專(zhuān)利名稱(chēng)：影響奶牛乳腺炎易感/抗性hmgb3基因的核心啟動(dòng)子及其功能性分子標(biāo)記與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性的HMGB3基因啟動(dòng)子區(qū)功能性分子標(biāo)記位點(diǎn)及其 在奶牛遺傳改良中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳腺炎是奶牛飼養(yǎng)中最為常見(jiàn)、復(fù)雜的疾病之一，也是造成奶牛業(yè)損失最大的一種疾病。是乳腺組織受到物理、化學(xué)、微生物等的刺激所發(fā)生的炎性變化，其特點(diǎn)是乳中的體細(xì)胞增多，乳腺組織發(fā)生病理變化，乳的性狀品質(zhì)發(fā)生異常。據(jù)估計(jì)，大約95%的病例是由金黃色葡萄球菌(Staph, aureus)、鏈球菌(Strep, uberis)和大腸桿菌(E. coli)感染引起，每年因乳腺炎造成的損失高達(dá)350億美元(Wellenberg等，2002)。該病所造成的經(jīng)濟(jì)損失包括降低牛奶的產(chǎn)量和乳品的質(zhì)量和風(fēng)味、增加奶牛的淘汰率、炎癥的治療費(fèi)以及額外的勞動(dòng)支出。同時(shí)乳腺炎的病原菌還可通過(guò)牛奶而危害人體健康。有關(guān)奶牛乳腺炎發(fā)病機(jī)理和防治的研究已有100多年的歷史，并取得了顯著的進(jìn)展。然而，奶牛乳腺炎是一種非常復(fù)雜的疾病，盡管許多國(guó)家都已經(jīng)對(duì)各種乳腺炎實(shí)施綜合防治措施，但它是一種受多因素影響的疾病，很難控制。目前，對(duì)乳腺炎的控制與預(yù)防措施并沒(méi)有從整體上降低乳腺炎的發(fā)病率，而且乳腺炎也是奶牛生產(chǎn)中抗生素使用的最主要原因(Villli，2001)。因此，我們迫切需要探討其它途徑來(lái)降低乳腺炎的發(fā)病率，通過(guò)遺傳選擇來(lái)提高奶牛乳腺炎抗性被認(rèn)為是解決乳腺炎問(wèn)題的一種最好的長(zhǎng)期策略(Burton等，2001)。若通過(guò)遺傳育種手段，可使奶牛增強(qiáng)乳腺炎的抗性，減少藥物的使用量，改善牛奶質(zhì)量安全，減少經(jīng)濟(jì)損失，有望從根本上解決乳腺炎這一長(zhǎng)期困擾著世界奶業(yè)發(fā)展的難題。奶?？剐缘倪z傳力很低，基于表型選擇的遺傳改良效果不佳。而奶牛分子育種可以實(shí)現(xiàn)奶牛的早期選擇，大大縮短奶牛遺傳改良的世代間隔，節(jié)約選育成本，提高選擇效率。啟動(dòng)子(promoter)是基因中一段能使基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的脫氧核糖核酸(DNA)序列。它可以被RNA聚合酶辨認(rèn)，并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。在核糖核酸(RNA)合成中，啟動(dòng)子可以和決定轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始的轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)成相互作用，控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度，包含核心啟動(dòng)子區(qū)域和調(diào)控區(qū)域，就像“開(kāi)關(guān)”，決定基因的表達(dá)與否，繼而控制細(xì)胞開(kāi)始生產(chǎn)哪一種蛋白質(zhì)。啟動(dòng)子本身并無(wú)編譯功能，但它擁有對(duì)基因翻譯氨基酸的指揮作用，就像一面旗幟，其核心部分是非編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，指揮聚合酶的合成。因此，該區(qū)域的啟動(dòng)子發(fā)生突變(變異)，將對(duì)基因的表達(dá)有著毀滅性作用。例如，啟動(dòng)子區(qū)中的單核苷酸突變(SNP)可影響基因的表達(dá)調(diào)控、基因功能等，對(duì)個(gè)體的表型具有重要的影響，根據(jù)基因型可以選擇出具有潛在不同的表型的個(gè)體。因此，基于功能性的分子標(biāo)記輔助選擇的分子育種技術(shù)具有很好應(yīng)用潛力。高遷移率族蛋白(High mobility group box, HMGB)是一種非組蛋白染色體蛋白質(zhì)。通常位于細(xì)胞內(nèi)，可參與多種生物學(xué)的過(guò)程，包括維持核小體結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、核糖核酸形成、DNA修復(fù)等。染色體HMGB蛋白包括HMGB1、HMGB2、HMGB3是所有由核酸受體調(diào)控的先天性免疫反應(yīng)的激發(fā)所必不可少的(Yanai H, Ban T, Wang Z, et a I. HMGBproteins function as universal sentinels for nucIeic-acid-mediated innateimmune responses. Nature. 2009Nov 5 ；462 (7269) :99-103)。HMGB 可能充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)核酸的普適性“哨兵”。HMGBU HMGB2、HMGB3是根據(jù)結(jié)合DNA的HMG盒的功能域區(qū)分的。其中，HMGB3據(jù)報(bào)道有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本(ΝΜ_001076285. 2和NM_001113257. 2)。到目前為止，牛HMGB3基因的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)調(diào)控模式以及它在奶牛乳腺炎方面的功能性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3基因的核心啟動(dòng)子及其功能性分子標(biāo)記與應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案改善種群奶牛的抗乳腺炎能力的方法是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR的方法提供一個(gè)奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3候選基因，同時(shí)為了深入研究HMGB3兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)調(diào)控模式，利用在線軟件分析發(fā)現(xiàn)牛HMGB3基因共有3個(gè)啟動(dòng)子區(qū)P1、P2和P3，進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建載體、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、啟動(dòng)子活性測(cè)定和熒光強(qiáng)度測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了牛HMGB3基因3個(gè)啟動(dòng)子的核心區(qū)域，并且在第3個(gè)啟動(dòng)子P3的核心區(qū)域內(nèi) 發(fā)現(xiàn)了一個(gè)SNP，構(gòu)建EGFP-HMGB3-P3載體，經(jīng)293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，發(fā)現(xiàn)該SNP位點(diǎn)可影響啟動(dòng)子P3活性，屬于功能性位點(diǎn)，利用該SNP與奶牛乳中體細(xì)胞評(píng)分SCS的關(guān)聯(lián)分析表明該SNP與奶牛乳腺炎有關(guān)，選擇有利的等位基因型個(gè)體留種，從而改善種群奶牛的抗乳腺炎能力。影響奶牛乳腺炎易感/抗性的HMGB3基因核心啟動(dòng)子區(qū)的鑒定方法是通過(guò)實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄RT-PCR和熒光定量RT-qPCR的方法發(fā)現(xiàn)目的基因HMGB3在正常的和患乳腺炎的奶牛乳腺組織中mRNA存在差異表達(dá)；構(gòu)建不同長(zhǎng)度片段的pGL3-basiC-HMGB3雙熒光素酶報(bào)告基因載體，以及具有野生型和突變型堿基的PEGFP-N1-HMGB3載體，分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，確定牛HMGB3基因的核心啟動(dòng)子區(qū)；通過(guò)對(duì)牛HMGB3基因核心啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行直接測(cè)序分析，在HMGB3基因的第3啟動(dòng)子P3內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個(gè)單核苷酸突變g. +2690C > T，它位于潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上，可影響啟動(dòng)子P3的轉(zhuǎn)錄活性；通過(guò)奶牛群體基因型和乳中體細(xì)胞評(píng)分的關(guān)聯(lián)分析，證明這個(gè)位點(diǎn)為功能性位點(diǎn)，且與奶牛乳腺炎有關(guān)。實(shí)現(xiàn)影響奶牛乳腺炎易感/抗性的HMGB3基因核心啟動(dòng)子區(qū)的鑒定以及利用該鑒定改善種群奶牛的抗乳腺炎能力的方法步驟是a、篩選HMGB3基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性候選基因a. a RT-PCR檢測(cè)HMGB3基因兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本在不同組織中的表達(dá)提取患乳腺炎奶牛的乳腺組織樣品和正常牛的不同組織樣品的mRNA，反轉(zhuǎn)錄后用來(lái)分析HMGB3mRNA的相應(yīng)組織的表達(dá)量， 利用RT-PCR定量的結(jié)果，反映轉(zhuǎn)錄本HMGB3-TV1和HMGB3-TV2的mRNA在各組織中的表達(dá)情況，來(lái)確定HMGB3基因與奶牛乳腺炎的關(guān)系；a. b熒光定量RT-qPCR檢測(cè)HMGB3基因在乳腺組織中的表達(dá)為了進(jìn)一步分析HMGB3的表達(dá)量和奶牛乳腺炎的關(guān)系，分別選擇正常的和患乳腺炎的乳腺組織進(jìn)行RT-qPCR，相對(duì)表達(dá)水平用管家基因β -actin做內(nèi)參，每個(gè)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)，分析熒光定量RT-qPCR的結(jié)果，比較患乳腺炎的組織HMGB3mRNA的表達(dá)量和其在正常奶牛乳腺組織的表達(dá)量；結(jié)果表明，患乳腺炎的組織HMGB3mRNA的表達(dá)顯著高于其在正常奶牛乳腺組織的表達(dá)；b、牛HMGB3基因啟動(dòng)子P1、P2、P3的克隆和活性分析生物信息學(xué)genomatix軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)牛HMGB3基因有3個(gè)啟動(dòng)子，為了進(jìn)一步驗(yàn)證這3個(gè)啟動(dòng)子是否具有啟動(dòng)子活性，而且確定其核心啟動(dòng)子區(qū)，利用序列遞減的方法對(duì)Pl和P2啟動(dòng)子區(qū)不同片段構(gòu)建入pGL3-basic載體并且轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因分析其不同片段的啟動(dòng)子活性，根據(jù)NCBI的牛HMGB3基因參考序列，構(gòu)建pGL3-l、pGL3-2、pGL3-3、pGL3-4 和 pGL3_5 載體驗(yàn)證分析 HMGB3-P1 啟動(dòng)子，構(gòu)建 pGL3_C_l和pGL3-C-2載體分析P2啟動(dòng)子，最終實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)HMGB3基因的Pl啟動(dòng)子核心區(qū)位于g. -655-g. -114，牛HMGB3基因的P2啟動(dòng)子核心區(qū)位于g. -116-g. +301區(qū)域；c、HMGB3基因P3啟動(dòng)子區(qū)功能性SNP位點(diǎn)的鑒別設(shè)計(jì)引物HMGB3F SEQ ID NO. 3 和 HMGB3R SEQ ID NO. 4 擴(kuò)增 HMGB3 啟動(dòng)子 P3 區(qū)，·通過(guò)對(duì)DNA直接測(cè)序的方法，使用DNAStar軟件包中的SeqMan軟件分析測(cè)序結(jié)果，在Pl和P2啟動(dòng)子區(qū)未發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)，但是在P3啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 I個(gè)SNP位點(diǎn)，即在擴(kuò)增片段的第454位發(fā)生堿基C > T突變，根據(jù)國(guó)際通用的SNP命名和編碼規(guī)則，該SNP突變命名為g. +2690C > T，由于這個(gè)突變的引入消除了限制性?xún)?nèi)切核酸酶Sac II的結(jié)合位點(diǎn)，因此，Sac II限制性?xún)?nèi)切酶可將具有不同突變的PCR產(chǎn)物切成長(zhǎng)度不同的片段，經(jīng)2%的凝膠電泳后，TT基因型可分離出兩個(gè)條帶538bp和388bp，CT基因型可分離出四個(gè)條帶538bp、388bp、347bp和191bp，CC基因型可分離出三個(gè)條帶388bp、347bp和191bp ；基因組結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子P3位于牛HMGB3基因的第三內(nèi)含子中，與HMGB3轉(zhuǎn)錄本2相差7個(gè)堿基，結(jié)合牛HMGB3基因轉(zhuǎn)錄本2的基因表達(dá)結(jié)果，表明，啟動(dòng)子P3負(fù)責(zé)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄本2的轉(zhuǎn)錄，為了進(jìn)一步研究該SNP (g. +2690C > T)對(duì)P3啟動(dòng)子的活性是否有影響，將序列包含C和T等位基因的g. +2253 g. +3035兩個(gè)啟動(dòng)子片段分別構(gòu)建入pEGFP-Nl載體,命名為pEGFP-Nl-P3-WT和pEGFP-Nl_P3_MT，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24和48小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察其熒光強(qiáng)度，分析發(fā)現(xiàn)含有T等位基因的啟動(dòng)子片段活性高于含有C等位基因的片段活性，表明T等位基因片段具有更高的啟動(dòng)子活性，可促進(jìn)HMGB3基因的轉(zhuǎn)錄，為進(jìn)一步分析啟動(dòng)子P3的g. +2690C > T突變是否影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，用軟，分析P3序列突變前后，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C突變?yōu)門(mén)后，刪除了 I個(gè)轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致了 HMGB3基因啟動(dòng)子P3具有更強(qiáng)的啟動(dòng)子活性；選擇HMGB3基因序列上P3啟動(dòng)子鑒別到的SNP位點(diǎn)在302頭中國(guó)荷斯坦奶牛個(gè)體中，對(duì)SNP進(jìn)行酶切基因分型，采用SAS8. I軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)TT基因型個(gè)體的SCS顯著低于具有CC和CT基因型個(gè)體的SCS，表明HMGB3基因g. 2690位點(diǎn)的TT基因型是乳腺炎抗性的有利基因型，可以在奶牛育種改良過(guò)程中作為候選基因的功能性分子標(biāo)記，用于輔助選擇具有更高乳腺炎抗性的個(gè)體，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選育乳腺炎抗性個(gè)體，從而培育出抗乳腺炎的優(yōu)良種牛新品系。牛HMBG3基因啟動(dòng)子，其特征在于牛HMBG3基因啟動(dòng)子I的核心序列為SEQIDNO. I ;牛HMBG3基因啟動(dòng)子2的核心序列為SEQ ID NO. 2。一對(duì)擴(kuò)增牛HMGB3啟動(dòng)子3的引物序列，其上游引物HMGB3F序列為SEQID NO. 3，下游引物HMGB3R序列為SEQ ID NO. 4，其PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物大小為798bp，序列如SEQ IDNO. 5。一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3基因的核苷酸序列及其可影響啟動(dòng)子活性的功能性單核苷酸位點(diǎn)SNP (g. +2690C > T)，其序列如SEQ ID NO. 5，并且擴(kuò)增片段的第454bp處的單核苷酸位點(diǎn)為C或T。上述方法在牲畜疾病抗性育種中的應(yīng)用。利用牛HMGB3基因P3啟動(dòng)子區(qū)的I個(gè)功能性SNP位點(diǎn)的信息，并且采用分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)鑒別奶牛在這個(gè)位點(diǎn)的基因型，選擇具有乳腺炎抗性的基因型個(gè)體在牛抗乳腺炎遺傳改良中的應(yīng)用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比所產(chǎn)生的有益效果是本發(fā)明利用牛HMGB3基因P3啟動(dòng)子區(qū)的I個(gè)功能性SNP位點(diǎn)的信息，并且采用分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)鑒別奶牛在這個(gè)位點(diǎn)的基因型，實(shí)現(xiàn)對(duì)具有乳腺炎抗性的基因型個(gè)體的 早期選擇。本發(fā)明鑒別了 I個(gè)功能性的SNP位點(diǎn)，通過(guò)分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)檢測(cè)個(gè)體奶牛HMGB3基因此位點(diǎn)的基因型，并且通過(guò)和奶牛乳中體細(xì)胞評(píng)分的關(guān)聯(lián)分析，選擇有利的基因型個(gè)體留種，可以提高HMGB3基因抗性基因型在奶牛群體中的頻率，從而提高群體抗奶牛乳腺炎的能力，降低奶?；既橄傺椎陌l(fā)病率，減少經(jīng)濟(jì)損失。本發(fā)明為奶牛的乳腺炎抗性遺傳改良提供了一種新的方法。


圖I :牛HMGB3基因在不同組織中的差異表達(dá)。A. HMGB3-TV1和HMGB3-TV2在不同組織中的表達(dá)牛HMGB3基因在正常和患乳腺炎奶牛的乳腺組織中的表達(dá)。圖2 :牛HMGB3基因不同轉(zhuǎn)錄本和啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)。圖2中5’ -UTR表示5端非翻譯區(qū)，3’-UTR表示3’-端非翻譯區(qū)?；疑目虮硎就怙@子，虛線表示內(nèi)含子。Pl (1535-2092)表示啟動(dòng)子Pl在牛HMGB3基因序列的第1535-2092位堿基，P2 (2074-2491)表示啟動(dòng)子2位于牛HMGB3基因序列的第2074-2491位堿基，P3 (4428-5225)表示啟動(dòng)子3位于牛HMGB3基因序列的第4428-5225位堿基。ATG翻譯起始位點(diǎn)的A為+1。El E7 :外顯子I 外顯子 7 ；E4 = e2, E5 = e2, E6 = e3, E7 = e5。圖3 :牛HMGB3基因Pl和P2啟動(dòng)子區(qū)不同片段熒光活性測(cè)定結(jié)果。圖4 :牛HMGB3基因g. +2690C > T位點(diǎn)攜帶牛的基因測(cè)序圖。圖5 :牛HMGB3基因g. +2690C > T位點(diǎn)Sac II限制性酶切分型。圖5中M =Marker 2000bp;TT 基因型(538bp + 388bp)，CT 基因型(538bp+388bp+347bp+191bp)，CC 基因型(388bp+347bp+191bp)。圖6 :牛HMGB3基因g. +2690C > T位點(diǎn)突變前后，P3啟動(dòng)子構(gòu)建載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的熒光強(qiáng)度圖。圖6中圖片在倒置熒光顯微鏡(型號(hào)01ympus 1X70)上放大100倍拍攝。WT :表示構(gòu)建的pEGFP-Nl-啟動(dòng)子P3片段的g. +2690位是C堿基；MT :表示構(gòu)建的pEGFP-Nl-啟動(dòng)子P3片段的g. +2690位是突變后的T堿基。圖7 :牛HMGB3基因啟動(dòng)子P3的g. +2690位點(diǎn)突變前后其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的變化。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的影響奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3基因的核心啟動(dòng)子及其功能性分子標(biāo)記與應(yīng)用作以下詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的影響奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3基因的核心啟動(dòng)子及其功能性分子標(biāo)記與應(yīng)用，其具體方案是I、篩選HMGB3基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性 候選基因I. IRT-PCR檢測(cè)HMGB3基因兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本在不同組織中的表達(dá)提取患乳腺炎奶牛的乳腺組織樣品和正常牛的不同組織樣品的mRNA，反轉(zhuǎn)錄后用來(lái)分析HMGB3mRNA的相應(yīng)組織的表達(dá)量。PCR擴(kuò)增反應(yīng)25 μ I PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為模板cDNA(100ng/μ I) I μ 1，引物(TV1-F, TVl-R ；TV2-F, TV2-R,見(jiàn)表 I)各(10 μ mol/L)O. 5 μ I,2XTaqPCR MasterMix
12.5μ 1(北京諾維森生物公司)，雙蒸水(ddH20)補(bǔ)至25 μ I。擴(kuò)增反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min ;然后94°C變性30s，59 V (轉(zhuǎn)錄本HMGB3-TV1)或56°C (轉(zhuǎn)錄本HMGB3-TV2)退火30s，72。。延伸 30s，共 35 個(gè)循環(huán)；72°C保持 IOmin。RT-PCR定量的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄本HMGB3-TV1和HMGB3-TV2的mRNA在各組織中的表達(dá)情況如圖I所示。轉(zhuǎn)錄本HMGB3-TV1在正常和患乳腺炎的奶牛乳腺組織中的表達(dá)顯著高于其它組織。轉(zhuǎn)錄本HMGB3-TV2在患乳腺炎的奶牛乳腺組織顯著高于其在正常奶牛乳腺組織中的表達(dá)。上述結(jié)果提示，HMGB3基因與奶牛乳腺炎密切相關(guān)。表IRT-PCR 和 RT-qPCR 所需引物
權(quán)利要求
1.一種改善種群奶牛的抗乳腺炎能力的方法，其特征在于通過(guò)反轉(zhuǎn)錄RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR的方法提供一個(gè)奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3候選基因，同時(shí)為了深入研究HMGB3兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)調(diào)控模式，利用在線軟件分析發(fā)現(xiàn)牛HMGB3基因共有3個(gè)啟動(dòng)子區(qū)P1、P2和P3，進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建載體、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、啟動(dòng)子活性測(cè)定和熒光強(qiáng)度測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了牛HMGB3基因3個(gè)啟動(dòng)子的核心區(qū)域，并且在第3個(gè)啟動(dòng)子P3的核心區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)SNP，構(gòu)建EGFP-HMGB3-P3載體，經(jīng)293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，發(fā)現(xiàn)該SNP位點(diǎn)可影響啟動(dòng)子P3活性，屬于功能性位點(diǎn)，利用該SNP與奶牛乳中體細(xì)胞評(píng)分SCS的關(guān)聯(lián)分析表明該SNP與奶牛乳腺炎有關(guān)，選擇有利的等位基因型個(gè)體留種，從而改善種群奶牛的抗乳腺炎能力。
2.一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性的HMGB3基因核心啟動(dòng)子區(qū)的鑒定方法，其特征在于通過(guò)實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄RT-PCR和熒光定量RT-qPCR的方法發(fā)現(xiàn)目的基因HMGB3在正常的和患乳腺炎的奶牛乳腺組織中mRNA存在差異表達(dá)；構(gòu)建不同長(zhǎng)度片段的pGL3-basiC-HMGB3雙熒光素酶報(bào)告基因載體，以及具有野生型和突變型堿基的PEGFP-N1-HMGB3載體，分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，確定牛HMGB3基因的核心啟動(dòng)子區(qū)；通過(guò)對(duì)牛HMGB3基因核心啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行直接測(cè)序分析，在HMGB3基因的第3啟動(dòng)子P3內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個(gè)單核苷酸突變g. +2690C > T，它位于潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上，可影響啟動(dòng)子P3的轉(zhuǎn)錄活性；通過(guò)奶牛群體基因型和乳中體細(xì)胞評(píng)分的關(guān)聯(lián)分析，證明這個(gè)位點(diǎn)為功能性位點(diǎn)，且與奶牛乳腺炎相關(guān)。
3.一種實(shí)現(xiàn)影響奶牛乳腺炎易感/抗性的HMGB3基因核心啟動(dòng)子區(qū)的鑒定以及利用該鑒定改善種群奶牛的抗乳腺炎能力的方法，其特征在于該方法的步驟是 a、篩選HMGB3基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性候選基因 a.a RT-PCR檢測(cè)HMGB3基因兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本在不同組織中的表達(dá) 提取患乳腺炎奶牛的乳腺組織樣品和正常牛的不同組織樣品的mRNA，反轉(zhuǎn)錄后用來(lái)分析HMGB3mRNA的相應(yīng)組織的表達(dá)量， 利用RT-PCR定量的結(jié)果，反映轉(zhuǎn)錄本HMGB3-TV1和HMGB3-TV2的mRNA在各組織中的表達(dá)情況，來(lái)確定HMGB3基因與奶牛乳腺炎的關(guān)系； a、b熒光定量RT-qPCR檢測(cè)HMGB3基因在乳腺組織中的表達(dá) 為了進(jìn)一步分析HMGB3的表達(dá)量和奶牛乳腺炎的關(guān)系，分別選擇正常的和患乳腺炎的乳腺組織進(jìn)行RT-qPCR，相對(duì)表達(dá)水平用管家基因β -actin做內(nèi)參，每個(gè)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)， 分析熒光定量RT-qPCR的結(jié)果，比較患乳腺炎的組織HMGB3mRNA的表達(dá)量和其在正常奶牛乳腺組織的表達(dá)量；結(jié)果表明，患乳腺炎的組織HMGB3mRNA的表達(dá)顯著高于其在正常奶牛乳腺組織的表達(dá)； b、牛HMGB3基因啟動(dòng)子P1、P2、P3的克隆和活性分析 生物信息學(xué)genomatix軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)牛HMGB3基因有3個(gè)啟動(dòng)子，為了進(jìn)一步驗(yàn)證這3個(gè)啟動(dòng)子是否具有啟動(dòng)子活性，而且確定其核心啟動(dòng)子區(qū)，利用序列遞減的方法對(duì)Pl和P2啟動(dòng)子區(qū)不同片段構(gòu)建入pGL3-basic載體并且轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因分析其不同片段的啟動(dòng)子活性，根據(jù)NCBI的牛HMGB3基因參考序列，構(gòu)建pGL3-l、pGL3_2、pGL3-3、pGL3-4 和 pGL3_5 載體驗(yàn)證分析 HMGB3-P1 啟動(dòng)子，構(gòu)建 pGL3_C_l 和 pGL3_C_2 載體分析P2啟動(dòng)子，最終實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)HMGB3基因的Pl啟動(dòng)子核心區(qū)位于g. -655-g. -114，牛HMGB3基因的P2啟動(dòng)子核心區(qū)位于g. -116-g. +301區(qū)域； c、HMGB3基因P3啟動(dòng)子區(qū)功能性SNP位點(diǎn)的鑒別設(shè)計(jì)引物 HMGB3F :SEQ ID NO. 3 和 HMGB3R :SEQ ID NO. 4 擴(kuò)增 HMGB3 啟動(dòng)子 P3 區(qū)，通過(guò)對(duì)DNA直接測(cè)序的方法，使用DNAStar軟件包中的SeqMan軟件分析測(cè)序結(jié)果，在Pl和P2啟動(dòng)子區(qū)未發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)，但是在P3啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 I個(gè)SNP位點(diǎn)，即在擴(kuò)增片段的第454位發(fā)生堿基C > T突變，根據(jù)國(guó)際通用的SNP命名和編碼規(guī)則，該SNP突變命名為g. +2690C>T，由于這個(gè)突變的引入消除了限制性?xún)?nèi)切核酸酶Sac II的結(jié)合位點(diǎn)，因此，Sac II限制性?xún)?nèi)切酶可將具有不同突變的PCR產(chǎn)物切成長(zhǎng)度不同的片段，經(jīng)2%的凝膠電泳后，TT基因型可分離出兩個(gè)條帶538bp和388bp，CT基因型可分離出四個(gè)條帶538bp、388bp、347bp和191bp，CC基因型可分離出三個(gè)條帶388bp、347bp和191bp ； 基因組結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子P3位于牛HMGB3基因的第三內(nèi)含子中，與HMGB3轉(zhuǎn)錄本2相差7個(gè)堿基，結(jié)合牛HMGB3基因轉(zhuǎn)錄本2的基因表達(dá)結(jié)果，表明，啟動(dòng)子P3負(fù)責(zé)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄本2的轉(zhuǎn)錄，為了進(jìn)一步研究該SNP(g. +2690C > T)對(duì)P3啟動(dòng)子的活性是否有影響，將序列包含C和T等位基因的g. +2253 g. +3035兩個(gè)啟動(dòng)子片段分別構(gòu)建入pEGFP-Nl載體,命名為pEGFP-Nl-P3-WT和pEGFP-Nl_P3_MT，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24和48小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察其熒光強(qiáng)度，分析發(fā)現(xiàn)含有T等位基因的啟動(dòng)子片段活性高于含有C等位基因的片段活性，表明T等位基因片段具有更高的啟動(dòng)子活性，可促進(jìn)HMGB3基因的轉(zhuǎn)錄，為進(jìn)一步分析啟動(dòng)子P3的g. +2690C > T突變是否影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，用軟件分析P3序列突變前后，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C突變?yōu)門(mén)后，刪除了 I個(gè)轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致了 HMGB3基因啟動(dòng)子P3具有更強(qiáng)的啟動(dòng)子活性； 選擇HMGB3基因序列上P3啟動(dòng)子鑒別到的SNP位點(diǎn)在302頭中國(guó)荷斯坦奶牛個(gè)體中，對(duì)SNP進(jìn)行酶切基因分型，采用SAS8. I軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)TT基因型個(gè)體的SCS顯著低于具有CC和CT基因型個(gè)體的SCS，表明HMGB3基因g. 2690位點(diǎn)的TT基因型是乳腺炎抗性的有利基因型，可以在奶牛育種改良過(guò)程中作為候選基因的功能性分子標(biāo)記，用于輔助選擇具有更高乳腺炎抗性的個(gè)體，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選育乳腺炎抗性個(gè)體，從而培育出抗乳腺炎的優(yōu)良種牛新品系。
4.牛HMBG3基因啟動(dòng)子，其特征在于牛HMBG3基因啟動(dòng)子I的核心序列為SEQIDNO. I ;牛HMBG3基因啟動(dòng)子2的核心序列為SEQ ID NO. 2。
5.一對(duì)擴(kuò)增牛HMGB3啟動(dòng)子3的引物序列，其特征在于上游引物HMGB3F序列為SEQID NO. 3，下游引物HMGB3R序列為SEQ ID NO. 4，其PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物大小為798bp，序列如SEQ ID NO. 5。
6.一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3基因的核苷酸序列及其可影響啟動(dòng)子活性的功能性單核苷酸位點(diǎn)SNP (g. +2690C > T)，其序列如SEQ ID NO. 5，并且擴(kuò)增片段的第454bp處的單核苷酸位點(diǎn)為C或T。
7.權(quán)利要求中1、2、3任意一項(xiàng)所述的方法在牲畜疾病抗性育種中的應(yīng)用。
8.利用牛HMGB3基因P3啟動(dòng)子區(qū)的I個(gè)功能性SNP位點(diǎn)的信息，并且采用分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)鑒別奶牛在這個(gè)位點(diǎn)的基因型，選擇具有乳腺炎抗性的基因型個(gè)體在?？谷橄傺走z傳改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3基因的核心啟動(dòng)子及其功能性分子標(biāo)記與應(yīng)用，屬于生物化學(xué)遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR的方法提供一個(gè)奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3候選基因，利用牛HMGB3基因P3啟動(dòng)子區(qū)的1個(gè)功能性SNP位點(diǎn)的信息，并且采用分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)鑒別奶牛在這個(gè)位點(diǎn)的基因型，選擇具有乳腺炎抗性的基因型個(gè)體。選擇有利的基因型個(gè)體留種，可以提高HMGB3基因抗性基因型在奶牛群體中的頻率，從而提高群體抗奶牛乳腺炎的能力，降低奶牛乳腺炎的發(fā)病率，減少經(jīng)濟(jì)損失。本發(fā)明為奶牛的乳腺炎抗性遺傳改良提供了一種新的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102899396SQ20121025769
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月25日
發(fā)明者黃金明, 王秀革, 李黎明, 鞠志花, 齊超, 張燕, 李秋玲, 王長(zhǎng)法, 李榮嶺, 杭蘇琴, 侯明海, 高運(yùn)東, 仲躋峰 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心