專利名稱：一種牡蠣鰓部菌群的pcr-dgge分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種牡蠣鰓部菌群的PCR-DGGE分析方法。
背景技術(shù)：
牡蠣是福建省大宗特色水產(chǎn)品，每年產(chǎn)量約占全國產(chǎn)量1/2，不僅產(chǎn)量豐富，而且具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，其軟體部分蛋白質(zhì)含量高達50%，素有“海洋牛奶”之稱，同時含有豐富的ω — 3多不飽和脂肪酸。但由于牡蠣體內(nèi)富含浸出物，體表被覆多種黏液，尤其是開殼后的牡蠣，更有利于微生物繁殖，給牡蠣的食用品質(zhì)和安全品質(zhì)帶來潛在的隱患。牡蠣作為濾食性的海洋貝類，其鰓部在攝食中富集營養(yǎng)物質(zhì)的同時也聚集了大量微生物，在開殼后，由于該部位營養(yǎng)豐富，微生物大量繁殖而導致牡蠣發(fā)酸發(fā)臭，最終失去食用價值。很多學者也因此而致力于研究牡蠣保鮮技術(shù)和保鮮過程中微生物的變化規(guī)律，曹榮發(fā)表了“一種復合型生物保鮮劑在牡蠣保鮮中的應(yīng)用研究”和“氣調(diào)包裝對太平洋牡蠣冷藏保鮮效果的研究”，莊榮玉發(fā)表了 “凈化后的褶牡蠣細菌菌相分析”的文獻，在文獻中分別采用涂膜保鮮和氣調(diào)保鮮技術(shù)，用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)，并分析了牡蠣中的優(yōu)勢菌。該方法工作繁重，耗時長，未有效分析腸道和鰓部菌群的變化。目前關(guān)于保鮮牡蠣微生物的研究仍然以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)為主，該方法存在以下四個方面的問題一是自然界的微生物有70%是無法培養(yǎng)的，而鰓部菌群復雜，有些是不可培養(yǎng)的；二是該方法的分離培養(yǎng)周期長，操作繁瑣，需要耗費大量的人力物力；三是該方法無法真實而直接反映牡蠣鰓部菌群原始狀態(tài)，無法準確分析牡蠣腐敗菌群；四是保鮮方法大部分是對牡蠣外部菌群的控制，特別是鰓部的微生物，而目前的研究在分析不同保鮮技術(shù)對菌群影響時，對整個牡蠣機體的菌群進行傳統(tǒng)分離培養(yǎng)，導致大部分腸道菌群干擾分析的準確性。變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)是Muyzer等人在1993年首次應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究，并在之后十幾年內(nèi)得到迅速的發(fā)展和完善。DGGE是一種可以將長度相同但核苷酸序列不同的雙鏈DNA片段分開的一種方法，進而研究微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。DGGE對于研究微生態(tài)系統(tǒng)的菌群具有高通量，快速，有效，準確等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是以牡蠣為研究對象，解決傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法應(yīng)用于研究微生物所帶來的不足，而建立的一種牡蠣鰓部菌群的PCR-DGGE分析方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的具體步驟如下
本發(fā)明的分析方法包括DNA提取、巢式PCR擴增、變性梯度凝膠電泳DGGE、對DGGE指紋圖譜進行聚類分析；其中所述DNA提取的步驟如下
(I)取牡蠣鰓部組織I 5g，剪碎后，加入50mL的生理鹽水中，150rpm震蕩20min，200目絹布過濾，取濾液800rpm離心IOmin,去沉淀,清液8000rpm離心IOmin,收集菌體重懸浮于TE中，_20°C保存?zhèn)溆茫?2)菌體樣品經(jīng)裂解、抽提、異丙醇沉淀和乙醇洗滌，所得DNA沉淀溶解于TE，-20°C保存?zhèn)溆茫?br> 步驟(2)所述的裂解采用溶菌酶和SDS :首先在菌體樣品中加入20 100 μ L 10mg/mL的溶菌酶，37°C保溫lh，然后依次加入100 μ L 10% SDS和0.3 O. 5mg蛋白酶K干粉，55°C保溫Ih ；
步驟(2)所述的抽提參數(shù)為氯仿異戍醇v/v=24:1抽提,2000 5000rpm離心5 IOmin,上清用酹氯仿:異戍醇v/v=25:24:1抽提, 3000 8000rpm離心5 IOmin,上清用氯仿異戊醇v/v=24:l再次抽提，10000 rpm離心5 lOmin，吸取上清，用于異丙醇沉淀。DNA提取的步驟中所提取的DNA無需進一步純化，直接用于巢式PCR擴增。所述巢式PCR擴增，分兩個步驟第一步采用細菌通用引物對27F，1492R進行16SrDNA擴增；第二步采用帶40GC夾子的引物對338F-GC，518R進行V3區(qū)擴增。所述巢式PCR擴增，對第一步的擴增產(chǎn)物稀釋50 100倍，取I μ L稀釋液作為第二步擴增的模板。取V3區(qū)擴增產(chǎn)250 350ng，用于DGGE上樣，DGGE膠的濃度為8%的變性聚丙烯酰胺膠，變性梯度范圍34% 52%，設(shè)定電泳條件60°C，150V，390min，電泳緩沖液為1XTAE，電泳結(jié)束后染色25 30min，并立即進行拍照和切膠用于條帶分析。所述變性聚丙烯酰胺膠以7M尿素和40%去離子甲酰胺為變性劑。所述巢式PCR擴增，第一步擴增程序94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸I. 5min，循環(huán)35次，72°C延伸IOmin ;第二步擴增程序94°C預(yù)變性5min，94°〇變性458，601退火 lmin，72°C延伸 30s，循環(huán) 35 次，72°C延伸 IOmin0該方法能有效去除牡蠣蛋白質(zhì)，減少其對菌群總DNA提取效果的影響，還能在分子生物學的基礎(chǔ)上達到對牡蠣鰓部細菌總DNA高效提取、有效擴增、菌群微生態(tài)準確分析。本發(fā)明的顯著優(yōu)點為
(I)本發(fā)明將變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)用于牡蠣鰓部菌群研究，可以避免傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的耗時大，工作繁重，操作繁瑣，同時由于傳統(tǒng)的方法無法對所有的微生物進行分離培養(yǎng)，可能造成原始菌缺失，無法獲取實時和全面的菌群信息，而采用DGGE可以檢測到菌群中相對含量1%以上的菌，并可對微生物譜圖進行分析。(2)提取高蛋白含量樣品的菌群DNA時使用差速離心，使大小不同的蛋白質(zhì)和脂肪及雜質(zhì)等在較長的時間內(nèi)沉淀，防止高速離心造成共沉導致DNA大量損失。提取的DNA質(zhì)量好，無需回收即可用于擴增，提高效率，節(jié)省成本。(3)采用巢式PCR，減少非特異性擴增，樣品可直接用于DGGE分析，采用的變性梯度范圍及設(shè)定的電泳條件，條帶在變性膠上遷移距離不同，有效分開，有利于條帶回收及后續(xù)的分析。


圖I為常溫貯藏牡蠣和氣調(diào)保鮮牡蠣鰓部菌群V3區(qū)擴增結(jié)果。圖2為常溫貯藏牡蠣和氣調(diào)保鮮牡蠣鰓部菌群DGGE圖譜。
具體實施例方式I、樣品DNA的提取
(I)收集菌體取牡蠣鰓部組織2g，剪碎后，加入50mL的生理鹽水中，150rpm/min震蕩20min, 200目絹布過濾,800rpm/min離心IOmin,去沉淀 ,8000rpm離心IOmin,取沉淀重懸浮于ImLTE中，-20°C凍藏，備用。(2)裂解溶菌酶 30yL 10mg/mL 的溶菌酶，37°C 保溫 lh，100yL 10% SDS 和
O.5mg蛋白酶K干粉，55°C保溫lh。(3)抽提氯仿異戍醇(24:1)抽提，2000離心10min,3000rpm離心5min,酹氯仿異戍醇(25:24:1)抽提,5000rpm離心lOmin, 7000rpm離心5min,氯仿:異戍醇(24:1)抽提再次抽提，10000 rpm離心IOmin,取上清液至I. 5mL干凈管中；
(4)沉淀加O. 6倍體積異丙醇,輕輕顛倒混合，靜止IOmin,沉淀DNA。12000rpm離心15min,去上清液,留沉淀。(5)漂洗和風干DNA沉淀加入預(yù)冷70%乙醇漂洗后，12000rpm離心IOmin,置于無菌操作臺中，用垂直風吹干，沉淀溶解于30μ LTE，_20°C保存?zhèn)溆谩?、無需進行純化，取IyL提取的總DNA作為模板，第一步采用細菌通用引物對(8-27f，1492r)進行16SrDNA擴增，參考程序94°C預(yù)變性5min，35個循環(huán)(94°C變性lmin, 55°C退火lmin, 72°C延伸I. 5min), 72°C延伸IOmin ;第二步采用帶40GC夾子的引物對(338f-GC，518r)擴增，對第一步擴增產(chǎn)物進行稀釋100倍，取I μ L稀釋液作為V3區(qū)擴增的模板，參考程序94°C預(yù)變性5min，35個循環(huán)(94°C變性45s，60°C退火lmin，72°C延伸30s)，72°C延伸IOmin ;電泳結(jié)束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳并拍照。3、取V3區(qū)擴增產(chǎn)物15 μ L，擴增產(chǎn)物可以直接用于DGGE實驗，用于DGGE上樣。DGGE膠的濃度為8%的聚丙烯酰胺膠，120ul 10%APS和30ulTEMED加入到30mL的變性丙烯酰胺膠溶液中，待凝膠2h以上，可過夜使用。變性劑梯度范圍34% 52% (以7M的尿素和40%的去離子甲酰胺為100%的變性劑)，采用Bio-Rad公司的Dcode電泳儀進行電泳，設(shè)定電泳條件60°C，150V，390min，電泳緩沖液為1XTAE。電泳結(jié)束后，采用1:5000的Syber-green I溶液染色30min,并立即進行拍照和切膠用于條帶分析；
4、DGGE條帶圖譜分析方法,可進一步采用quantity one及DNAMAN軟件進行菌群分布和聚類分析。5、圖I、圖2中，F(xiàn)為新鮮樣品，Al、A2為新鮮樣品冷藏6d和12d ;B1、B2為CO2:N2 ( (30±2)%: (70 + 2)%)氣調(diào)貯藏 8d 和 16d 樣品菌群；C1，C2 為 CO2 = N2 ( (50±2)%:(50±2)%)氣調(diào)貯藏8d和16d樣品菌群。圖I中V3區(qū)擴增結(jié)果可以看出，條帶單一明亮，無非特異性擴增，說明經(jīng)該方法提取的細菌總DNA可直接用于巢式PCR擴增，獲得較好的擴增樣品。圖2 PCR-DGGE電泳結(jié)果可以看出各條帶分開，條帶清晰明亮，在低溫貯藏過程中DGGE條帶較多，說明微生物具有較高的多樣性，經(jīng)氣調(diào)包裝處理后，條帶具有顯著差異性。條帶經(jīng)切膠，回收，連接轉(zhuǎn)化，測序，比對，結(jié)果見表1，條帶11和13為是未培養(yǎng)菌，氣調(diào)包裝牡蠣鰓部主要是乳酸菌屬。該方法可以鑒定傳統(tǒng)方法無法培養(yǎng)的菌，快速準確分離和鑒定出各個菌種。表I DGGE圖譜分離細菌V3區(qū)序列相似性比較結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種牡蠣鰓部菌群的PCR-DGGE分析方法，其特征在于所述方法包括DNA提取、巢式PCR擴增、變性梯度凝膠電泳DGGEj^ DGGE指紋圖譜進行聚類分析；其中所述DNA提取的步驟如下 (1)取牡蠣鰓部組織I 5g，剪碎后，加入50mL的生理鹽水中，150rpm震蕩20min，200目絹布過濾，取濾液800rpm離心IOmin,去沉淀,清液8000rpm離心IOmin,收集菌體重懸浮于TE中，_20°C保存?zhèn)溆茫? (2)菌體樣品經(jīng)裂解、抽提、異丙醇沉淀和乙醇洗滌，所得DNA沉淀溶解于TE，-20°C保存?zhèn)溆茫? 步驟(2)所述的裂解采用溶菌酶和SDS :首先在菌體樣品中加入20 100 μ L 10mg/mL的溶菌酶，37°C保溫lh，然后依次加入100 μ L 10% SDS和0.3 O. 5mg蛋白酶K干粉，55°C保溫Ih ； 步驟(2)所述的抽提參數(shù)為氯仿異戍醇v/v=24:1抽提,2000 5000rpm離心5 IOmin,上清用酌·:氯仿:異戍醇v/v=25:24:1抽提,3000 8000rpm離心5 IOmin,上清 用氯仿異戊醇v/v=24:l再次抽提，10000 rpm離心5 lOmin，吸取上清，用于異丙醇沉淀。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的牡蠣鰓部菌群的PCR-DGGE分析方法，其特征在于DNA提取的步驟中所提取的DNA無需進一步純化，直接用于巢式PCR擴增。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的牡蠣鰓部菌群的PCR-DGGE分析方法，其特征在于所述巢式PCR擴增，分兩個步驟第一步采用細菌通用引物對27F，1492R進行16SrDNA擴增；第二步采用帶40GC夾子的引物對338F-GC，518R進行V3區(qū)擴增。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的牡蠣鰓部菌群的PCR-DGGE分析方法，其特征在于所述巢式PCR擴增，對第一步的擴增產(chǎn)物稀釋50 100倍，取I μ L稀釋液作為第二步擴增的模板。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的牡蠣鰓部菌群的PCR-DGGE分析方法，其特征在于取V3區(qū)擴增產(chǎn)250 350ng，用于DGGE上樣，DGGE膠的濃度為8%的變性聚丙烯酰胺膠，變性梯度范圍34% 52%，設(shè)定電泳條件60°C，150V，390min，電泳緩沖液為1XTAE，電泳結(jié)束后染色25 30min，并立即進行拍照和切膠用于條帶分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的牡蠣鰓部菌群的PCR-DGGE分析方法，其特征在于所述變性聚丙烯酰胺膠以7M尿素和40%去離子甲酰胺為變性劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的牡蠣鰓部菌群的PCR-DGGE分析方法，其特征在于所述巢式PCR擴增，第一步擴增程序94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸·1.5min，循環(huán)35次，72°C延伸IOmin ;第二步擴增程序94°C預(yù)變性5min，94°C變性45s，60°C退火 lmin，72°C延伸 30s，循環(huán) 35 次，72°C延伸 IOmin0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牡蠣鰓部菌群的PCR-DGGE分析方法。所述方法包括DNA提取、巢式PCR擴增、變性梯度凝膠電泳DGGE、對DGGE指紋圖譜進行聚類分析；其中所述DNA提取的步驟為(1)取牡蠣鰓部組織經(jīng)生理鹽水震蕩、過濾，取濾液離心，去沉淀，清液離心，收集菌體；(2)菌體樣品經(jīng)裂解、抽提、異丙醇沉淀和乙醇洗滌；本發(fā)明是以牡蠣為研究對象，解決傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法應(yīng)用于研究微生物所帶來的不足，該方法可以用于保鮮或者養(yǎng)殖過程中牡蠣鰓部主要菌群的分析，可避免傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的耗時大，工作繁重，操作繁瑣，實現(xiàn)對含高蛋白的牡蠣樣品中菌群總DNA的高效提取、有效擴增以及菌群微生態(tài)準確分析。
文檔編號C12Q1/04GK102747164SQ201210258308
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月25日
發(fā)明者熊君, 王梅英, 陳團偉, 陳慧斌, 陳紹軍 申請人:福建農(nóng)林大學