專利名稱：人工條件下黑尾葉蟬獲得水稻矮縮病毒的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬的領(lǐng)域?yàn)樯锛夹g(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種人工條件下黑尾葉蟬獲得水稻矮縮病毒的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻矮縮病毒(Rice drawf virus，RDV)是一種常見的水稻病毒病之一，屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae),植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)。該病毒病最早于1939年在四川省西昌發(fā)現(xiàn)，六十年代后期在我國開始流行，現(xiàn)今主要流行于日本、朝鮮、東南亞以及我國東南部等水稻產(chǎn)區(qū)。目前該病毒病在我國的一些水稻產(chǎn)區(qū)對水稻生產(chǎn)造成危害。水稻矮縮病毒病除危害水稻外，還危害大麥、小麥等禾本科植物。水稻從苗期至分蘗期易感此病，在這期間感病后，整體癥狀表現(xiàn)為植株矮縮、分蘗增多、葉片濃綠、僵直。生長后期感病水稻不能抽穗結(jié)實(shí)，病葉癥狀則表現(xiàn)分為白點(diǎn)型和扭曲型兩種。白點(diǎn)型癥狀表現(xiàn)為植株矮 縮、分蘗增多、葉色濃綠；葉片或葉鞘上出現(xiàn)與葉脈平行的虛線狀黃白色點(diǎn)條斑，以基部最明顯；病株根系發(fā)育不良；孕穗后期發(fā)病，只在劍葉、葉鞘上出現(xiàn)清晰的點(diǎn)條病斑；抽穗后發(fā)病，僅在劍葉鞘上表現(xiàn)病斑。扭曲型癥狀表現(xiàn)為病株生長緩慢、顯著矮縮、分蘗增多、葉片濃綠，在光照不足情況下，心葉抽出呈扭曲狀，隨心葉伸展，葉片邊緣出現(xiàn)波狀缺刻，色澤淡黃；孕穗期發(fā)病，多在劍葉葉片和葉鞘上出現(xiàn)白色點(diǎn)條，穗頸縮短，形成包頸或半包頸穗。近幾年該病毒病在在福建、浙江、廣西、貴州、河南等稻區(qū)發(fā)生，而在云南尋甸縣、嵩明縣的水稻產(chǎn)區(qū)發(fā)病較普遍，中部的昆明、東北部區(qū)的曲靖和昭通、南部和西南部的景洪和德宏的部分水稻產(chǎn)區(qū)也都有發(fā)生。在自然條件下水稻矮縮病毒通過黑尾葉蝶{Nephotetix cincticeps)和電光葉蝶(.Recilia dorsalIa)傳播，能在昆蟲體內(nèi)復(fù)制，一旦獲毒，即終身帶毒，并可通過蟲卵傳給下一代，若蟲及成蟲均能傳毒，且高效傳毒。黑尾葉蟬在病稻上吸汁最短獲毒時間5分鐘，獲毒后需經(jīng)一段循回期才能傳毒，循回期20°C時為17天，29. 2°C時為12. 4天。葉蟬獲毒15-20天后，體內(nèi)病毒濃度迅速增加，之后以持久性方式傳毒給寄主植物，并且存在明顯的間歇傳毒特性。病毒可在黑尾葉蟬體內(nèi)越冬，黑尾葉蟬在看麥娘上以若蟲形態(tài)越冬，翌春羽化遷回稻田為害，早稻收割后，遷至晚稻上為害，晚稻收獲后，遷至看麥娘、冬稻等38種禾本科植物上越冬，帶毒蟲量是影響該病發(fā)生的主要因子。所以對于黑尾葉蟬及水稻矮縮病毒的早期監(jiān)測和預(yù)警十分必要。以單抗為核心建立的血清學(xué)方法是最經(jīng)濟(jì)、最有效的檢測黑尾葉蟬體內(nèi)及水稻中RDV的高通量的檢測方法，因而篩選合適的抗體尤為重要；此外篩選抗病品種是防治水稻病毒病最經(jīng)濟(jì)、最有效的方法。通過利用水稻病葉飼喂黑尾葉蟬，獲得攜帶RDV的黑尾葉蟬，可用于抗RDV單抗的篩選，用以單抗為核心建立的血清學(xué)方法對該病毒病的發(fā)生流行情況進(jìn)行預(yù)報、預(yù)警；并可接種水稻品系，有助于快速鑒定抗水稻矮縮病毒病的水稻品種，為抗水稻矮縮病毒病的水稻資源的發(fā)掘、抗性品種選育；攜帶RDV的黑尾葉蟬的獲得能為RDV與寄主及其媒介昆蟲之間的互作研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人工條件下黑尾葉蟬獲得水稻矮縮病毒的方法及其應(yīng)用。人工飼喂條件下黑尾葉蟬獲得水稻矮縮病毒的方法，其特征在于包括如下步驟
1)黑尾葉蟬的獲得
從非水稻矮縮病發(fā)生地區(qū)的水稻田間采集捕獲黑尾葉蟬后在室內(nèi)用無毒稻苗飼養(yǎng)，待黑尾葉蟬成蟲交配后單頭蟲單獨(dú)產(chǎn)卵，隨機(jī)抽取群體中10%的黑尾葉蟬用RT-PCR方法檢測帶毒情況，保留不帶毒雌蟲的后代并建立室內(nèi)種群；
2)黑尾葉蟬的獲毒
黑尾葉蟬從冷凍保存的感染RDV水稻或活的感病水稻病株中獲毒
飼毒前，黑尾葉蟬在濾紙保濕的燒杯中饑餓I 3小時；從-10°C至_80°C保存冰箱中取出冷凍保存的病株，移入燒杯內(nèi)，每個燒杯放I 10株病株；接入20 300頭3 4齡無毒的黑尾葉蟬若蟲，燒杯用尼龍紗布封口 ；把燒杯放入溫室或植物生長箱內(nèi)飼養(yǎng)，溫度為26 30°C，相對濕度為60 % 75 %，光周期為16L 8D ;飼毒I 2天后將存活的黑尾葉蟬移入生長于溫室或植物生長箱的健康水稻苗上喂養(yǎng)，溫度為26 30°C，相對濕度為60% 75 %，光周期為16L :8D，直至渡過病毒的循回期，約15 20天；飼毒后的單頭黑尾葉蟬在健康水稻上單獨(dú)產(chǎn)卵，隨機(jī)抽取其后代群體中10%的黑尾葉蟬用RT-PCR方法檢測帶毒情況，保留帶毒雌蟲的后代并建立室內(nèi)帶毒種群，即獲得攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬；或者，黑尾葉蟬從種植于溫室或植物生長箱內(nèi)的水稻病株上獲毒
飼毒前，黑尾葉蟬在濾紙保濕的燒杯中饑餓I 3小時；感染水稻矮縮病毒的水稻病株，用尼龍紗布封口的圓形開口塑料容器封閉在溫濕度控制的植物生長箱中培養(yǎng)，每個塑料容器放I 3株病株植物；每個裝置中放入20 200頭3 4齡無毒的黑尾葉蟬若蟲，飼喂培養(yǎng)溫度為26 30°C，相對濕度為60 % 75 %，光周期為16L 8D ;飼毒I 3天后將存活的黑尾葉蟬移入新鮮健康水稻苗上飼養(yǎng)直至渡過病毒的循回期，約15 20天；飼毒后的單頭黑尾葉蟬在健康水稻上單獨(dú)產(chǎn)卵，隨機(jī)抽取其后代群體中10%的黑尾葉蟬用RT-PCR方法檢測帶毒情況，保留帶毒雌蟲的后代并建立室內(nèi)帶毒種群，即獲得攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬。攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬用于飼喂健康水稻苗來鑒定水稻品種的抗性，用于篩選水稻的抗病品種，并為抗水稻矮縮病毒抗病育種服務(wù)。攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬用于飼喂健康水稻苗來鑒定水稻品種抗性的方法為將攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬移入待鑒定的種植于溫室或植物生長箱的2-5葉期水稻苗，采用單苗10頭蟲方法接種待鑒定水稻品種，飼養(yǎng)3-7天后移出全部黑尾葉蟬，將稻苗移栽至溫室或植物生長箱內(nèi)，培養(yǎng)溫度為26-30°C，相對濕度為65 %-75 %，光周期為16L:8D ;7天以后開始觀察病毒癥狀，連續(xù)調(diào)查20-50天；用RT-PCR和dot-ELISA方法檢測水稻；根據(jù)飼喂接毒水稻的病毒癥狀及其RT-PCR和dot-ELISA檢測結(jié)果判斷水稻的抗性。攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬用于篩選抗水稻矮縮病毒特異、靈敏的單抗，從而建立以單抗為核心的檢測水稻及黑尾葉蟬體內(nèi)水稻矮縮病毒的血清學(xué)方法。攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬用于研究水稻矮縮病毒與水稻寄主及其介體昆蟲之間的互作機(jī)理提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果是1)人工飼喂條件下，可使黑尾葉蟬獲得水稻矮縮病毒，解決了患病植株難以長期保存的問題；2)攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬篩選抗RDV的單抗，從而為建立檢測RDV的血清學(xué)方法打下基礎(chǔ)；3)建立了人工條件下快速鑒定抗水稻矮縮病毒病的水稻品種的方法，為抗水稻矮縮病毒病的水稻資源的發(fā)掘、抗性品種選育；4)攜帶RDV的黑尾葉蟬的獲得能為RDV與寄主及其媒介昆蟲之間的互作研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。


圖I是RT-PCR方法檢測水稻樣品中RDV的結(jié)果；
圖2是Dot-ELISA方法檢測水稻樣品中RDV的結(jié)果；
圖3是冷凍病葉飼喂黑尾葉蟬獲毒的裝置圖；
圖4是Dot-ELISA方法檢測冷凍病葉飼喂的黑尾葉蟬樣品中RDV的結(jié)果；
圖5是新鮮病葉飼喂黑尾葉蟬獲毒的裝置 圖6是RT-PCR方法檢測新鮮病葉飼喂的黑尾葉蟬樣品中RDV的結(jié)果；
圖7是黑尾葉蟬傳毒實(shí)驗(yàn)裝置 圖8 Dot-ELISA方法檢測接種水稻中RDV的結(jié)果；
圖9是獲毒黑尾葉蟬用于篩選水稻抗性裝置圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明利用攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬可篩選抗RDV的單抗用于病毒的檢測以及建立水稻矮縮病毒病的品種抗性的鑒定方法，為抗水稻矮縮病毒病的水稻資源的發(fā)掘、抗性品種選育提供基礎(chǔ)的研究手段，還可為進(jìn)一步研究RDV與寄主及其媒介昆蟲之間的互作研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。人工飼喂條件下黑尾葉蟬獲得水稻矮縮病毒的方法包括如下步驟
1)黑尾葉蟬的獲得
從非水稻矮縮病發(fā)生地區(qū)的水稻田間采集捕獲黑尾葉蟬后在室內(nèi)用無毒稻苗飼養(yǎng)，待黑尾葉蟬成蟲交配后單頭蟲單獨(dú)產(chǎn)卵，隨機(jī)抽取群體中10%的黑尾葉蟬用RT-PCR方法檢測帶毒情況，保留不帶毒雌蟲的后代并建立室內(nèi)種群；
2)黑尾葉蟬的獲毒
黑尾葉蟬從冷凍保存的感染RDV水稻或活的感病水稻病株中獲毒
飼毒前，黑尾葉蟬在濾紙保濕的燒杯中饑餓I 3小時；從-10°C至_80°C保存冰箱中取出冷凍保存的病株，移入燒杯內(nèi)，每個燒杯放I 10株病株；接入20 300頭3 4齡無毒的黑尾葉蟬若蟲，燒杯用尼龍紗布封口 ；把燒杯放入溫室或植物生長箱內(nèi)飼養(yǎng)，溫度為26 30°C，相對濕度為60 % 75 %，光周期為16L 8D ;飼毒I 2天后將存活的黑尾葉蟬移入生長于溫室或植物生長箱的健康水稻苗上喂養(yǎng)，溫度為26 30°C，相對濕度為60% 75 %，光周期為16L :8D，直至渡過病毒的循回期，約15 20天；飼毒后的單頭黑尾葉蟬在健康水稻上單獨(dú)產(chǎn)卵，隨機(jī)抽取其后代群體中10%的黑尾葉蟬用RT-PCR方法檢測帶毒情況，保留帶毒雌蟲的后代并建立室內(nèi)帶毒種群，即獲得攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬；或者，黑尾葉蟬從種植于溫室或植物生長箱內(nèi)的水稻病株上獲毒飼毒前，黑尾葉蟬在濾紙保濕的燒杯中饑餓I 3小時；感染水稻矮縮病毒的水稻病株，用尼龍紗布封口的圓形開口塑料容器封閉在溫濕度控制的植物生長箱中培養(yǎng)，每個塑料容器放I 3株病株植物；每個裝置中放入20 200頭3 4齡無毒的黑尾葉蟬若蟲，飼喂培養(yǎng)溫度為26 30°C，相對濕度為60 % 75 %，光周期為16L 8D ;飼毒I 3天后將存活的黑尾葉蟬移入新鮮健康水稻苗上飼養(yǎng)直至渡過病毒的循回期，約15 20天；飼毒后的單頭黑尾葉蟬在健康水稻上單獨(dú)產(chǎn)卵，隨機(jī)抽取其后代群體中10%的黑尾葉蟬用RT-PCR方法檢測帶毒情況，保留帶毒雌蟲的后代并建立室內(nèi)帶毒種群，即獲得攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬。攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬用于飼喂健康水稻苗來鑒定水稻品種的抗性，用于篩選水稻的抗病品種，并為抗水稻矮縮病毒抗病育種服務(wù)。攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬用于飼喂健康水稻苗來鑒定水稻品種抗性的方法為將攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬移入待鑒定的種植于溫室或植物生長箱的2-5葉期水稻苗，采用單苗10頭蟲方法接種待鑒定水稻品種，飼養(yǎng)3-7天后移出全部黑尾葉蟬，將稻苗移栽至溫室或植物生長箱內(nèi)，培養(yǎng)溫度為26-30°C，相對濕度為65 %-75 %，光周期為16L: 8D ;7天以后開始觀察病毒癥狀，連續(xù)調(diào)查20-50天；用RT-PCR和dot-ELISA方法檢測水稻；根據(jù)飼喂接毒水稻的病毒癥狀及其RT-PCR和dot-ELISA檢測結(jié)果判斷水稻的抗性。攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬用于篩選抗水稻矮縮病毒特異、靈敏的單抗，從而建立以單抗為核心的檢測水稻及黑尾葉蟬體內(nèi)水稻矮縮病毒的血清學(xué)方法。攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬用于研究水稻矮縮病毒與水稻寄主及其介體昆蟲之間的互作機(jī)理提供物質(zhì)基礎(chǔ)。下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。I、感染RDV水稻的獲得
2011年于南尋甸縣水稻矮縮病毒發(fā)生區(qū)采集具有植株矮縮、分蘗增多、葉色濃綠，葉片或葉鞘上出現(xiàn)與葉脈平行的虛線狀黃白色點(diǎn)條斑以及心葉抽出呈扭曲狀，葉片邊緣出現(xiàn)波狀缺刻的水稻病樣。(I) RT-PCR方法檢測水稻是否帶毒
參照Trizol試劑提取水稻病樣的總RNA，根據(jù)GenBank中報道的水稻矮縮病毒的衣殼蛋白基因(CP基因)序列設(shè)計引物RDV-CP-F: TACTTT/CTCCGGGCTCACAACAGG (對應(yīng)CP基因 84-101 位)和 RDV-CP-R CCCCGCAACAGACCGAAACAA (對應(yīng) CP 基因 466-486 位)，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。采用RT-PCR方法檢測確定病樣感染水稻矮縮病毒。反轉(zhuǎn)錄參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司產(chǎn)品)說明書進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系為即cDNA模板 μ ，5XPrimeSTARTM Buffer (含]\%2+)10μ1，dNTP Mix 4μ1, PrimeSTARTM DNA Polymerase(2.5 U/μυθ. 5μ1，上下游引物各 μ ，最后雙蒸無菌水補(bǔ)足反應(yīng)終體積為50μ1。PCR反應(yīng)體系如下預(yù)變性94°C 2 min,變性94°C 45 s,退火57°C 45 s,延伸72°C I min30s，循環(huán)擴(kuò)增35次，最后延伸72°C 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于O. 8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析(圖1)，并用PCR凝膠回收試劑盒(AxyGEN)回收DNA片段，具體操作參考試劑盒說明書進(jìn)行。將純化的PCR產(chǎn)物末端加A與克隆載體pMD-18T vector連接，重組質(zhì)粒命名為pMD18_T_CP，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 5α的感受態(tài)細(xì)胞中，用質(zhì)粒提取試劑盒(AxyGEN)提取重組質(zhì)粒，對提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，并通過測序驗(yàn)證重組克隆載體PMD18-T-CP中所攜帶的CP基因序列及讀碼框的正確性，序列分析軟件為DNAstar、NCBI-BLAST，所用的數(shù)據(jù)庫為GeneBank等。確定水稻樣品所帶病毒為RDV。(2) Dot-ELISA檢測水稻是否帶毒
將水稻葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10 30 (w/v, g /11^)加入0.01 mol/LPBS (pH7. 4)后研磨；病汁液5000 rpm離心3 min;取3 μ I上清點(diǎn)到NC上，同時設(shè)置健康和感病水稻葉汁分別作為陰性和陽性對照；室溫干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含O. 05% Tween-20的O. 01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ； NC膜放入1:5000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min ;用PBST洗膜3 4次，每次3 min ； NC膜放入1:8000倍稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30 60 min; PBST洗膜4 5次，每次3 min; 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物(Promega)加入到10 ml底物緩沖液(O. I mol/L Tris C1,0. I mol/L NaCl、0. 025 mol/L MgCl、ρΗ9· 5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果。待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果，結(jié)果如圖2所示,進(jìn)一步確定水稻感染RDV?！ぁ?、黑尾葉蟬的獲得
從非病毒區(qū)田間采集捕獲的黑尾葉蟬若蟲，在水稻感病品種上進(jìn)行飼養(yǎng)，交配后單頭蟲單獨(dú)產(chǎn)卵，隨機(jī)抽取群體中10%的黑尾葉蟬用RT-PCR和Dot-ELISA方法檢測此蟲帶毒情況，保留不帶毒雌蟲的后代，以后每代隨機(jī)抽取群體中10%的黑尾葉蟬用RT-PCR和Dot-ELISA方法確定其確實(shí)不帶毒，即獲得不帶RDV的黑尾葉蟬，為避免傳毒介體污染，每次飼毒前取100頭黑尾葉蟬進(jìn)行檢測，確定其為無毒蟲。3、黑尾葉蟬從感染RDV的水稻中獲毒 Cl)黑尾葉蟬從冷凍水稻病葉中獲毒
從-20°C (或者_(dá)70°C)取出冷凍病葉，4°C放置2小時后，放置溫室中，3小時后移入燒杯內(nèi)，由于冷凍葉片較干燥，在葉片底部可用浸濕的棉花固定，并加入少量水來避免葉片太干，影響飼毒效果。(燒杯用尼龍紗布封口，既有較好的空氣流動使黑尾葉蟬存活，又可避免黑尾葉蟬逃逸)(圖3)，每個燒杯接入60只2-3齡無毒的黑尾葉蟬，飼毒前使其饑餓3小時。飼毒48小時后將存活的黑尾葉蟬移入健康水稻苗上喂養(yǎng)15-20天左右，渡過病毒的循回期，并記錄存活的黑尾葉蟬數(shù)量。之后將黑尾葉蟬接種感病水稻品種，觀察水稻是否表現(xiàn)出水稻矮縮病的癥狀，并通過免疫學(xué)方法和分子技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。接種后對移出的30只左右黑尾葉蟬進(jìn)行RT-PCR和Dot-ELISA檢測，冷凍葉片飼毒的黑尾葉蟬平均帶毒率為55% (圖
4)。飼毒后的單頭黑尾葉蟬在健康水稻上單獨(dú)產(chǎn)卵，隨機(jī)抽取其后代群體中10%的黑尾葉蟬用RT-PCR方法檢測帶毒情況，保留帶毒雌蟲的后代并建立室內(nèi)帶毒種群，即獲得攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬。(2)黑尾葉蟬從培養(yǎng)的新鮮水稻病植株上獲毒
水稻病植株用尼龍紗布封口的圓形開口塑料容器封閉在溫濕度控制培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(圖
5)，良好的空氣流動確保植株與黑尾葉蟬的存活，又避免黑尾葉蟬的逃逸。同上，每個裝置中放入接入60只2-3齡無毒的黑尾葉蟬，飼毒前使其饑餓3小時。飼毒2-5天后將存活的黑尾葉蟬移入新鮮健康水稻苗上喂養(yǎng)直至渡過病毒的循回期，并記錄存活的黑尾葉蟬數(shù)量。之后將黑尾葉蟬接種感病水稻品種，觀察記錄水稻是否表現(xiàn)出水稻矮縮病的癥狀，并通過免疫學(xué)方法和分子技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。接種后對移出的30只左右黑尾葉蟬進(jìn)行RT-PCR和Dot-ELISA檢測，其帶毒率為75% (圖6)。飼毒后的單頭黑尾葉蟬在健康水稻上單獨(dú)產(chǎn)卵，隨機(jī)抽取其后代群體中10%的黑尾葉蟬用RT-PCR方法檢測帶毒情況，保留帶毒雌蟲的后代并建立室內(nèi)帶毒種群，即獲得攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬。4、獲毒黑尾葉蟬在單抗篩選工作中的應(yīng)用
單頭黑尾葉蝶放入I. 5 mL的eppendorf的離心管中，并加入100 μ L PBS (O. Olmol/L，pH7. 4)，用牙簽搗爛黑尾葉蟬后、5000 rpm離心3 min，取3 μ I上清點(diǎn)到NC上，同時設(shè)置健康和帶毒黑尾葉蟬分別作為陰性和陽性對照；室溫干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含O. 05% Tween-20的O. 01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ； NC膜放入適度稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min ;用PBST洗膜3 4次 ，每次3 min ； NC膜放入適度稀釋的HRP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育3(T60 min; PBST洗膜4 5次，每次3 min; A顯色底物是HRP的顯色底物，S卩如TMB沉淀型顯色底物等。如果有陽性反應(yīng)，則說明抗體可用于病毒的檢測，從而以該單抗為核心建立合適的血清學(xué)方法對田間的水稻和黑尾葉蟬進(jìn)行檢測，對RDV的發(fā)生流行進(jìn)行預(yù)測預(yù)警。5、獲毒黑尾葉蟬的傳毒及在水稻品種抗性鑒定中的應(yīng)用
選擇感病水稻品種進(jìn)行傳毒實(shí)驗(yàn)，將5-10只攜毒黑尾葉蟬單苗接種，于尼龍紗布封口的圓形開口塑料容器中培養(yǎng)(圖7)，苗齡在二葉一心期，傳毒2-3 d后將黑尾葉蟬移出，然后觀察并記錄水稻的發(fā)病情況。調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參照水稻矮縮病的典型癥狀植株矮縮、分蘗增多、葉色濃綠，葉片或葉鞘上出現(xiàn)與葉脈平行的虛線狀黃白色點(diǎn)條斑以及心葉抽出呈扭曲狀，葉片邊緣出現(xiàn)波狀缺刻等。用Dot-ELISA方法檢測接種后的水稻葉片(圖8)，有典型癥狀的水稻均能現(xiàn)出紫色斑點(diǎn)，無發(fā)病癥狀的水稻保持顏色不變，這表明黑尾葉蟬從冷凍病葉和新鮮病葉上獲得水稻矮縮病毒后可以接種至水稻品種上。獲毒黑尾葉蟬可用于水稻品種的抗性鑒定，將渡過循回期的獲毒黑尾葉蟬置于防蟲箱內(nèi)接種水稻(圖9)，接種水稻苗齡為二葉一心期，每苗有帶毒葉蟬1-2頭，讓其傳毒取食5-7 d，每天用竿子在網(wǎng)籠內(nèi)趕蟲2-3次，盡量保證傳毒的相對一致。然后將接種后的稻苗移栽于泥土中，罩上防蟲網(wǎng)，觀察水稻發(fā)病情況并記錄數(shù)據(jù)及統(tǒng)計發(fā)病率，并用RT-PCR和dot-ELISA方法檢測水稻是否感染RDV。按照全國水稻病毒病科研協(xié)作組統(tǒng)一制定的抗性分級標(biāo)準(zhǔn)，以對照品種岫136-12的發(fā)病率為100%，統(tǒng)計各品種的相對發(fā)病率.依據(jù)發(fā)病率劃分抗性等級，共5級。O級免疫(immunity, IM),不發(fā)??；I級高抗(highly resistant, HR),發(fā)病率為 O. 10% -5. 00% ;2 級中抗(moderately resistant,MR)，發(fā)病率為 5. 10 % -30. 00 % ;3 級中感(moderately susceptible, MS)，發(fā)病率為30. 10% -60. 00% ;4 級高感(highly susceptible, HS)，發(fā)病率為 60. 10% 以上。
權(quán)利要求
1.一種人工飼喂條件下黑尾葉蟬獲得水稻矮縮病毒的方法，其特征在于包括如下步驟 1)黑尾葉蟬的獲得 從非水稻矮縮病發(fā)生地區(qū)的水稻田間采集捕獲黑尾葉蟬后在室內(nèi)用無毒稻苗飼養(yǎng)，待黑尾葉蟬成蟲交配后單頭蟲單獨(dú)產(chǎn)卵，隨機(jī)抽取群體中10%的黑尾葉蟬用RT-PCR方法檢測帶毒情況，保留不帶毒雌蟲的后代并建立室內(nèi)種群； 2)黑尾葉蟬的獲毒 黑尾葉蟬從冷凍保存的感染RDV水稻或活的感病水稻病株中獲毒 飼毒前，黑尾葉蟬在濾紙保濕的燒杯中饑餓I 3小時；從-10°C至_80°C保存冰箱中 取出冷凍保存的病株，移入燒杯內(nèi)，每個燒杯放I 10株病株；接入20 300頭3 4齡無毒的黑尾葉蟬若蟲，燒杯用尼龍紗布封口 ；把燒杯放入溫室或植物生長箱內(nèi)飼養(yǎng)，溫度為26 30°C，相對濕度為60 % 75 %，光周期為16L 8D ;飼毒I 2天后將存活的黑尾葉蟬移入生長于溫室或植物生長箱的健康水稻苗上喂養(yǎng)，溫度為26 30°C，相對濕度為60% 75 %，光周期為16L :8D，直至渡過病毒的循回期，約15 20天；飼毒后的單頭黑尾葉蟬在健康水稻上單獨(dú)產(chǎn)卵，隨機(jī)抽取其后代群體中10%的黑尾葉蟬用RT-PCR方法檢測帶毒情況，保留帶毒雌蟲的后代并建立室內(nèi)帶毒種群，即獲得攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬； 或者，黑尾葉蟬從種植于溫室或植物生長箱內(nèi)的水稻病株上獲毒 飼毒前，黑尾葉蟬在濾紙保濕的燒杯中饑餓I 3小時；感染水稻矮縮病毒的水稻病株，用尼龍紗布封口的圓形開口塑料容器封閉在溫濕度控制的植物生長箱中培養(yǎng)，每個塑料容器放I 3株病株植物；每個裝置中放入20 200頭3 4齡無毒的黑尾葉蟬若蟲，飼喂培養(yǎng)溫度為26 30°C，相對濕度為60 % 75 %，光周期為16L 8D ;飼毒I 3天后將存活的黑尾葉蟬移入新鮮健康水稻苗上飼養(yǎng)直至渡過病毒的循回期，約15 20天；飼毒后的單頭黑尾葉蟬在健康水稻上單獨(dú)產(chǎn)卵，隨機(jī)抽取其后代群體中10%的黑尾葉蟬用RT-PCR方法檢測帶毒情況，保留帶毒雌蟲的后代并建立室內(nèi)帶毒種群，即獲得攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬。
2.一種如權(quán)利要求I所述方法獲得的攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬的應(yīng)用，其特征在于所述的攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬用于飼喂健康水稻苗來鑒定水稻品種的抗性，用于篩選水稻的抗病品種，并為抗水稻矮縮病毒抗病育種服務(wù)。
3.如權(quán)利要求2所述的一種攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬的應(yīng)用，其特征在于所述的攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬用于飼喂健康水稻苗來鑒定水稻品種抗性的方法為將攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬移入待鑒定的種植于溫室或植物生長箱的2-5葉期水稻苗，采用單苗10頭蟲方法接種待鑒定水稻品種，飼養(yǎng)3-7天后移出全部黑尾葉蟬，將稻苗移栽至溫室或植物生長箱內(nèi)，培養(yǎng)溫度為26-30°C，相對濕度為65 %-75 %，光周期為16L 8D ；7天以后開始觀察病毒癥狀，連續(xù)調(diào)查20-50天；用RT-PCR和dot-ELISA方法檢測水稻；根據(jù)飼喂接毒水稻的病毒癥狀及其RT-PCR和dot-ELISA檢測結(jié)果判斷水稻的抗性。
4.一種如權(quán)利要求I所述方法獲得的攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬的應(yīng)用，其特征在于所述的攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬用于篩選抗水稻矮縮病毒特異、靈敏的單抗，從而建立以單抗為核心的檢測水稻及黑尾葉蟬體內(nèi)水稻矮縮病毒的血清學(xué)方法。
5.一種如權(quán)利要求I所述方法獲得的攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬的應(yīng)用，其特征在于所述的攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬用于研究水稻矮縮病毒與水稻 寄主及其介體昆蟲之間的互作機(jī)理提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人工飼喂條件下黑尾葉蟬獲得水稻矮縮病毒(Ricedrawfvirus，RDV)的方法及應(yīng)用。用培養(yǎng)的感染水稻矮縮病毒的水稻或者冷凍保存的水稻病葉飼喂黑尾葉蟬，使黑尾葉蟬獲毒，接著將黑尾葉蟬轉(zhuǎn)移至健康水稻上飼喂，直到渡過病毒的循回期，利用RT-PCR技術(shù)和血清學(xué)方法對黑尾葉蟬的帶毒情況進(jìn)行鑒定。利用該發(fā)明獲得的攜帶RDV的黑尾葉蟬可用于篩選抗RDV的單抗，從而以單抗為核心建立dot-ELISA和TAS-ELISA等血清學(xué)方法，進(jìn)而對該病毒病的發(fā)生流行進(jìn)行監(jiān)測；此外，獲毒的黑尾葉蟬可進(jìn)行水稻接種實(shí)驗(yàn)鑒定水稻品種的抗性，從而篩選抗病品種；還可用于研究RDV與寄主、傳毒媒介之間的互作關(guān)系，為闡述該病毒病的致病機(jī)理及提出有效的防治策略打下理論基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/68GK102754623SQ20121025747
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月24日
發(fā)明者倪越群, 吳建祥, 周雪平 申請人:浙江大學(xué)