酸取代而不同。保守氨基酸取代指具有相似側(cè)鏈的殘基的互換。例如具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含有酰胺的側(cè)鏈的氨基酸是天門冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴氨酸，精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸和曱硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，谷氨酸-天冬氨酸和天門冬酰胺-谷氨酰胺。如這里討論的，抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中較少的變異是期待的，因為只要氨基酸序列中的變異保持在至少75%,更優(yōu)選至少80%,90%,95%和最優(yōu)選99%，都是本發(fā)明所包含的。尤其是，保守氨基酸取代是期待的。保守性取代是發(fā)生在側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)的那些取代。遺傳編碼的氨基酸通常劃分成以下家族(1)酸性的=天冬氨酸，谷氨酸；(2)堿性的=賴氨酸，精氨酸，組氨酸；(3)非極性的=丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；和(4)不帶電的極性的=甘氨酸，天門冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。更優(yōu)選的家族是脂肪族-羥基=絲氨酸，蘇氨酸；含酰胺的=天冬酰胺，谷氨酰胺；脂肪族=丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸；芳香族的=苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸。例如，期待用異亮氨酸或纈氨酸獨立的取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，用絲氨酸取代蘇氨酸是合理的，或者用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸對氨基酸進(jìn)行相似的取代將對得到的分子的結(jié)合或特性沒有重要影響，特別是如果取代不涉及骨架位點內(nèi)的氨基酸。氨基酸改變是否產(chǎn)生功能性肽，可以通過分析多肽衍生物的特異性活性很容易地確定。這里詳細(xì)描述了分析方法。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以很容易地制備抗體或免疫球蛋白分子的片段或類似物。優(yōu)選的片段或類似物的氨基和羧基末端存在于結(jié)構(gòu)域的邊界附近。結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域可以通過把核苷酸和/或氨基酸序列數(shù)據(jù)與公共的或私有的序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較來確定。優(yōu)選地，計算機(jī)化的比較法用于確定序列基元或預(yù)測蛋白質(zhì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)域，其存在于已知結(jié)構(gòu)和/或功能的其他蛋白質(zhì)中。確定折疊成已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列的方法是已知的。(Bowieetal.Science253:164(1991))。因此，上述例子i正明了本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以識別序列基元和結(jié)構(gòu)構(gòu)象，其用于限定本發(fā)明的結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的氨基酸置換是那些置換，其:(l)降低對蛋白水解的敏感性，(2)降低對氧化的敏感性，(3)改變結(jié)合親合力用于形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，(4)改變結(jié)合親合力，和(4)賦予或修飾這種類似物的其他物理各種^變蛋白。例如:可:在天然存在的^列中l(wèi)優(yōu)選在開;成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域外的多肽部分中)進(jìn)行一個或多個氨基酸置換(優(yōu)選保守氨基酸置換)。保守氨基酸置換基本上不會改變親本序列的結(jié)構(gòu)特性(例如，取代氨基酸將不會傾向于打斷親本序列中存在的螺旋，或破壞表征親本序列的其他種類的二級結(jié)構(gòu))。(Creighton,Ed.，Proteins,StructuresandMolecularPrinciplesW.H.FreemanandCompany,NewYork1984;C.BrandenandJ.Tooze,eds.JntroductiontoProteinStructureGarlandPublishing,NewYork,NY1991;Thorntonetat.Nature354:1051991,中描述了本領(lǐng)域公認(rèn)的多肽的二級和S三級結(jié)構(gòu)的例子，其引入這里作為參考。)術(shù)語患者包括人和獸醫(yī)個體。B.抗體結(jié)構(gòu)基本的抗體結(jié)構(gòu)單元包括四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對具有一條"輕"鏈(大約25kDa)和一條"重"鏈(大約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分包括一個大約100到IIO或更多氨基酸的可變區(qū)，其基本上負(fù)責(zé)抗原識別。每條鏈的羧基末端部分限定了一個恒定區(qū)，其基本上負(fù)責(zé)效應(yīng)因子功能。人輕鏈分為K和入輕鏈。重鏈恒定區(qū)分為w,5,y,oc和s,并把抗體的同種型分別限定為IgM,IgD，IgG，IgA和IgE。每條y重鏈恒定區(qū)包括cH1，鉸鏈，ch2和ch3結(jié)構(gòu)域，y-3中的鉸鏈結(jié)構(gòu)域由4個不同的外顯子編碼。(MorrisonandOi"ChimericIgGenes"inImmunoglobulinGenespp.259-274Honjoetal.eds.,AcademicPressLimited,SanDiego,CA1989)。在輕鏈和重《連中，可變區(qū)和恒定區(qū)通過一個大約12個或更多氨基酸的"J"區(qū)連接，重鏈還包括一個大約超過10個氨基酸的"D"區(qū)。(通常參見FundamentalImmunologyCh.7(Paul,W.,ed.,2nded.RavenPress,NY1989)(以其全部內(nèi)容引入這里用于各種目的)。每對輕/重鏈對的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點。因此，完整的抗體具有兩個結(jié)合位點。除了在雙功能或雙特異性抗體中，兩個結(jié)合位點是相同的。鏈都顯示相對保守的構(gòu)架區(qū)(FR)的相同的通用結(jié)構(gòu)，其由3個高度可變的區(qū)域，也稱為互補決定區(qū)或CDR連接。來自每對的兩條鏈的CDR通過構(gòu)架區(qū)定位，使其能與特異性抗原表位結(jié)合。從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈都包括結(jié)構(gòu)域FR1，CDR1,FR2，CDR2,FR3，CD和FR4。氨基酸指派到每個結(jié)構(gòu)域與ImmunologicalInterest的蛋白質(zhì)的Kabat序歹'J定義一至丈(NationalInstitutesofHealthBethesda,MD1987and1991;Chothia&LeskJ.Mol.Biol.196:901-9171987;Chothiaetal.Nature342:878-8831989)。雙特異性或雙功能抗體是人工的雜合抗體，其具有兩對不同的重/輕鏈對和兩個不同的結(jié)合位點。雙特異性抗體可通過各種方法產(chǎn)生，包括雜交瘤融合或連接Fab'片段。(參見，例如，Songsivilai&LachmannClin.Exp.Immunol.79:315-32119%;Kostelnyetal.J.Immunol.148:1547-15531992)。與常規(guī)抗體的生產(chǎn)相比，雙特異性抗體的生產(chǎn)可以是相對勞動密集的方法，而且雙特異性抗體的產(chǎn)量和純度通常較低。雙特異性抗體不以具有單個結(jié)合位點的片段的形式存在(例如，F(xiàn)ab,Fab和Fv)。C.本發(fā)明的抗體本發(fā)明具體地涉及對抗體分子進(jìn)行基因工程操作以產(chǎn)生修飾的抗體，其具有與輕鏈上的結(jié)構(gòu)域交換的一個或多個重鏈結(jié)構(gòu)域和/或與重鏈結(jié)構(gòu)域交換的一個或多個輕鏈結(jié)構(gòu)域，以便相對于抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域重新調(diào)整Fc結(jié)構(gòu)域。根據(jù)本發(fā)明，提供了通過替換一個或多個免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域，在抗體的恒定區(qū)形成輕鏈和重鏈，把許多天然的或修飾的免疫球蛋白(Ig)恒定結(jié)構(gòu)域用于修飾抗體與Fc受體相互作用的能力方面的特性的方法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法和/或DNA合成，來制備編碼特定Ab的重鏈和輕鏈序列的任何組合的基因，只要那些Ab的氨基酸序列已經(jīng)確定。有各種亞型的序列，其可以在特定Ab的重鏈與輕鏈之間進(jìn)行替換，以便相對于抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域重新調(diào)整Fc結(jié)構(gòu)域。例子包括重鏈Fd和整個輕鏈(圖2A)-制備一條VL-CL-hg-CH2-CH3重鏈與一條VH-CH1輕鏈將需要最小量基因工程操作。應(yīng)該保留Fd與輕鏈之間接觸的所有點。V區(qū)(圖2A)-替換重鏈與輕鏈可變區(qū)以制備一條VL-CHl-hg-CH2-CH3重鏈與一條VH-CL輕鏈，將只需要較少的基因工程操作，來提供V結(jié)構(gòu)域與相鄰的C結(jié)構(gòu)域之間新的接觸面。CDRs上的這些抗原結(jié)合基序理論上可以在鏈之間進(jìn)行替換，盡管保留抗原結(jié)合將可能需要對CDRs側(cè)翼的序列進(jìn)行大規(guī)模的工程操作。適當(dāng)制備的Ab變體，其已經(jīng)具有替換的這些序列，將保留抗原結(jié)合親合力和特異性，但是具有相對于抗原"翻轉(zhuǎn)"的它們的Fc結(jié)構(gòu)域。至于細(xì)胞表面抗原，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的這種新的定位可能產(chǎn)生Ab的FcR結(jié)合位點的較差可及性與FcR結(jié)合位點的較好可及性之間的差異(圖2B)?？杉靶詥栴}可能歸因于，由于原生質(zhì)膜或相鄰分子的千擾，Ab不能呈現(xiàn)必要的構(gòu)象以暴露FcR結(jié)合位點。這些Ab變體還可以提供抗可溶性抗原或病毒的優(yōu)點，例如，大的耙，其中FcR結(jié)合位點或Clq結(jié)合位點被來自除了抗原表位以外的耙部分的位阻所封閉。這些Ab上的FcR結(jié)合位點或Clq結(jié)合位點的不可及性，將影響免疫復(fù)合物的FcR介導(dǎo)的清除或靶的補體介導(dǎo)的裂解。確定氨基酸序列中從一條鏈跨越到另一條鏈的準(zhǔn)確點有一定程度的彈性。VL-CL-hg-CH2-CH3重鏈與Vh-Ch1輕鏈的兩個例子顯示于圖3中。顯示與胂瘤細(xì)胞較好結(jié)合而ADCC活性較弱的Ab，將是本發(fā)明的較好的候選物，因為Fc結(jié)構(gòu)域的重新定位將導(dǎo)致增強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞的ADCC活性。可以制備重新工程操作的基因，然后在用于常規(guī)Ab的相同細(xì)胞體系中進(jìn)行表達(dá)，得到的Ab變體通過用于常規(guī)Ab的相同方法，也即，A蛋白或G蛋白色語法進(jìn)行純化。測定抗原結(jié)合能力以后，ADCC或補體裂解分析將表明重新工程操作的Ab變體是否具有比原始Ab更大的細(xì)胞殺死活性。也有比較重新工程操作Ab對原始Ab中的Fc結(jié)構(gòu)域的可及性的生物物理學(xué)方法，例如，通過評估FcR+細(xì)胞結(jié)合與固定抗原連纟妄的Ab如何。本發(fā)明因此提供了一種新的方法來重新調(diào)整、并可能地在IgGAb上制備更可及的FcR結(jié)合位點與Clq結(jié)合位點。通過提供這些可接近的位點，一些Ab的功效可能被顯著地增強(qiáng)，特別是其ADCC，吞噬作用或補體激活是它的作用機(jī)制的一部分的Ab。由于同時發(fā)生的FcR結(jié)合的影響，通過實現(xiàn)對它的細(xì)胞表面或者相反固定抗原較高的親合力，沒有恢復(fù)這種免疫效應(yīng)因子功能作為它們的部分作用機(jī)制的其他Ab，仍然可得益于本發(fā)明。同時發(fā)生的FcR結(jié)合越大，暫時與它的抗原解離的任何Ab被非常接近于它的抗原的FcR占據(jù)的可能性越大，從而大大增加了重新結(jié)合的機(jī)會。與尋找一種抗相同抗原的完全不同的Ab相比，該抗原以更有利的方向結(jié)合，這種方法常常是更有吸引力的選擇。抗體結(jié)構(gòu)域的物理連接可以利用任何常規(guī)方法完成。在優(yōu)選的實施方案中，結(jié)構(gòu)域的物理連接通過重新組合來完成，也即，其中編碼這種結(jié)構(gòu)域的基因構(gòu)建體，以允許正確裝配的分子在此表達(dá)的方式，被引入到表達(dá)系統(tǒng)中。上述例子描述于圖2和3中。為了構(gòu)建這種修飾的Ig，通常，編碼待修飾Ab的選擇的HC或LC結(jié)構(gòu)域的DNA可以很容易地分離，工程才乘作，并克隆到編碼相同Ab的其它鏈的基因中的選擇位點。例如，在一種方法中，可以同時PCR擴(kuò)增HC的VH和CH1編碼序列，并修飾成在CH1編碼序列的后面緊跟著翻^奪終止密碼子。編碼的多肽可構(gòu)成經(jīng)修飾的Ab的LC。同時，相同Ab的Vl和CL編碼序列可以同時PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行基因工程操作以例如通過重疊PCR方法，來精確連接這種編碼序列與編碼HC的鉸鏈，CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的序列。這種基因編碼的多肽可構(gòu)成經(jīng)修飾的Ab的HC。輕鏈和重鏈的這些構(gòu)建體然后轉(zhuǎn)染到合適的細(xì)胞系中用于表達(dá)。用這樣的方式，可以生產(chǎn)圖2B和3中描述的分子。在下面的例子中，把編碼人Vl和CL結(jié)構(gòu)域的序列插入到相同Ab的重鏈分子上Vh和Ch1結(jié)構(gòu)域的位置。同時，把Vh和Ch1結(jié)構(gòu)域插入到相同Ab的Vl和Cl結(jié)枸域。其他的優(yōu)選實施方案，包括使用其它Ab,或者識別與原始Ab相同的抗原或不同抗原的Ab的Vh和Ch1或VL和CL編碼序列。這種策略可以改變抗原特異性，例如，通過賦予來自其他動物種類的相應(yīng)抗原更大的反應(yīng)性，除了改變FcR結(jié)合。替換的結(jié)構(gòu)域也可以是來自另一個Ig同種型如IgD的輕鏈的結(jié)構(gòu)域。通常重鏈的CH1結(jié)構(gòu)域與輕鏈恒定區(qū)密切相關(guān)，而且這種相關(guān)掩蔽了重鏈與輕鏈上的疏水面。而且，替換的恒定區(qū)不必只限于天然抗體中存在的天然形式的恒定區(qū)。相反地，本發(fā)明中使用的替換的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可以通過，例如，誘變恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，接著篩選增強(qiáng)的活性，或者合成制備來產(chǎn)生。本發(fā)明可以使用來自各種種類如人，非人靈長類動物，山羊，兔，小雞，老鼠，倉鼠或小鼠的抗體來實施本發(fā)明。其他的可能性是插入來自非Ab蛋白質(zhì)的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，如CD4。插入的序列可以不必是免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。其他的序列也許能提供提高Ab效力所需的彈性或空間排列。例子包括由甘氨酸與絲氨酸殘基組成的多肽接頭，如(Gly-Gly-Gly-Ser)3。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明通常也適用于增強(qiáng)受體與它的配體之間的相互作用在這方面，可以對受體或配體部分進(jìn)行修飾，以i"更產(chǎn)生具有大于一個部分的分子，其增強(qiáng)親合力，抗體親抗原性，或者簡單地受體與配體相互作用的能力。換言之，本發(fā)明，通過修飾Fc受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的空間特性，提供了一種增強(qiáng)分子與它的Fc靶的抗體親抗原性的方法。最后的結(jié)果是修飾的分子將對Fc受體具有較高的親合力。而且，由于替換免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域沒有引入外源蛋白序列，修飾的分子將較少可能是免疫原性的。E.修飾抗體的設(shè)計如上所述的，用于制備本發(fā)明的優(yōu)選修飾抗體構(gòu)建體的基本設(shè)計，是把一個或多個重鏈結(jié)構(gòu)域置換成抗體的輕鏈恒定區(qū)和/或把一個或多個輕鏈結(jié)構(gòu)域置換成重鏈恒定區(qū)。本發(fā)明的一個構(gòu)建體是替換重鏈與輕鏈v區(qū)，以制各Vl-Ch1-hg-CH2-CH3重鏈和vh-cl輕鏈(如圖2A所示)。待修飾的抗體可以選自人，嚙齒類動物或者其他的來源的任何抗體，而且可以是嵌合的，人源化的，人或合成抗體。在一個實施方案中，待修飾的抗體可以通過免疫正常或轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生。抗體可以本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行更進(jìn)一步的修飾。一般，修飾的抗體可以通過簡單地把編碼替換的恒定結(jié)構(gòu)域或其他插入序列的多核苷酸置換成編碼抗體。可以直接或用接頭分子進(jìn)行插入?？梢愿鶕?jù)需要設(shè)計插入和接頭的性質(zhì)，來執(zhí)行想要的功能，也即，修飾抗體分子的Fc受體結(jié)合。修飾抗體免疫球蛋白分子的插入的氨基酸組成和長度，可以如本領(lǐng)域已知的通過測試含有各種不同序列的構(gòu)建體來確定。當(dāng)需要具有某些特性的修飾分子時，在恒定區(qū)插入中引入某些突變以便以某種方式修飾它的特性是合乎需要的或必要的。然而，當(dāng)需要用于人類的抗體時，產(chǎn)生盡可能接近人序列的插入以降低免疫原性是合乎需要的。因此，引入盡可能較少的氨基酸改變到修飾分子中，以便避免產(chǎn)生免疫原性通常是合乎需要的。也可以使用對至少兩種不同的抗原具有結(jié)合特異性的雙特異性，異種特異的，復(fù)共軛對配合物或相似的單克隆，人源化抗體。在這種情況下，一種結(jié)合特異性可指定給一種抗原，另一種結(jié)合特異性可指定給任何其他的抗原。產(chǎn)生雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。傳統(tǒng)地，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)是基于兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共表達(dá)，其中兩條重鏈具有不同的特異性(MilsteinandCuello,Nature305:5371983)。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)組合，這些雜交瘤(quadromas)產(chǎn)生了10種不同抗體分子的可能混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。正確分子的純化，其通常通過親和層析步驟完成，是相當(dāng)麻煩的，而且產(chǎn)品產(chǎn)量較低。公開了相似的方法，(例如，WO93/08829,美國專利號6210668,6193967,6132992,6106833,6060285,6037453,6010902,5989530,5959084,5959083,5932448,5833985,5821333,5807706,5643759,5601819,5582996,5496549,4676980,WO91/00360,WO92/00373,EP03089,Trauneckeretal.,EMBOJ.10:36551991;Sureshetal.,MethodsinEnzymology121:2101986,每個以其全部內(nèi)容引入這里作為參考)。下面的例子中，使用重組DNA方法，置換編碼重鏈Fd區(qū)的DNA序列，產(chǎn)生VL誦CL1-hg-CH2CH3重鏈和VH-CH1-hg-CL2-CL3輕鏈，來制備經(jīng)修飾的Ab。相較于修飾抗體來源于其的未修飾鼠抗體，修飾抗體的序列，示于圖3。優(yōu)選地，修飾的抗體構(gòu)建體或配體結(jié)合部分或其變體結(jié)合至少一種蛋白質(zhì)配體或受體，并因此提供對應(yīng)蛋白質(zhì)或其片段的至少一種生物學(xué)活性。各種治療或診斷顯著的蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域熟知的，而且這種蛋白質(zhì)白質(zhì)的修飾抗體可用于本發(fā)明。特別感興趣的是結(jié)合，并因此調(diào)節(jié)TNF，leptin,任何白細(xì)胞介素(IL-1到IL-23,等等)，以及與補體激活相關(guān)的蛋白質(zhì)(例如，C3b)的活性的抗體。在某些疾病狀況中差異表達(dá)的靶向蛋白，也是感興趣的，包括肺瘤中表達(dá)的蛋白質(zhì)等等。所有這中描述的方法發(fā);。、尤其優(yōu)選的修飾抗體組是^些結(jié)合細(xì)胞因^受體的抗體。細(xì)胞因子最近已經(jīng)根據(jù)它們的受體code進(jìn)行分類(參見，Inglot1997,ArchivumImmunologiaeTherapiaeExperinientalis45:353-7,其以其全部內(nèi)容引入這里作為參考)。包括修飾的恒定區(qū)的本發(fā)明的經(jīng)修飾抗體，可使用來源于任何合適方法，例如雜交瘤，噬菌體展示(Katsube,Y.,etalJntJMol.Med,1(5):863-8681998)或應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動物的方法的抗體制備，如本領(lǐng)域已知的和/或如這里所述的。本發(fā)明的修飾抗體構(gòu)建體可包括一個或多個氨基酸置換，缺失或添加，來自于天然突變或人的操作，來自于它來源的親代抗體。另一個方面，如這里所述的，修飾的抗體構(gòu)建體，可以通過有機(jī)部分的共價連接進(jìn)行更進(jìn)一步地修飾。這種修飾可以產(chǎn)生具有提高的藥物動力學(xué)特性(例如，增加的體內(nèi)血清半衰期)的抗體或抗原結(jié)合片段。有機(jī)部分可以是線性或分支的親水性聚合基團(tuán)，脂肪酸基團(tuán)或脂肪酸酯基團(tuán)。在特定的實施方案中，親水性聚合基團(tuán)的分子量為大約800到大約120,000道爾頓，而且可以是聚烷烴乙二醇(例如，聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇(PPG))，碳水化合物聚合物，氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，脂肪酸或脂肪酸酯基團(tuán)可以包括大約8到大約40個碳原子。本發(fā)明的修飾抗體和抗原結(jié)合片段可以包括與抗體直接或間接共價連接的一個或多個有機(jī)部分。與本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段連接的每個有機(jī)部分，可獨立地是親水性聚合基團(tuán)，脂肪酸基團(tuán)或脂肪酸酯基團(tuán)。如這里使用的，術(shù)語"脂肪酸"包含單羧酸類和二羧酸類。如這里使用的術(shù)語"親水性聚合基團(tuán)"，指在水中比在辛烷中的溶解度更高的有機(jī)聚合物。例如，聚賴氨酸在水中比在辛烷中的溶解度更高。因此，本發(fā)明包括通過聚賴氨酸的共價連接修飾的抗體。適于修飾本發(fā)明抗體的親水聚合物可以是線性或分支的，而且包括，例如，聚烷烴乙二醇(例如，PEG,單甲氧基-聚乙二醇(mPEG)，PPG等等)，碳水化合物(例如，右旋糖酐，纖維素，寡糖，多糖等等)，親水性氨基酸的聚合物(例如，聚賴氨酸，聚精氨酸，聚天冬氨酸等等)，聚烷烴氧化物(例如，聚環(huán)氧乙烷，聚氧化丙烯等等)和聚乙烯吡咯烷酮。優(yōu)選地，修飾本發(fā)明抗體的親水聚合物具有分子量為大約800到大約150,000道爾頓的獨立分子實體。例如PEG5000和PEG20,000，其中下標(biāo)是以Da為單位表示的可以使用的聚合物的平均分子量。親水性聚合基團(tuán)可以用1個到6個烷基，脂肪酸或脂肪酸酯基團(tuán)置換。用脂肪酸或脂肪酸酯基團(tuán)置換的親水聚合物可使用合適的方法制備。例如，含有胺基的聚合物可與脂肪酸或脂肪酸酯的羰酸鹽連接，脂肪酸或脂肪酸酯上激活的羰酸鹽(例如，用N,N-羰基二咪唑激活的)可與聚合物上的羥基連接。適于修飾本發(fā)明抗體的脂肪酸和脂肪酸酯可以是飽和的，或者可含有一個或多個不飽和的單元。適于修飾本發(fā)明抗體的脂肪酸包括，例如，正十二烷酸(C12,月桂酸)，正十四烷酸(C14,肉豆蔻酸)，正十八烷酸(C18,硬脂酸)，正二十烷酸(C20,花生酸)，正二十二烷酸(C22,山崳酸)，正三十烷酸(C30),正四十烷酸(C40)，順式-oc9-十八烷酸(C18,油酸)，所有順式a5,8,11,14-二十碳四烯酸(。20,花生四烯酸)，辛二酸，十四烷二酸，十八烷二酸，二十二烷二酸，等等。適合的脂肪酸酯包括含有線性或者分支低級烷基的二羧酸單酯。低級烷基可包括1個到大約12個，優(yōu)選1個到大約6個碳原子?？梢允褂煤线m的方法，例如通過與一種或多種修飾劑反應(yīng)而制備修飾的人抗體和抗原結(jié)合片段。這里使用的術(shù)語"修飾劑"，指包括活化基團(tuán)的適當(dāng)有機(jī)基團(tuán)(例如，親水聚合物，脂肪酸，脂肪酸酯)。"活化基團(tuán)，，指在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以與第二種化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)，從而形成修飾劑與第二化學(xué)基團(tuán)之間的共價鍵的化學(xué)部分或官能團(tuán)。例如，胺反應(yīng)性活化基團(tuán)包括親電子基團(tuán)，如甲苯磺酸酯、甲磺酰酯、卣素(氯、溴、氟、碘)、N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS),等等?？梢耘c疏醇反應(yīng)的活化基團(tuán)包括，例如，馬來酰亞胺、碘代乙?；?、丙烯?；⒍蜻拎?、5-巰基-2-硝基-苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)，等等?？梢詫⑷┕倌軋F(tuán)與含有酰胺或酰肼的分子偶聯(lián)，可以使疊氮基與三價磷酸基反應(yīng)形成氨基磷酸酯或亞氨代磷酸酯鍵。用于將活化基團(tuán)引入分子中的適當(dāng)方法是本領(lǐng)域已知的(參見,例^口,Hermanson,G.T.,BioconjugateTechniques,AcademicPressSanDiego,CA1"6)。活化基團(tuán)可以直接與有機(jī)基團(tuán)(例如，親水聚合物，脂肪酸，脂肪酸酯)結(jié)合，或通過接頭部分與其結(jié)合，所述接頭部分例如為二價C1-C12基團(tuán)，其中一個或多個碳原子可以被氧、氟或硫等雜原子取代。合適的接頭部分包括，例如，四曱醇、-(CH2)3-，-NH-(CH2)6-NH-，-(CH2)2-NH-和-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH-NH-。例如，可以在l-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)存在下，使單-Boc-烷基二亞胺(例如，單-Boc-乙二胺、單-Boc-二氨基己烷)與脂肪酸反應(yīng)，在游離胺與脂肪酸羧基之間形成酰胺鍵，以便產(chǎn)生包含接頭部分的修飾劑。用四氟乙酸(TFA)處理產(chǎn)物，從而使伯胺暴露，可以從產(chǎn)物取出Boc保護(hù)基，該伯胺可以與上述另一羧基偶聯(lián)，或可以與馬來酰胺反應(yīng)，將得到的產(chǎn)物環(huán)化可以產(chǎn)生被活化的脂肪酸的馬來酰亞胺衍生物。(參見，例如，Thompson,etal,WO92/16221;以其全部教導(dǎo)引入這里作為參考。)本發(fā)明的修飾抗體可以通過使人抗體或抗原結(jié)合片段與修飾劑反應(yīng)而產(chǎn)生。例如，通過采用胺反應(yīng)性修飾劑，例如，PEG的NHS酉旨，有機(jī)部分可以與抗體以非位點特異性方式結(jié)合。也可以通過還原抗體或抗原結(jié)合片段的二硫鍵(如鏈內(nèi)二硫鍵)而制備修飾的人抗體或抗原結(jié)合應(yīng)，以便產(chǎn)生本發(fā)明的修飾抗體。可以采用反向蛋白水解等適當(dāng)方法制備包含與本發(fā)明抗體的特異位點結(jié)合的有機(jī)部分的修飾人抗體和抗原結(jié)合片段(Fischetal.,BioconjugateChem.,3:147-1531992;Werlenetal.,BioconjugateChem.,5:411-4171994;Kumaranetal.,ProteinSd.6(10):2233-22411997;Itohetal.,Bioorg.Chem.,24(1):59-681996;Capellasetal.,Biotechnol.Bioeng.,56(4):456-4631997;也可以采用Hermanson,G.T.,BioconjugateTechniques,AcademicPressSanDiego,CA1996中描述的方法)。F.修飾抗體的制備編碼本發(fā)明的嵌合抗體，片段和區(qū)的恒定(C)區(qū)的人基因可以通過已知的方法來源于人胎肝臟文庫。人C區(qū)基因可以來源于任何人細(xì)胞，包括表達(dá)和生產(chǎn)人免疫球蛋白的那些細(xì)胞。人CH區(qū)可以來源于人H鏈的任何已知的種類或同種型，包括Y,JLi,cc,5，s及其亞型，如Gl，G2,G3和G4。因為H鏈同種型負(fù)責(zé)抗體的各種效應(yīng)因子功能，CH區(qū)的選擇將由想要的效應(yīng)因子功能如補體固定，或抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)中的活性來指導(dǎo)。優(yōu)選地，Ch區(qū)來源于Yl(IgGl)。人Cl區(qū)可來源于人L鏈同種型，K或入，優(yōu)選K。編碼人免疫球蛋白C區(qū)的基因可通過標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)從人細(xì)胞獲得(Sambrook，etal.MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY1989;Ausubeletal,eds.CurrentProtocolsinMolecularBiology1987-1993)。人C區(qū)基因可以很容易地從已知的克隆獲得，該克隆含有代表L鏈的兩種類型，H鏈的5種類型及其亞類的基因?？梢酝ㄟ^設(shè)計適當(dāng)被截短的嵌合H鏈基因來制備嵌合抗體片段，如(ab"2和Fab。例如，編碼F(ab1)2片段的H鏈部分的嵌合基因?qū)ň幋aH鏈的CH1結(jié)構(gòu)域和絞鏈區(qū)的DNA序列，后面是翻譯終止密碼子，以產(chǎn)生截短的分子。通?？赏ㄟ^克隆編碼特異性抗體的H和L鏈抗原結(jié)合區(qū)的DNA片段，并把這些DNA片段分別與編碼CH和CL區(qū)的DNA片段連接，以產(chǎn)生鼠，人或嵌合的免疫球蛋白編碼基因，來生產(chǎn)本發(fā)明的鼠，人或嵌合的抗體，片段和區(qū)。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，產(chǎn)生了融合的嵌合基因，其包括至少編碼人或非人來源的抗體的抗原結(jié)合區(qū)的第一DNA片段，如與連接(J)片段功能性重排的V區(qū)，它與編碼含有替換序列的人C區(qū)的至少一部分的第二DNA片段連接?？梢酝ㄟ^插入，取代和缺失對可變的，恒定的或插入序列的序列進(jìn)行修飾，到使嵌合抗體保持結(jié)合并抑制感興趣的抗原的能力的程度。普通技術(shù)人員可以通過進(jìn)行適用的功能性分析確定該活性的保持。可以任選地通過細(xì)胞系，混合細(xì)月包系，無限增殖的細(xì)月包或無限增殖細(xì)胞的無性群體，如本領(lǐng)域熟知的，來生產(chǎn)本發(fā)明的抗體構(gòu)建體。(參見，例^口，Ausubel,etal.,ed.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY,NY1987-2001;Sambrook,etal.,MolecularClonmg:ALaboratoryManual,2ndEdition,ColdSpringHarbor,NY1989;HarlowandLane,antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NY1989;Colligan,etal.,eds.,CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY1994-2001;Colliganetal.,CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY5NY1997-2001,每個都以其全部內(nèi)容引入這里作為參考。)在一種方法中，通過融合適當(dāng)?shù)臒o限增殖細(xì)胞系(例如，骨髓瘤細(xì)胞系如，但不限于，Sp2/0,Sp2/0-AG14，NS/O,NS1，NS2,AE-I，L.5,>243,P3X63Ag8.653,Sp2SA3，Sp2MAI，Sp2SS1,Sp2SA5，U937，MLA144，ACTIV,M0LT4,DA-I,JUKKAT,WEHI，K-562,COS,RAH，NIH3T3,HL-60,MLA144，NAMAIWA，NEUR02A等，或異骨髓瘤，其融合產(chǎn)物，或由此衍生的任何細(xì)胞或融合細(xì)胞，或本領(lǐng)域已知的任<可其它合適的細(xì)月包系。(參見，例如，www.atcc.org,www.lifetech.com.),等等，與抗體產(chǎn)生細(xì)胞來產(chǎn)生雜交瘤，該抗體產(chǎn)生細(xì)胞如，但不限于，分離的或克隆的脾細(xì)胞，外周血細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，扁桃體細(xì)胞，或其它免疫細(xì)胞或含B細(xì)胞的細(xì)胞，或其它任何表達(dá)重《連或輕鏈恒定區(qū)或可變區(qū)或構(gòu)架區(qū)或CDR序列的細(xì)胞，這些序列可以是內(nèi)源的或異源核酸，重組或內(nèi)源性的，病毒，細(xì)菌，藻類，原核生物，兩棲動物，昆蟲，爬行動物，魚類，哺乳動物，嚙齒類，馬，綿羊，山羊，羊，靈長類，真核生物的基因組DNA,cDNA,rDNA,線粒體DNA或RNA,葉綠體DNA或RNA，hnRNA,mRNA,tRNA，單鏈，雙鏈或三鏈，雜交的等或其任何組合。(參見，例如，Ausubel,同上，和Colligan,Immunology,同上，第二章，以其全部內(nèi)容引入這里作為參考。)也可以用任何其它合適的宿主細(xì)胞表達(dá)編碼本發(fā)明的修飾抗體，其特定片段或變體的異源或內(nèi)源核酸?？梢杂眠x擇性培養(yǎng)條件或其它適當(dāng)?shù)囊阎椒ǚ蛛x融合(雜交瘤)或重組細(xì)胞，并且用有限稀釋或細(xì)胞分揀或其它已知方法進(jìn)行克隆。產(chǎn)生具有所需特異性的抗體的細(xì)胞可以通過適當(dāng)?shù)姆治?例如，ELISA)進(jìn)行選擇。工程化或人源化非人或人抗體的方法可以使用，而且是本領(lǐng)域熟知的。一般地，人源化或工程化的抗體具有一個或多個非人來源的氨基酸殘基。這些氨基酸殘基一般稱作"輸入"殘基，其一般來自于已知人序列的"輸入"可變區(qū)，恒定區(qū)或其它結(jié)構(gòu)域。已知的人Ig序列是公開的；(例^口，www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;www.atcc.org/phage/hdb.html;www.sciquest.com/;www,abcam.com/;www,antibodyresource.com/onlinecoinp.htol;www.public.iastate*eduApedro/research—tools.html;www'mgen,uni-heidelberg.de/SD/IT/IT,html;www.whfreeman.comyimm"unology/CH05/kuby05.htm;www.library.thinkquest.org/12429/Iminune/Antibody.htol;www.hhmi,org/grants/lectures/1996/vlab/;www.path,cam.ac'uk/mrc7/mikeiinages.html;www.antibodyresource，com/;mcb.harvard.edu/BioLinks/Inununology.html.www.iminunologylink.com/;pathbox.wustiLedu/hcenter/index.html;www.biotech.ufl.edu/hcl/;www.pebio,com/pa/340913/340913.htol;www,nal,usda,gov/awic/pubs/antibody/;www.m.ehime-u.ac'jp/yasuhito/ElisaJitinl;www.biodesign.com/table.asp;www,icnet.uk/axp/facs/davies/links.litml;www.biotech.ufleduA-fccl/protocol.html;www.isac-net.org/sites一geo.html;aximtl.imt,uni-marburg.de/rek/AEPStart,html;baserv.uci.kun.nl/jraats/linksl,htni〗；www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.e(iu/;www,mrc-cpe，cam.ac,uk/imt-doc/public/INTRO.htoil;www,ibt.unam.mx/vir/V—mice.htmI;imgt,cnusc,fr:8104/;www,biochem.ucl.ac.uk/raartin/antibodies/index.html;antibody.bath.ac.uk/;abgeia.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgeu.html;www,unizh.ch/honegger/AHOseininar/Slide01,html;www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/;www.nimr.mrc,ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg*htm;www.path.cam.ac.uk/~rnrc7/humanisation/TAHHP.html;www,ibtunam,mx/vir/structure/stat—aim.html;www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html;Kabateta.，iSfe《we^wo/T)Mmw"o/og7'ra//w/ere^，U.S，Dept.Health1983;每個老卩以其全部內(nèi)容引入這里作為參考。)這些輸入序列可以用于減少免疫原性，或用于減少、增強(qiáng)或修飾結(jié)合，親合力，開率(on-rate),閉率(off-rate)，親和力，特異性，半衰期或任何其它適當(dāng)?shù)奶卣鳎绫绢I(lǐng)域已知的。保留非人或人CDR序列的大部分或全部，而用人或其它氨基酸取代可變區(qū)和恒定區(qū)的非人序列。對抗體人源化，保留抗體對抗原的高親合力和其它有利的生物學(xué)特性。為了達(dá)到這一目的，通過采用母體和人源化序列的三維模型分析母體序列和各種得到的人源化產(chǎn)物的過程任選制備人源化抗體。三維免疫球蛋白是通?？傻玫降模⑶沂潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的。說明和演示所選的候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)計算機(jī)程序是可得到的。檢查這些演示結(jié)果可以分析候選免疫球蛋白序列功能中殘基的可能作用，也即，分析影響候選免疫球蛋白與其抗原的結(jié)合能力的殘基。以這種方式，可以選擇FR殘基，并且與共有序列和輸入序列結(jié)合，從而得到需要的抗體特征，如對靶抗原的親和力增加?？偠灾珻DR殘基直接并最大程度參與影響抗原結(jié)合。本發(fā)明抗體的人源化或工程化可以采用任何已知的方法，例如，但不限于，以下文獻(xiàn)中描述的方法，(Winter,Jonesetal.,Nature321:5221986;Riechmannetal.,Nature332:3231988;Verhoeyenetal.,Science239:15341988;Simsetal.,J.Immunol.151:22961993;CliothiaandLesk，J.Mol.Biol.196:9011987;Carteretal,Proc.Natl.Acad.Sd.U.S.A.89:42851992;Prestaetal.,J.Immunol.151:26231993;USPatentNos:5723323,5976862,5824514,5817483,5814476,5763192,5723323,5,766886,5714352,6204023,6180370,5693762,5530101,5585089,5225539;4816567,PCT/:US98/16280,US96/18978,US91/09630，US91/05939,US94/01234,GB89/01334,GB91/01134,GB92/01755;WO90/14443,WO90/14424,WO90/14430,EP229246,每個都以其全部內(nèi)容引入這里作為參考。也可以使用至少一種編碼核酸的抗體構(gòu)建體提供轉(zhuǎn)基因動物或哺乳動物，從而制備本發(fā)明的抗體，所述動物如山羊，牛，馬，綿羊，等等，它們在其乳汁中產(chǎn)生這些抗體。這些動物可以使用已知的方法提供。(參見,例如，但不限于美國專利號5,827,690;5，849,992;4,873,316;5,849,992;5,994,616,5,565,362;5,304,489,等等，其中每個都以其全部內(nèi)容引入這里作為參考。也可以使用至少一種編碼核酸的抗體構(gòu)建體提供在植物部分或由其培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生這種抗體、特定部分或變體的轉(zhuǎn)基因植物并培養(yǎng)植物細(xì)胞(例如，但不限于煙草和玉米)，從而制備本發(fā)明的抗體。作為一卄限制性的實例，已經(jīng)成功使用表達(dá)重組蛋白的煙葉提供大量重組蛋白，例如，使用誘導(dǎo)型啟動子。參見，例如，Crameretal.,Curr.Top.Microbol.Immunol.240:95-1181999)及其中引用的文獻(xiàn)。同樣，已經(jīng)采用玉米以商業(yè)生產(chǎn)水平表達(dá)哺乳動物蛋白，其生物學(xué)活性等于在其它重組系統(tǒng)產(chǎn)生或從天然來源純化的蛋白。參見，例如，Hoodetal.,Adv.Exp.Med.Biol.464:127-1471999及其中引用的文獻(xiàn)。也已經(jīng)從轉(zhuǎn)基因才直物種子，包括煙草種子和馬鈴薯塊根中大量產(chǎn)生了抗體，包括抗體片段，例如單鏈抗體(scFv，s)。(參見，例如，Conradetal.,PlantMol.Biol.38:101-1091998及其中引用的文獻(xiàn)。這樣，也可以根據(jù)已知方法，釆用轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。(也參見，例如，F(xiàn)ischeretal,Biotechnol.Appl.Biochem.30:99-108Oct.,1999:Maetal.,TrendsBiotechnol.13:522-7199;Maetal.,PlantPhysiol.109:341-61995;Whitelametal.,Biochem.Soc.Trans.22:940-9441994;及其中引用的文獻(xiàn)；上述文獻(xiàn)每個都以其全部內(nèi)容引入這里作為參考。力。(參見，例^口,Berzofsky,etal.,"Antibody-AntigenInteractions,"InFundamentalImmunology,Paul,W.E.,Ed,RavenPressNY,NY1984;Kuby,JanisImmunology,W.H.FreemanandCompanyNY,NY1992;以及這里描述的方法。)如果在不同的條件(例如，鹽濃度，pH)下進(jìn)行測定，測定的特定抗體-抗原相互作用的親和力會有變異。因此，親合力及其他抗原結(jié)合參數(shù)(例如，KD，K3，Kd)的測定，優(yōu)選用抗體和抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液如這里所述的緩沖液進(jìn)行。G.核酸分子采用這里提供的信息，可使用這里描述的方法或本領(lǐng)域已知的方法獲得編碼本發(fā)明抗體構(gòu)建體的本發(fā)明核酸分子。本發(fā)明的核酸分子可以是RNA形式，如mRNA，hnRNA，tRNA或任何其它形式，或可以是DNA形式，包括，但不限于，通過克隆或合成產(chǎn)生，或其任意組合而獲得的cDNA和基因組DNA。DNA可以是三鏈，雙鏈或單鏈，或其任意組合。DNA或RNA的至少一條鏈的任意部分可以是編碼鏈，也稱作有義鏈，或可以是非編碼鏈，也稱作反義鏈。本發(fā)明的分離核酸分子可以包括含有開放讀碼框(ORF),任選具有一個或多個內(nèi)含子的核酸分子，至少一種含有修飾抗體構(gòu)建體的編碼序列的重鏈或輕鏈核酸分子的至少一種CDR,如CDR1，CDR2和/或CDR3的至少一個特定部分，以及含有基本上不同于上述那些的核苷酸序列的核酸分子，但由于遺傳密碼簡并性，它們?nèi)匀痪幋a這里描述的和/或本領(lǐng)域已知的至少一種這種修飾的抗體構(gòu)建體。當(dāng)然，遺傳密碼是本體的簡并核酸變體是常M^的。(參見，例如，Ausubel,etal.,同上)，而且這些核酸變體包括在本發(fā)明中。如此處指出的，包含編碼抗體構(gòu)建體的核酸的本發(fā)明的核酸分子可以包括，但不限于，自身編碼抗體片段的氨基酸序列的核酸，完整抗體或其部分的編碼，抗體、片段或部分的編碼序列，以及其它的序列，如至少一種信號前導(dǎo)肽或融合肽的編碼序列，其具有或不具有前面提到的其它編碼序列，如至少一種內(nèi)含子，同時具有其它的非編碼序列，包括但不限于，非編碼5，和3，序列，如在轉(zhuǎn)錄，mRNA加工，包括剪接和聚腺苷酸化信號中起作用(例如，mRNA的核糖體結(jié)合和穩(wěn)定性)的轉(zhuǎn)錄的，未翻譯的序列；編碼其它的氨基酸，如提供其它的功能的氨基酸的其它編碼序列。因此，編碼抗體的序列可以與標(biāo)記序列融合，例如與編碼促進(jìn)包含抗體片段或部分的融合抗體純化的肽的序列融合。核酸的構(gòu)建本發(fā)明的分離核酸可以利用本領(lǐng)域熟知的的(a)重組方法，(b)合成技術(shù)，(c)純化技術(shù)或其組合進(jìn)行制備。核酸可以方便地包含除本發(fā)明的多核苷酸的多核苷酸以外的序列。例如，可以將包含一個或多個內(nèi)切核酸酶限制位點的多克隆位點插入核酸，以幫助多核苷酸的分離。也可以插入可翻if的序列以幫助本發(fā)明的被翻譯的多核苷酸的分離。例如，一種六組氨酸標(biāo)記序列提供了純化本發(fā)明的蛋白的方便的方法。除編碼序列外，本發(fā)明的核酸任選為用于克隆和/或表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的載體，連接物或接頭。在這種克隆和/表達(dá)序列中也可以中也可以加入其它序列，用于最佳化它們在克隆和/或表達(dá)中的功能，用于幫助多核苷酸分離，或改進(jìn)多核苷酸向細(xì)胞中的引入。克隆載體，表達(dá)載體，連接物和接頭是本領(lǐng)域公^口的。(參見，4列^口，Ausubel，同上；或Sambrook，同上)構(gòu)建核酸的重組方法本發(fā)明的分離核酸組合物，如RNA,cDNA,基因組DNA或其任何組合，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何克隆方法從生物來源獲得。在一些實施方案中，在嚴(yán)格條件下，選擇性與本發(fā)明的多核苷酸雜交的寡核苷酸探針用于鑒定cDNA或基因組DNA文庫中的所需序列。RNA的分離，和cDNA以及基因組文庫的構(gòu)建是本領(lǐng)域普通^支術(shù)人員熟知的。(參見，例^口，Ausubel,同上；或Sambrook,同上)核酸篩選和分離方法可以采用基于本發(fā)明的多核苷酸序列的探針篩選cDNA或基因組文庫，如此處所公開。探針可用于與基因組DNA或cDNA序列雜交，以分離相同或不同生物體中的同源基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在測定中可以使用不同嚴(yán)格性程度的雜交，雜交或洗滌介質(zhì)中的任意一個可以是嚴(yán)格的。當(dāng)雜交條件更嚴(yán)格時，探針與靶之間的互補性必須更高，這樣才能形成雙鏈體。嚴(yán)格性程度可以由溫度，離子強(qiáng)度，pH和曱酰胺等部分變性溶劑的存在中的一個或多個條件進(jìn)行控制。例如，雜交的嚴(yán)可以通過例如在0%-5%的范圍內(nèi)操作曱酰胺的濃度而改變?？蓹z測的結(jié)合所要求的互補性程度(序列同一性)將根據(jù)雜交介質(zhì)和/或洗滌介質(zhì)的嚴(yán)格性而改變?；パa性程度最佳為100%，或70-100%,或其中的任意范圍或任意值。然而，應(yīng)當(dāng)理解，探針和引物中的小量序列變異可擴(kuò)增RNA或DNA的方法是本領(lǐng)域熟知的，可以纟艮據(jù)此處的教導(dǎo)和指導(dǎo)用于本發(fā)明，而不需要過多的實驗。已知的擴(kuò)增DNA或RNA的方法包括，但不限于，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和相關(guān)的擴(kuò)增方法(參見，例如，Mullis等的美國專利4,683,195,4,683,202,4,800,159,4,965，188;Tabor等的4,795,699和4,921,794;Innis的5,142,033;Wilson等的5,122,464;Innis的5,091,310;Gyllensten等的5，066,584;Gelfand等的4,889,818;Silver等的4,994,370;Biswas的4,766,067;Ringold的4,656,134)和RNA介導(dǎo)的擴(kuò)增，該擴(kuò)增中使用耙序列的反義RNA作為模板用于雙鏈DNA合成(參見，例如，Ausubel,同上；Samb腦k,同上;Malek等的美國專利5,130,238，商品名為NASBA;以其全部內(nèi)容引入這里作為參考)。例如，可以用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)從基因組DNA或cDNA文庫直接擴(kuò)增本發(fā)明的多核苷酸序列和相關(guān)基因。PCR和其它體外擴(kuò)增方法也可用于，例如，克隆編碼需要表達(dá)的蛋白的核酸序列，制備用于檢測樣品中是否存在所需mRNA的探針的核酸，用于核酸測序，或其它目的。(足夠指導(dǎo)技術(shù)人員使用體外擴(kuò)增方法的技術(shù)的例子見:Berger，同上；Sambrook,同上；Ausubel,同上；Mullis等的美國專利4,683,2021987;Innis等的PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications,Eds.,AcademicPressInc.,SanDiego,CA1990。)用于基因組PCR擴(kuò)增的商品化試劑盒是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，Advantage-GC基因組PCR試劑盒(Clontech)。此外，如T4基因32蛋白(BoehringerMannheim)可用于提高長PCR產(chǎn)物的產(chǎn)率。構(gòu)建核酸的合成方法本發(fā)明的分離核酸也可以根據(jù)已知方法通過直接化學(xué)合成而制備(參見，例如，Ausubel等，同上)?；瘜W(xué)合成一般產(chǎn)生單鏈核苷酸，該單聚合酶進(jìn)行聚合而轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，盡管DNA的化學(xué)合成可以限制在約100或更多堿基的序列，也可以通過較短序列的連接獲得較長的序列。H.重組表達(dá)盒本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明的核酸的重組表達(dá)盒。本發(fā)明的核酸序列，例如，編碼本發(fā)明的抗體的cDNA或基因組序列可用于構(gòu)建重組表達(dá)盒，該表達(dá)盒可以被導(dǎo)入至少一種需要的宿主細(xì)胞。重組表達(dá)盒一般包含本發(fā)明的多核苷酸，該多核苷酸可操作性連接于指導(dǎo)多核苷酸在目的宿主中轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)序列。異源性和非異源性(即內(nèi)源性)啟動子可用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸的表達(dá)。在一些實施方案中，作為啟動子，增強(qiáng)子或其它元件的分離核酸可以導(dǎo)入本發(fā)明的多核香酸的非異源形式中的適當(dāng)位置(位于內(nèi)含子上游，下游或內(nèi)部)，以便上調(diào)或下調(diào)本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)。例如，可以通過突變，缺失和/取代而體內(nèi)或體外改變內(nèi)源性啟動子。I.載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的分離核酸分子的載體，用重組載體基因工程化的宿主細(xì)胞，以及通過本領(lǐng)域熟知的重組:技術(shù)產(chǎn)生的至少一種本發(fā)明的抗體構(gòu)建體。(參見，例如，Sambrook等，同上；Ausubel等，同上,每個都以其全部內(nèi)容引入這里作為參考。多核苷酸可以任選與含有可選擇標(biāo)記的載體連接，用于在宿主中增殖。一般地，將質(zhì)粒載體導(dǎo)入一種沉淀物，例如，磷酸鈣沉淀，或?qū)刖哂袔щ娭|(zhì)的復(fù)合物，如果載體是病毒，可以用適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系將其包裝后轉(zhuǎn)導(dǎo)至宿主細(xì)胞。DNA插入物可以操作性與適當(dāng)啟動子連接。表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄起始位點、轉(zhuǎn)錄終止位點和轉(zhuǎn)錄區(qū)中位點，以及用于翻譯的核糖體結(jié)合位點。由構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄物的編碼部分將優(yōu)選包含位于起始處的翻譯起始密碼子和位于被翻譯處的mRNA末端適當(dāng)位置的終止密碼子(如UAA，UGA或UAG),哺乳動物或真核細(xì)胞表達(dá)優(yōu)選采用UAA和UAG。表達(dá)載體優(yōu)選但任選包含至少一種可選4奪標(biāo)記。這些標(biāo)記包括，例如，但不限于用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的氨甲喋呤(MTX),二氫葉酸還原酶(DHFR，美國專利4,399,216;4,634,665;4,656,134;4,956，288;5,149,636;5,179,017)，氨千青霉素，新霉素(G418),霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS，美國專利5,122,464;5,770,359;5,827,739)抗性基因，以及用于培養(yǎng)大腸桿菌和其它細(xì)菌或原核生物的四環(huán)素或氨千青霉素抗性基因(上述專利以其全部內(nèi)容引入這里作為參考)。上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域公知的。適當(dāng)?shù)妮d體是本領(lǐng)域技術(shù)人員很顯而易見的?？梢酝ㄟ^磷酸鉤轉(zhuǎn)染，DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，陰離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔，轉(zhuǎn)導(dǎo)，感染或其它已知方法將載體構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。(這些方法在本領(lǐng)域有描述，Sambrook,同上，1-4和16-18章;Ausubel，同上l,9,13，15,16章。)本發(fā)明的至少一種抗體可以以修飾的形式，例如以融合蛋白的形式表達(dá)，并且可以包括分泌信號和其它異源功能區(qū)。例如，其它的氨基酸區(qū)域，特別是帶電氨基酸區(qū)域可以添加至抗體的N端以改進(jìn)純化或隨后的加工和儲存過程中在宿主中的穩(wěn)定性和耐受性。也可以將本發(fā)明的肽部分添加至本方面的抗體，以促進(jìn)純化。這些區(qū)域可以在抗體或其至少一個片段的最終制備之前去除。(這些方法描述于許多標(biāo)準(zhǔn)實驗室手冊Sambrook，同上17.29-17.42和18.1-18.74章；Ausubel，同上16，17和18章)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解，許多表達(dá)系統(tǒng)都可以用于表達(dá)編碼本發(fā)明的蛋白的核酸。作為選擇，本發(fā)明的核酸可以通過在包含編碼本發(fā)明的抗體的內(nèi)源性DNA的宿主細(xì)胞中打開(turningon)(通過操作)而在宿主細(xì)胞中表達(dá)。(這些方法是本領(lǐng)域公知的，如描述于美國專利5,580，734，5,641,670，5,5733，746,和5，733，761,以其全部內(nèi)容引入這里作為參考。)用于產(chǎn)出抗體，其特定部分或變體的示例性的細(xì)胞培養(yǎng)物為哺乳動物細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)一般是單層細(xì)胞的形式，但也可以使用哺乳動物細(xì)胞懸浮液或生物反應(yīng)器。本領(lǐng)域中已經(jīng)開發(fā)了許多能夠表達(dá)完整糖基化蛋白的適當(dāng)宿主細(xì)胞系，包括COS-l(如ATCCCRL1650)，COSTCOATCCCRL1651),HEK293,BHK21(如ATCCCRL-10)，CHO(如ATCCCRL1610)和BSC-l(如ATCCCRL誦26)細(xì)胞系，Cos-7細(xì)胞，CHO細(xì)胞，hepG2細(xì)胞，P3X63Ag8.653,SP2/0-Agl4,293細(xì)胞，HeLa纟田胞等，它們可以容易從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心Manassas,Va(，w,atcc,org)獲得。優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括淋巴來源的細(xì)胞，如骨髓瘤和淋巴瘤細(xì)胞。特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞是P3X63Ag8.653細(xì)胞(ATCC保藏號CRL-1580)和SP2/0-Agl4細(xì)胞(ATCC保藏號CRL曙1851)。在一種特別優(yōu)選的實施方案中，重組細(xì)胞是P3X63Ab8.653或SP2/0-Agl4細(xì)胞。這些細(xì)胞的表達(dá)載體可以包含一種或多種以下表達(dá)調(diào)控序列，例如，但不限于復(fù)制起點;啟動子(如晚期或早期SV40啟動子，CMV啟動子(美國專利5,168,062;5,385,839),HSVtk啟動子，pgk(磷酸甘油酶)啟動子，EF-1a啟動子(美國專利5，266,491)，至少一種人類免疫球蛋白啟動子;增強(qiáng)子和或加工信號位點，例如核糖體結(jié)合點位，RNA剪接位點，聚腺苷酸化位點(如SV40大TAg聚腺苷酸添加位點)和轉(zhuǎn)錄終止子序列。見，例如Ausubel等，同上；Sambrook，等，同上。其它用于產(chǎn)生本發(fā)明的核酸或蛋白的細(xì)胞是已知的和/或可得到的，例如從美國典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞系和雜交瘤目錄(www,atcc,org)或其它已知的或商業(yè)來源獲得。當(dāng)使用真核宿主細(xì)胞時，一般將聚腺苷酸化或轉(zhuǎn)錄終止子序列摻入載體。終止子序列的一個例子是來自于牛生長激素基因的聚腺苷酸化序列。也可以包括用于準(zhǔn)確剪接轉(zhuǎn)錄物的序列。剪接序列的一個例子是SV40的VP1內(nèi)含子(Sprague,etal.,J.Virol.45:773-7811983)。此外，用于調(diào)控宿主細(xì)胞中復(fù)制的基因序列可以摻入本領(lǐng)域公知的載體中。J.在哺乳動物細(xì)胞中克隆和表達(dá)抗體構(gòu)建體典型的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體含有至少一種啟動子元件，其介導(dǎo)mRNA，抗體編碼序列，以及轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄物的聚腺苷酸化所需信號的轉(zhuǎn)錄起始。其它元件包括增強(qiáng)子、Kozak序列和間插序列，其側(cè)翼具有RNA剪接的供體和受體位點?？梢酝ㄟ^SV40的早期和晚期啟動子，逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)(LTRS),如RSV，HTLVI,HTVI和巨細(xì)胞病毒(CMV)的早期啟動子獲得高度有效的轉(zhuǎn)錄。然而，也可以使用細(xì)胞元件(如人肌動蛋白啟動子)。用于實施本發(fā)明的適當(dāng)表達(dá)載體包括，例如，pIRESlneo,pRetro-Off，pRetro-On,PLXSN,或pLNCX(ClonetechLantibodies,PaloAlto,CA),pcDNA3.1(+/-),pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen),PSVLandPMSG(Pharmacia,Uppsala,Sweden),pRSVcat(ATCC37152),pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC67109)等載體?？梢允褂玫牟溉閯游锼拗骷?xì)胞包括人Hela293，H9和Jurkat細(xì)胞，小鼠NTH3T3和C127細(xì)胞，Cos1,Cos7和CV1,鵪鵓QC1-3細(xì)胞，小鼠L細(xì)胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。作為選擇，可以在含有整合導(dǎo)染色體中的基因的穩(wěn)定細(xì)胞系中表達(dá)基因。用dhfr,gpt,新霉素或潮霉素等選擇性標(biāo)記共轉(zhuǎn)染，可以鑒定和分離被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。也可以擴(kuò)增經(jīng)轉(zhuǎn)染的基因，使其表達(dá)大量被編碼的抗體。用DHFR(二氫葉酸還原酶)標(biāo)記開發(fā)攜帶幾百或甚至幾千拷貝目的基因的細(xì)胞系。另一種有用的選4奪標(biāo)記是谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy,etal.,Biochem.J.227:277-2791991;Bebbington，etal.,Bio/Technology10:169-1751992)。采用這些標(biāo)記，在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞，選擇具有最高抗性的細(xì)胞。這些細(xì)胞系含有整合導(dǎo)染色體中的被擴(kuò)增的基因。通常用中國倉鼠卵巢(CHO)和NSO細(xì)胞產(chǎn)生抗體。表達(dá)載體pCl和pC4含有勞斯肉毒瘤病毒強(qiáng)啟動子(Cullen,etal.,Molec.Cell.Biol.5:438-4471985)plusafragmentoftheCMV-enhancer(Boshart,etal.,Cell41:521-5301985)。多個克隆位點，如具有限制酶裂解位點BamHI,Xbal和Asp718的那些，促進(jìn)了目的基因的克隆。這些載體除3，內(nèi)含子外，還含有大鼠前胰島素原基因的聚腺苷酸化和終止信K.在CHO細(xì)胞中克隆和表達(dá)載體pC4可用于表達(dá)抗體構(gòu)建體。質(zhì)粒pC4是質(zhì)粒pSV2-dhfr(ATCC保藏號37146)的衍生物。該質(zhì)粒含有SV40早期啟動子控制下的小鼠DHFR基因。可以通過在選擇性培養(yǎng)基(例如，a-MEM,LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)中培養(yǎng)細(xì)胞而選擇用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢細(xì)胞或其它缺乏二氫葉酸活性的細(xì)胞，該培養(yǎng)基中添加有化療劑氨曱喋呤?？拱睍踵┻?MTX)的細(xì)胞中的DHFR基因的擴(kuò)增已經(jīng)有記載(參見，例如，F(xiàn).W.Alt，etal.，J.Biol.Chem.253:1357-13701978;J.L.HamlinandC.Ma,Biochem.etBiophys.Acta1097:107-1431990;andM.J.PageandM.A.Sydenham,Biotechnology9:64-681991)。在不斷增加的MTX濃度下培養(yǎng)的細(xì)胞通過靶酶DHFR的過量產(chǎn)生發(fā)生了對藥物的抗性，這是因為DHFR基因的擴(kuò)增。如果將第二種基因連接于DHFR基因，它通常被共擴(kuò)增并且過度表達(dá)。本領(lǐng)域公知該方法可以用于開發(fā)攜帶多于1000拷貝的被擴(kuò)增基因的細(xì)胞系。因此，當(dāng)除去氨曱喋呤時，獲得了含有整合到宿主細(xì)胞的一個或多個染色體的被擴(kuò)增基因。質(zhì)粒pC4含有用于表達(dá)目的基因的老斯肉毒瘤病毒長末端重復(fù)(LTR)的強(qiáng)啟動子(Cullen,etal.,Molec.Cell.Biol.5:438-4471985)和從人巨細(xì)胞病毒(CMV)的立即早期基因的增強(qiáng)子分離的基因(Boshart,etal.,Cell41:521-5301985)。啟動子下游是允許基因整合的BamHI，Xbal和Asp718限制酶裂解位點。該質(zhì)粒在這些克隆位點之后含有3'內(nèi)含子和大鼠前胰島素原基因的聚腺苷酸化位點。其它高效啟動子也可以用于表達(dá)，例如人p肌動蛋白啟動子，SV40早期或晚期啟動子或來自于其它逆轉(zhuǎn)錄病毒，如HIV和HTLVI。Clontech的Tet-Off和Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)和相似的系統(tǒng)可用于在哺乳動物細(xì)胞中以經(jīng)調(diào)節(jié)的途徑表達(dá)修飾的抗體構(gòu)建體(M.Gossen,andH.Bujard,Proc.Natl.Acad.Sd.USA89:5547-55511992)。對于mRNA的聚腺苷酸化，也可以使用例如人生長激素或球蛋白基因的其它信號。攜帶整合到染色體中的目的基因的穩(wěn)定細(xì)胞系也可以通過用可選^^標(biāo)記如gpt,G418或潮霉素共轉(zhuǎn)染而進(jìn)4亍選擇。在開始時，使用G418加氨曱喋呤等一種以上的可選擇標(biāo)記是有利的。用限制酶消化pC4質(zhì)粒，然后通過本領(lǐng)域公知的程序用小牛腸磷酸酶去磷酸化。然后從1%瓊脂糖凝膠分離載體。根據(jù)已知的方法步驟，使用編碼完整的修飾抗體構(gòu)建體的DNA序列，如SEQIDNOS:7和8所示，相當(dāng)于本發(fā)明的修飾抗體構(gòu)建體的HC和LC可變區(qū)。該構(gòu)建體中也使用編碼合適的人恒定區(qū)(即HC和LC區(qū))的分離的核酸。然后用T4DNA連接酶連接分離的可變區(qū)和恒定區(qū)編碼DNA和去磷酸化的載體。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101或XL-lBlue細(xì)胞，并且例如用限制酶分析鑒定含插入pC4質(zhì)粒的片段的細(xì)菌。用缺乏活性的DHFR基因的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用0.5ngpSV2-neo質(zhì)粒采用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染5jug表達(dá)質(zhì)粒pC4。pSV2-neo質(zhì)粒含有顯性可選擇標(biāo)記，即來自于Tn5的neo基因，它編碼一種酶，該酶賦予對包括G418的一組抗生素的抗性。將這些細(xì)胞種植在補加1jug/mlG418的cc-MEM中。兩天后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞并且種才直在雜交瘤克隆板(Greiner,Germany)上，置于補加10，25或50ng/ml氨曱喋呤和ljug/mlG418的oc-MEM中。大約10-14天后，用胰蛋白酶消化單個克隆，然后種植在6孔培養(yǎng)皿或10ml燒瓶中，使用不同濃度的氨曱喋呤(50nM,100nM,200nM,400nM,800nM)。然后將在最高濃度氨甲喋呤下生長的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的6孔板中，該板含有更高濃度的氨曱喋呤(lmM,2mM,5mM,10mM,20mM)。重復(fù)同樣的程序，直到獲得在100-200mM的濃度下生長的克隆。例如，通過SDS-PAGE和蛋白印跡或反相HPLC分析所需基因產(chǎn)物的表達(dá)。L.抗體的純化可以通過/>知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化修飾抗體構(gòu)建體，所述方法包括，但不限于，蛋白A純化，硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陽離子或陰離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水相互作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析和凝集素層析。也可以采用高效液相層析("HPLC")進(jìn)4亍純4匕。(參見，例如，Colligan,CurrentProtocolsinImmunology,或CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY,NY,1997-2001,Chapters1,4,6,8，9,10,每個都以其全部內(nèi)容引入這里作為參考。)J.應(yīng)用本發(fā)明的分離核酸可用于生產(chǎn)至少一種抗體構(gòu)建體或其特定變體，其可用于測定細(xì)胞，組織，器官或動物(包括哺乳動物和人類)中的作用，用于診斷，監(jiān)控，調(diào)節(jié)，治療，減輕，幫助預(yù)防至少一種疾病的發(fā)生，或減輕至少一種疾病的癥狀，該疾病選自，但不限于，至少一種免疫紊亂或疾病，心血管紊亂或疾病，感染的，惡性的，和/或神經(jīng)紊亂或疾病，過敏性紊亂或疾?。黄つw紊亂或疾??；血液紊亂或疾病，和/或肺部紊亂或疾病，或其它已知的或特定的疾病。這種方法可包括對需要這種調(diào)節(jié)，治療，減輕，預(yù)防或減輕癥狀，影響或機(jī)制的細(xì)胞，組織，器官，動物或患者，施用有效量的含有至少一種修飾的抗體構(gòu)建體的組合物或藥物組合物。有效量可包括每單次(例如，丸劑)，多次或連續(xù)給藥大約0.001到500mg/kg的量，或每單次，多次或連續(xù)給藥獲得0.01-5000mg/ml血清濃度的血清濃度，或任何有效范圍或其中的任何值，如這里所述或相關(guān)領(lǐng)域已知的，使用已知的方法進(jìn)4于或確定。K.修飾的抗體構(gòu)建體組合物本發(fā)明也提供至少一種以非天然存在的組合物，混合物或形式提供的修飾抗體構(gòu)建體，其中包括此處描述的和/或本領(lǐng)域公知的至少一種，至少兩種，至少三種，至少四種，至少五種，至少六種或更多其抗體。這些組合物包括含有至少一種本發(fā)明的修飾抗體的非天然存在的組分，和一種藥學(xué)上可接受的載體。這種抗體構(gòu)建體組合物可包括40-99%中任何數(shù)量的本發(fā)明的修飾抗體構(gòu)建體。這種組合物作為液體或干溶液，混合物，混懸液，乳劑或膠體的重量，體積，濃度，摩爾濃度或克分子濃度的百分比，是本領(lǐng)域已知的或如這里所述的。本發(fā)明的修飾抗體構(gòu)建體或特定部分或變體組合物可以進(jìn)一步包含至少一種任意適合的輔助物質(zhì)，例如，但不限于，稀釋劑，粘合劑，穩(wěn)定劑，緩沖液，鹽，親脂溶劑，防腐劑，佐劑等。藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)是優(yōu)選的。這些無菌溶液的非限制性例子和制備方法是本領(lǐng)域熟^口的；(Gennaro,Ed.,Remington'sPharmaceuticalSciences,18<th〉EditionMackPublishingCo.Easton,PA1990.)可以常規(guī)選擇藥學(xué)上可接受的載體，這些載體適于本領(lǐng)域熟知的或如這里所述的修飾抗體構(gòu)建體組合物的給藥，溶解和/或穩(wěn)定模式。用于本發(fā)明的組合物的藥物賦形劑和添加劑包括，但不限于蛋白，肽，氨基酸，脂質(zhì)和碳水化合物(例如，糖，包括單糖，二糖，三糖，四糖和寡糖；衍生糖如醛醇，醛酸，酯化糖等；以及多糖和糖聚合物)，其以單個或組合存在，單獨或組合占重量或體積1-99.99%。示例性的蛋白賦形劑包括血清白蛋白如人血清白蛋白(HSA),重組人白蛋白(rHA),明膠，酪蛋白等等?？梢云鹁彌_作用的代表性氨基酸/修飾的抗體構(gòu)建體或特定部分或變體組合物包括丙氨酸，甘氨酸，精氨酸，甜菜堿，組氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，賴氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，曱硫氨酸，苯丙氨酸，天冬酰胺等。一種優(yōu)選的氨基酸是甘氨酸。適用于本發(fā)明的碳水化合物賦形劑包括，例如，單糖，如果糖，麥芽糖，半乳糖，葡萄糖，D-甘露糖，山梨醇等；二糖，如乳糖，蔗糖，海藻糖，纖維二糖等；多糖，如棉籽糖，松三糖，麥芽糖糊精，右旋糖苷，淀粉等；以及醛醇，如甘露醇，木糖醇，麥芽糖醇，乳糖醇，木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)，肌醇等。用于本發(fā)明的優(yōu)選的碳水化合物賦形劑是甘露醇，海藻糖和棉籽糖。修飾的抗體構(gòu)建體組合物也可包含緩沖液或pH調(diào)節(jié)劑；一般地，緩沖液是由有機(jī)酸或堿制備的鹽。代表性的緩沖液包括有機(jī)酸鹽，例如檸檬酸，抗壞血酸，葡萄糖酸，碳酸，酒石酸，琥珀色，乙酸或鄰苯二曱酸的鹽；Tns，氨丁三醇鹽酸鹽或磷酸緩沖液。用于本發(fā)明組合物的優(yōu)選緩沖液是有機(jī)酸鹽如檸檬酸鹽。此外，本發(fā)明的修飾抗體構(gòu)建體或特定部分或變體組合物可包含聚合物賦形劑/添加劑，如聚乙烯吡咯烷酮，聚蔗糖(一種聚合的糖)，葡萄糖結(jié)合劑(例如，環(huán)糊精，如2-羥基丙基-P-環(huán)糊精)，聚乙二醇，調(diào)味劑，抗微生物劑，甜味劑，抗氧化劑，抗靜電劑，表面活性劑(例如，聚山梨醇酯如'TWEEN20"和'TWEEN80")，脂質(zhì)(例如，磷脂，脂肪酸)，類固醇(例如，膽固醇)和螯合劑(例如，EDTA)。適用于本發(fā)明的修飾抗體構(gòu)建體組合物的這些和其它的已知藥物I武形劑和/或添加劑是本領(lǐng)域已知的，(例如，列于Remington:TheScience&PracticeofPharmacy,19thed.,Williams&Williams,1995;Physician'sDeskReference,52nded.,MedicalEconomics,Montvale,NJ1998,以其全部公開內(nèi)容引入這里作為參考。)優(yōu)選的載體或賦形劑物質(zhì)是碳水化合物(例如，糖和醇)和緩沖劑(例如，檸檬酸鹽)或聚合劑。L.制劑如前面所指出的，本發(fā)明提供了穩(wěn)定的制劑，優(yōu)選為含有鹽或選擇的鹽的磷酸緩沖液，以及含有防腐劑的儲存溶液和制劑，以及適于藥用或獸醫(yī)用途的多用途儲存制劑，它包含置于藥學(xué)上可接受制劑中的至少一種修飾的抗體構(gòu)建體。儲存制劑包含至少一種已知的防腐劑或任選選自至少一種苯酚，間甲酚，對曱酚，鄰甲酚，氯曱酚，苯曱醇，亞硝酸苯汞，苯曱氧基乙醇，曱醛，氯丁醇，氯化鎂(例如，六水化合物)，對羥基苯曱酸烷基酯(曱基，乙基，丙基，丁基等)，苯扎氯銨，苯索氯銨，脫氳乙酸鈉和乙基汞石克代水楊酸鈉，或其在水溶性稀釋劑中的混合物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的任何適當(dāng)濃度或混合物，例如，0.001-5%,或其中的任何范圍或任意值，例如，但不限于0.001,0.003,0.005,0.009,0.01,0.02,0.03,0.05,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4.,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0,4.3,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,或其中的任何范圍或任意值。非限制性實例包括，無防腐劑，0.1-2%間曱酚(例如，0.2,0.3.0.4,0.5,0.9,1.0%)，0.1-3%苯曱醇(例如，0.5,0.9,1.1.,1.5，1.9,2.0,2.5%),0.001-0.5%乙基汞石克代水楊酸鈉(例如，0.005,0.01),0.001-2.0%笨酚(例如，0.05,0.25,0.28,0.5,0.9,1.0%),0.0005-1.0%對羥基苯甲酸烷基酯(例如，0.00075,0.0009,0.001,0.002,0.005,0.0075,0.009,0.01，0.02，0.05，0.075，0.09,0.1,0.2,0.3,0.5,0.75,0.9,1.0%)等。如前面指出的，本發(fā)明提供了一種制品，包括包裝材料和至少一個管形瓶，其中包含至少一種修飾的抗體構(gòu)建體和規(guī)定的緩沖液和/或防腐劑，任選溶于一種水性稀釋劑，其中所述包裝材料包括一種標(biāo)簽，它指出所述溶劑可以保留1,2,3,4,5,6,9,12,18,20,24,30,36,40,48,54,60,66,72小時或更長的時間。本發(fā)明更進(jìn)一步包括一種制品，包括包裝材料和含有至少一種凍干的修飾抗體構(gòu)建體的第一個管形瓶，和含有規(guī)定的緩沖液或防腐劑的水性稀釋劑的第二個管形瓶，其中包裝材料包括一種標(biāo)簽，它指導(dǎo)患者在水性稀釋劑中重構(gòu)至少一種修飾的抗體構(gòu)建體，以便形成可以保留24小時或更長時間的溶液。本發(fā)明的產(chǎn)品中至少一種修飾的抗體構(gòu)建體的范圍包括在濕/干體系中重構(gòu)時，產(chǎn)生約1.0yg/ml至約1000mg/ml的量，但更低或更高的濃度也是可行的，而且依賴于準(zhǔn)備使用的傳遞載體，例如，溶液制劑將不同于經(jīng)皮貼劑，肺，經(jīng)粘膜或滲透或微泵方法。優(yōu)選地，水性稀釋劑任選進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的防腐劑。優(yōu)選的防腐劑包括選自苯酚，間甲酚，鄰曱酚，氯曱酚，苯曱醇，對羥基苯甲酸烷基酯(甲基，乙基，丙基，丁基等)，苯扎氯銨，苯索氯銨，脫氫乙酸鈉和乙基汞硫代水楊酸鈉，或其混合物的那些。用于制劑中的防腐劑的濃度為足以產(chǎn)生抗微生物作用的濃度。這些濃度取決于選擇的防腐劑，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定?？梢匀芜x和優(yōu)選將其它賦形劑，如等滲劑，緩沖液，抗氧化劑，防腐增強(qiáng)劑，加入稀釋劑中。甘油等等滲劑通常以公知的濃度使用。優(yōu)選加入生理耐受的緩沖液以改進(jìn)pH調(diào)控。制劑可以有寬范圍的pH值，例如pH約4到10,優(yōu)選pH范圍為約5到9，最優(yōu)選pH范圍為約6到8。優(yōu)選地，本發(fā)明制劑的pH為約6.8到7.8。優(yōu)選的緩沖液包括磷酸緩沖液，最優(yōu)選為磷酸鹽，特別是磷酸緩沖鹽水(PBS)。也可以任選向制劑或組合物中加入其它添加劑，如藥學(xué)上可4妄受的增溶劑，如Tween20(聚氧乙烯(20)山梨糖醇肝單月桂酸酯)，TWEEN40(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單椋櫚酸酯)，TWEEN80(聚氧乙烯(20)山梨糖醇肝單油酸酯)，PluronicF68(聚氧乙烯聚氧嵌段共聚物)，和PEG(聚乙二醇)或非離子表面活性劑，例如，polysorbate20或80或poloxamer184或188,Pluronic多元醇或其它共聚物，以及螯合劑如EDTA和EGTA,以減少聚集。如果用泵或塑料容器施用制劑，這些添加劑是特別有用的。藥學(xué)上可接受的表面活性劑的存在減少了蛋白聚集的傾向?？梢酝ㄟ^以下方法制備本發(fā)明的制劑，包括將至少一種抗體構(gòu)建體和選自苯酚，間曱酚，鄰曱酚，氯甲酚，苯曱醇，對羥基苯甲酸烷基酯(曱基，乙基，丙基，丁基等)，苯扎氯銨，苯索氯銨，脫氫乙酸鈉和乙基汞硫代水楊酸鈉，或其混合物在一種水性稀釋劑中混合。采用常規(guī)的溶解和混合步驟在一種水性稀釋劑中混合至少一種抗體構(gòu)建體和防腐劑。為了制備適當(dāng)?shù)闹苿?，可以將測得量的溶于緩沖液中的至少一種抗體構(gòu)建體在其量足以提供所需濃度的蛋白和防腐劑的緩沖液中混合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以了解該方法的變化。例如，加入各成分的順序，是否使用其它添加劑，制備該制劑的溫度和pH都是可以對使用的濃度和給藥方式進(jìn)行優(yōu)化的因素?？梢詫⒈景l(fā)明的制劑以澄清的溶液和作為雙管形瓶的形式提供給患者，雙管形瓶包含一個裝有至少一種凍干的抗體構(gòu)建體的管形瓶，將其用含有水，防腐劑和/或賦形劑，優(yōu)選磷酸緩沖劑和/或鹽水和溶于水性稀釋劑中的選擇的鹽的第二個管形瓶重構(gòu)。單一溶液的管形瓶或要求重構(gòu)的雙管形瓶可以重復(fù)使用多次，并且可以滿足患者治療的單個或多個周期，因此比當(dāng)前存在的方法提供更方便的治療方案。本發(fā)明的制品可用于在24小時左右或更長的時間內(nèi)既要。因此，本發(fā)明的制品為患者提供了顯著的優(yōu)勢。本發(fā)明的制劑任選可以在約2-4(TC的溫度下儲存，并且長時間保持蛋白的生物活性，因此，包裝標(biāo)簽指出，該溶液可以在超過6，12,18,24,36,48，72或96小時或更長時間內(nèi)保留和/或使用。如果使用儲存的稀釋液，該標(biāo)簽包括可以在l-12個月，半年，一年半和/或兩年的時間內(nèi)用完。本發(fā)明的至少修飾的抗體構(gòu)建體溶液可以通過包括在水稀釋液中混合至少一種抗體的方法而制備。采用常規(guī)的溶解和混合步驟進(jìn)行混合。為了制備適當(dāng)?shù)南♂屢?，例如，可以將測得量的溶于水或緩沖液中的至少一種抗體以足以提供所需濃度的蛋白和任選的防腐劑或緩沖液的量混合。本領(lǐng)域4支術(shù)人員可以了解該方法的變化。例如，加入各成分的順序，是否使用其它添加劑，制備該制劑的溫度和pH都是可以對使用的濃度和給藥方式進(jìn)行優(yōu)化的因素。本發(fā)明的產(chǎn)品可以以澄清的溶液或作為雙管形瓶的形式提供給患者，雙管形瓶包含一個裝有至少一種凍干的抗修飾的抗體構(gòu)建體的管形瓶，將其用含有水性稀釋溶液的第二個管形瓶重構(gòu)。單一溶液的管形瓶或要求重構(gòu)的雙管形瓶可以重復(fù)使用多次，并且可以滿足患者治療的單個或多個周期，因此，比當(dāng)前存在的方法提供更方便的治療方案。本發(fā)明的產(chǎn)品可以以澄清的溶液或作為雙管形瓶的形式提供給藥店，診所，或其它機(jī)構(gòu)和設(shè)施，從而直接提供給患者，其中雙管形瓶包含一個裝有至少一種凍干的修飾抗體構(gòu)建體的管形瓶，將其用含有水稀釋液的第二個管形瓶重構(gòu)。在此情況下的澄清溶液最多可達(dá)1升或甚至更多，提供于大的儲存容器，從中可以一次或多次取出至少一種抗體溶液的更小部分，將其轉(zhuǎn)移至更小的管形瓶中，由藥店或診所提供給它們的客戶和/或患者。公認(rèn)的包括這些單個管形瓶體系的設(shè)備包括用于遞送溶液的筆式注射器，例如，BDPens,BDAutojector,Humaject,NovoPen,B-DPen,AutoPen⑧，以及OptiPen,GenotropinPen,GenotronormPen,HumatroPen,Reco-Pen,RoferonPen,Biojector,iject,J-tipNeedle-FreeInjector,Mraject,Medi-Ject,例i口，由以下/>司生產(chǎn)BectonDickensen(FranklinLakes,NJ，www.bectondickenson.com),Disetronic(Burgdorf,Switzerland,www.disetronic.com;Bioject,Portland,Oregon(www.bioject.com);NationalMedicalProducts,WestonMedical(Peterborough,UK,www.weston-medical.com),Medi-JectCorp(Minneapolis,MN,www廁dije汰CQm)。公認(rèn)的包括雙管形瓶體系的設(shè)備包括用于在藥筒中遞送重構(gòu)的凍千藥物的筆式注射器系統(tǒng)，例如HumatroPen。當(dāng)前要求保護(hù)的產(chǎn)品包括包裝材料。除了管理部分要求的信息，包裝材料提供了可以使用該產(chǎn)品的條件。本發(fā)明的包裝材料為患者提供了用兩個管形瓶中的濕/干產(chǎn)品在水稀釋液中重構(gòu)至少修飾的抗體構(gòu)建體，以形成溶液，并且在2-24小時或更長時間內(nèi)4吏用該溶液的i兌明。對于單一管形瓶中的溶液產(chǎn)品，該標(biāo)簽說明該溶液可以在2-24小時或更長的時間內(nèi)使用。當(dāng)前要求保護(hù)的產(chǎn)品可用于人類藥用產(chǎn)品的用途。本發(fā)明的制劑可以通過以下方法制備，包括混合至少一種修飾的抗體構(gòu)建體和選定的緩沖液，優(yōu)選含有鹽水或選定的鹽的磷酸緩沖液。用常規(guī)溶解和混合步驟在水性緩沖液中混合至少一種抗體和緩沖劑。為了制備適當(dāng)?shù)闹苿?，可以將測得量的溶于水和緩沖液中的至少一種抗體以足以提供所需濃度的蛋白和緩沖劑的量于所需緩沖劑在水中混合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以了解該方法的變化。例如，加入各成分的順序，是否使用其它添加劑，制備該制劑的溫度和pH都是可以對使用的濃度和給藥方式進(jìn)行優(yōu)化的因素。要求保護(hù)的穩(wěn)定或儲存的制劑可以以澄清的溶液或作為雙管形瓶的形式提供給患者，雙管形瓶包含一個裝有至少一種凍干的抗修飾的抗體構(gòu)建體的管形瓶，將其用含有溶于水稀釋液的防腐劑或緩沖劑和賦形劑的第二個管形瓶重構(gòu)。單一溶液的管形并瓦或要求重構(gòu)的雙管形并瓦可以重復(fù)使用多次，并且可以滿足患者治療的單個或多個周期，因此比當(dāng)前存在的方法提供更方便的治療方案?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明提供通過各種遞送方法給予患者此處描述的至少一種修飾的抗體構(gòu)建體的穩(wěn)定或儲存制劑或溶液，所述方法包括SC或IM注射；經(jīng)皮，肺部，經(jīng)粘膜，植入，滲透泵，藥筒，微泵，或其它本領(lǐng)域公知的本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的方法。M.治療用途本發(fā)明還提供了一種使用本發(fā)明的至少一種修飾的抗體構(gòu)建體調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞，組織，器官，動物或患者中的本領(lǐng)域公知的或此處描述的疾病的方法。本發(fā)明還提供了一種用于調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞，組織，器官，動物或患者中的至少一種疾病，包括但不限于，至少一種肥胖，免疫相關(guān)的疾病，心血管疾病，傳染病，惡性疾病或神經(jīng)疾病的方法。一般地，病理情況的治療受施用的至少一種修飾的抗體構(gòu)建體組合物的有效量或劑量的影響，其總量，平均的，為每千克患者每劑量至少大約0.01到500毫克的至少一種抗Santibody,優(yōu)選每千克患者每單次或多次給藥至少大約0.1到100毫克修飾的抗體構(gòu)建體，取決于組合物中所含的特定活性。作為選擇，有效血清濃度可包括每單次或多次給藥0.1-5000Mg/ml血清濃度。適合的劑量是醫(yī)生已知的，而且,當(dāng)然，取決于特別的疾病狀況，被施用的組合物的特定活性,以及正在進(jìn)4亍治療的特定患者。在有些情況下，為了獲得想要的治療量，提供重復(fù)給藥,也即,特定監(jiān)控或計量劑量的重復(fù)單獨給藥也是必要的,其中重復(fù)進(jìn)行單獨給藥直到獲得所需的日劑量或作用。優(yōu)選的劑量可任選包括O.l-100mg/kg/給藥，或其中的任何范圍，值或部份，或獲得每單次或多次給藥0.1-5000^^/1111血清濃度的血清濃度，或其中的任何范圍，值或部份。做為選擇，施用的劑量可以根據(jù)已知因素而改變，如特定試劑的藥效特性，和它的給藥模式和途徑；接受者的年齡，健康和體重；癥狀的特性和程度，并行治療的種類，治療的頻率和想要的效果。通常，活性成分的劑量可以為每公斤體重大約0.1到100毫克。一般，每公斤每給藥0.1到50,優(yōu)選O.l到IO毫克，或以持續(xù)釋放的形式，對獲得想要的結(jié)果是有效的。適于體內(nèi)給藥的劑型(組合物)一般包括每單位或容器大約0.1毫克到大約500毫克的活性成分。在這些藥物組合物中，根據(jù)組合物的總重量，按重量計算活性成分一般以大約0.5-99.999%的量存在。至于腸胃外投藥，抗體可以配制成溶液，混懸液，乳劑或凍干粉末，與藥學(xué)上可接受的腸胃外載體一起或單獨提供。這種載體的例子是水，鹽水，生理鹽水，右旋糖溶液和1-10%的人血清白蛋白。脂質(zhì)體和非水的載體如固定油類也可以使用。載體或凍干粉末可以包含能保持等滲性(例如，氯化鈉，甘露糖醇)和化學(xué)穩(wěn)定性(例如，緩沖液和防腐劑)的添加劑。可以通過已知的或適用技術(shù)對制劑進(jìn)行滅菌。Remington'sPharmaceuticalSciences,A.Osol的最新版本中描述了適合的藥學(xué)載體，其是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考教科書。已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了大概的描述，參考下面的實施例更容易理解本發(fā)明，實施例為了例示而提供的，而不是為了進(jìn)行限定。實施例1修飾抗體的制備使用PCR擴(kuò)增和重組DNA方法制備編碼經(jīng)修飾的Ab的基因，以a)用編碼相同Ab的Vl和CL結(jié)構(gòu)域的DNA序列取代編碼IgGl,kAb的VH和CH1結(jié)構(gòu)域的DNA序列，和b)用編碼相同Ab的VH和CH1結(jié)構(gòu)域的DNA序列取代編碼相同Ab的Vl和Cl結(jié)構(gòu)域的DNA序列。為了制備編石馬VL-CL畫hg-CH2-CH3HC的質(zhì)庫立，包含原始的LCcDNA序列的質(zhì)粒p3123在重疊PCR方案中用作模板，擴(kuò)增從ATG翻譯起始密碼子延伸到信號序列，V和Ct結(jié)構(gòu)域的765bp的片段。用于51導(dǎo)反應(yīng)的下游的寡核苷酸，更進(jìn)一步地用于以編碼IgGlHC鉸鏈序列的前23個堿基置換緊接著Ck編碼序列的天然存在的翻譯終止密碼子。其后包含原始的HCcDNA序列的質(zhì)粒p3122用于擴(kuò)增的715bp的片段的第二個PCR反應(yīng)，所述片段包括CL編碼序列的最后22個堿基(整合到上游寡核苷酸引物中)，以及其后的編碼鉸鏈，Ch2和Ch3結(jié)枸域。下游的寡核苷酸引物提供了Notl限制性位點。兩個PCR產(chǎn)物有效地加入到包含765bp和715bp的擴(kuò)增產(chǎn)物的第三個PCR反應(yīng)中，上游寡核苷酸引物來自于第一個PCR反應(yīng)，下游寡核苷酸引物來自于第二個PCR反應(yīng)。擴(kuò)增因此取決于在它們兩個都包含的22bp的重疊序列處交叉退火(cross-annealing)的兩個片段。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1480bp,編碼VL-CL-hg-CH2-CH3,而且其兩翼分別為Xbal和Notl限制性位點。用Xbal和Notl消化擴(kuò)增的DNA，并克隆到載體p2106的Xbal與Notl位點之間，以形成最終的表達(dá)質(zhì)粒p4034，其編碼新的HC。載體p2106才是供了CMV立即早期啟動子和ATG起始密碼子的內(nèi)含子A上游區(qū)，以及SV40來源的轉(zhuǎn)錄終止序列。為了制備編碼VH-CH1LC的質(zhì)粒，包含原始的HCcDNA序列的質(zhì)粒p3122在寡核苷酸引導(dǎo)的PCR反應(yīng)中用作模板，所述的PCR反應(yīng)擴(kuò)增從ATG翻譯起始密碼子延伸到信號序列，V和CHl結(jié)構(gòu)域的808bp的片段。擴(kuò)增的產(chǎn)物包含緊跟在位于CH1結(jié)構(gòu)域的C-末端的DKKV氨基酸序列后面的翻譯終止密碼子。還提供了寡核苷酸引物，用于克隆，ATG起始密碼子的Xbal限制性位點上游區(qū)和終止密碼子的Notl限制性位點下游區(qū)。用Xbal和Notl消化擴(kuò)增的DNA,并將裂解DNA克隆到質(zhì)粒載體p2106的Xbal與Notl位點之間，以形成最終的表達(dá)質(zhì)粒p4033,其編碼新的LC。為了通過共表達(dá)新的HC和新的LC質(zhì)粒來制備經(jīng)修飾的Ab,將人HEK293細(xì)胞用質(zhì)粒p4033和p4034通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。簡要地，在轉(zhuǎn)染前一天，把生長于含有10%FBS的DMEM中的細(xì)胞，置于6孔平板中，并于5%C02培養(yǎng)箱中37。C孵育過夜。第二天，lng重懸于100yl無血清培養(yǎng)基(Opti-MEMI)中的p4033和p4034,與10M1脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行混合,并室溫放置10分鐘。吸出培養(yǎng)基使其與細(xì)胞分離，并添加含有10%FBS的新鮮DMEM。孵育以后，把DNA/月旨質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物添加到細(xì)胞中，并輕輕地渦漩進(jìn)行混合。于5%C02培養(yǎng)箱中37。C更進(jìn)一步地醉育72小時以后，使抗體表達(dá)和分泌，收集細(xì)胞上清液并離心以除去細(xì)胞碎屑。為了測試細(xì)胞上清液中經(jīng)修飾的Ab的存在，使用4種不同的捕獲試劑進(jìn)行ELISA分析。96孔EIA平板用下述試劑進(jìn)行涂布，a)山羊多克隆抗人IgGFc片段Ab，b)原始的AbV區(qū)特異性的C508單克隆Ab,c)原始的AbV區(qū)的個體基因型部分(抗原結(jié)合)特異性的C585單克隆Ab,和d)與C508和C585(小鼠IgG2bk)相同的同種型的陰性對照單克隆Ab。在pH9.5的0.05M的碳酸鹽緩沖液中進(jìn)行涂布，并于4。C孵育過夜。使用溶于PBS的1%BSA封閉平板。對來自HEK293細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清液進(jìn)行連續(xù)稀釋，并添加到封閉的平板上。對照樣品，其含有用編碼原始的、未經(jīng)修飾的Ab，與純化的原始Ab的質(zhì)粒p3122與p3123同時轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的細(xì)胞上清液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。捕獲的蛋白使用HRP標(biāo)記的山羊抗人Fc-y抗體與TMB底物進(jìn)行檢測。顯色反應(yīng)用0.5MHC1終止。于450nm對平一反進(jìn)行讀數(shù)。當(dāng)抗人IgGFc片^殳Ab用作捕獲試劑時，獲得的陽性ELISA信號顯示，Ab樣分子確實存在于用經(jīng)修飾的HC與經(jīng)修飾的LC轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清液中。除非與LC結(jié)合，HC通常不從細(xì)胞分泌，該結(jié)果表明經(jīng)修飾的HC與LC有可能彼此結(jié)合，從而形成IgGAb典型的(HL)2四鏈復(fù)合物。它還表明，山羊抗人FcAb能較好的識別經(jīng)修飾的Ab的Fc結(jié)構(gòu)域上的抗原表位。假設(shè)利用山羊抗人FcAb與經(jīng)修飾的Ab，以及未經(jīng)修飾的Ab同等地反應(yīng)，使用原始的Ab標(biāo)準(zhǔn)曲線對ELISA數(shù)據(jù)進(jìn)行的計算顯示，經(jīng)修飾的Ab的表達(dá)水平(~2.7mg/ml)與未經(jīng)修飾的Ab的表達(dá)水平(~2.0jug/ml)相似。利用來源于未經(jīng)修飾的Ab標(biāo)準(zhǔn)的濃度，繪制了修飾的與未經(jīng)修飾的Ab樣品結(jié)合抗V區(qū)AbC508與C585相對于蛋白濃度的圖表。結(jié)果表明，修飾與未經(jīng)修飾的Ab的結(jié)合是不能區(qū)分開的。這表示經(jīng)修飾的Ab中完全保留了C508與C585單克隆Ab的V區(qū)結(jié)合位點。用于制備經(jīng)修飾的Ab基因的寡核苷酸引物-新的LC5，5，-TGTCTAGA八GCTGGGTAC-3，Xba丄新的LC3，5'-AAGCGGCCGCCTAAACTTTCTTGTCCACCTTGGTG-3，翻.新的HC5，5'-TGTCTAGAAGCTGGGTAC-3'Xbal新的LC重疊序列5'-GAGCTTCAACM3G(;GAGAGTGTa4GCCC掘rC7TGrG^GL^L4C-3，-3，LC的3'末端4交^i的5'末端新的LC重疊序列5,_G7TrrGrc4C/WG/1)77Cj'GGCrCACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3，鉸鏈的5'末端LC的3'末端權(quán)利要求1.一種異二聚體蛋白結(jié)合組合物，其包括一種具有重鏈與輕鏈的經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子，其中所述的免疫球蛋白分子中的一個或多個輕鏈結(jié)構(gòu)域被免疫球蛋白重鏈上的一個或多個重鏈結(jié)構(gòu)域取代，和/或一個或多個重鏈結(jié)構(gòu)域被免疫球蛋白輕鏈上的一個或多個輕鏈結(jié)構(gòu)域取代。2.權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子，其中VL-CL輕鏈結(jié)構(gòu)域被免疫球蛋白重鏈的Vh-Ch1區(qū)域取代，而且重鏈的Vh-Ch1結(jié)構(gòu)域被免疫球蛋白輕鏈的VL-CL輕鏈區(qū)取代。3.權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子，其中該免疫球蛋白分子是IgGl。4.權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子更進(jìn)一步地包含抗原結(jié)合區(qū)。5.權(quán)利要求的經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子，其中該免疫球蛋白分子是IgA，IgG,IgM，IgE或IgD分子。6.—種編碼權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子的多核苷酸。7.—種包含權(quán)利要求6的多核苷酸的載體。8.—種用權(quán)利要求8的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。9.一種生產(chǎn)修飾的免疫球蛋白分子的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，并回收所產(chǎn)生的修飾的免疫球蛋白分子。10.權(quán)利要求9的方法，其中該細(xì)胞是真核或原核細(xì)胞。11.權(quán)利要求10的方法，其中該細(xì)胞是哺乳動物，鳥類，爬蟲類，昆蟲，植物，細(xì)菌，真菌或酵母細(xì)胞。12.權(quán)利要求11的方法，其中該哺乳動物細(xì)胞是人，兔，鼠，老鼠，倉鼠或牛的細(xì)胞。13.權(quán)利要求12的方法，其中該宿主細(xì)胞是選自下述的至少一種細(xì)胞，即COS-1，COS-7,HEK293,BHK21,CHO,BSC-1,HepG2,653,SP2/0,NS/0，HeLa,其他骨髓瘤或淋巴瘤細(xì)胞，或其任何衍生物，無限增殖或轉(zhuǎn)化細(xì)胞。14.一種藥物組合物，其包括權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子和藥學(xué)上可接受的載體。15.—種治療或防止個體中感染的方法，包括給個體施用權(quán)利要求14的組合物。16.—種核酸組合物，其包含權(quán)利要求6的分離的核酸與載體或稀釋劑。17.權(quán)利要求7的抗體載體，其中所述的載體包含選自晚期或早期SV490啟動子，CMV啟動子，HSVtk啟動子，pgk(磷酸甘油酸激酶)啟動子，人免疫球蛋白啟動子或EF-1oc啟動子的至少一個啟動子。18.權(quán)利要求7的抗體載體，其中所述的載體包含至少一個選自氨甲喋呤(MTX),綠色熒光蛋白(GFP),二氫葉酸還原酶(DHFR),新霉素(G418)或谷氨酰胺合成酶(GS)的至少一種選擇基因或其部分。19.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的免疫球蛋白的方法，包括翻譯權(quán)利要求6的核酸或在嚴(yán)格條件下于體外、體內(nèi)或原位條件下與其雜交的內(nèi)源核酸，以可檢測的或可回收的量表達(dá)所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白。20.—種調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織、器官或動物中的至少一種紊亂或疾病的方法，包括使所述的細(xì)胞，組織，器官或動物接觸紊亂或疾病調(diào)節(jié)有效量的至少一種權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的免疫球蛋白，或?qū)λ龅募?xì)胞、組織、器官或動物施用紊亂或疾病調(diào)節(jié)有效量的至少一種權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的免疫球蛋白。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述的有效量是每千克所述的細(xì)胞、組織、器官或動物0.01-100mg。22.權(quán)利要求20-21中任一項所述的方法，其中所述的接觸或所述的施用是通過至少一種選自靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，colus,皮下，呼吸，吸入，陰道，直腸，口頰，舌下，鼻內(nèi)或經(jīng)皮的模式。23.—種制劑，其含有至少一種權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的免疫球蛋白，以及選自無菌水，無菌緩沖的水中的至少一種，或至少一種溶于水稀釋液的選自苯酚，間曱酚，對甲酚，鄰甲酚，氯甲酚，苯曱醇，亞硝酸苯汞，苯氧乙醇，曱醛，氯代丁醇，氯化鎂，對羥基苯甲酸烷基酯，苯扎氯銨，千索氯銨，脫氫乙酸鈉和乙基汞石危代水楊酸鈉，或其混合物的防腐劑。24.權(quán)利要求23的制劑，其中修飾的免疫球蛋白的濃度是大約0.1mg/ml到大約100mg/ml。25.權(quán)利要求24的制劑，更進(jìn)一步地包含等滲性試劑。26.權(quán)利要求25的制劑，更進(jìn)一步地包含生理學(xué)上可接受的緩沖液。27.—種制劑，其含有裝于第一個容器中的凍千形式的至少一種權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的免疫球蛋白，以及任選的第二個容器，其含有無菌水，無菌緩沖的水，或至少一種溶于水稀釋液的選自苯酚，間曱酚，對甲酚，鄰曱酚，氯曱酚，苯甲醇，亞硝酸苯汞，苯氧乙醇，曱醛，氯代丁醇，氯化鎂，對羥基苯曱酸烷基酯，苯扎氯銨，千索氯銨，脫氫乙酸鈉和乙基汞硫代水楊酸鈉，或其混合物的防腐劑。28.—種治療患者中的疾病或不適的方法，包括對需要其的患者施用權(quán)利要求24的制劑。29.—種生產(chǎn)至少一種權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的免疫球蛋白的方法，包括使一種宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞以可回收的量表達(dá)所述的抗體或特定部分或變體。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，植物細(xì)胞或酵母細(xì)胞。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因動物是哺乳動物。32.權(quán)利要求33的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動物選自山羊，牛，綿羊，馬和非人靈長類動物。33.—種表達(dá)至少一種權(quán)利要求1的抗體的轉(zhuǎn)基因動物或植物。34.通過權(quán)利要求29的方法生產(chǎn)的至少一種修飾的免疫球蛋白。35.—種修飾具有FcR結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Clq結(jié)合結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白分子募集效應(yīng)因子的功能的方法，所述的效應(yīng)因子在諸如ADCC,FcR介導(dǎo)的吞噬作用和補體裂解中起作用，該方法包括用免疫球蛋白重鏈上的一個或多個重鏈結(jié)構(gòu)域取代一個或多個輕鏈結(jié)構(gòu)域，和/或用免疫球蛋白分子的免疫球蛋白輕鏈上的一個或多個輕鏈結(jié)構(gòu)域取代一個或多個重鏈結(jié)構(gòu)域，從而重新調(diào)整FcR結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Clq結(jié)合結(jié)構(gòu)域相對于免疫球蛋白分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相對位置。全文摘要本發(fā)明涉及一種通過替換IgGFab結(jié)構(gòu)域內(nèi)的重鏈和輕鏈序列，以重新調(diào)整Fc結(jié)構(gòu)域相對于抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的位置，來制備修飾的免疫球蛋白組合物，從而使抗原結(jié)合和效應(yīng)因子功能最大化。文檔編號C07K16/00GK101218251SQ200680014555公開日2008年7月9日申請日期2006年2月24日優(yōu)先權(quán)日2005年2月28日發(fā)明者B·斯卡倫申請人:森托科爾公司