本發(fā)明涉及微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種源于多氯聯(lián)苯降解菌的雙加氧酶基因；還涉及了該基因在多氯聯(lián)苯和聯(lián)苯類物質(zhì)降解中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls，PCBs)是被聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署(UNEP)首批列入斯德哥爾摩公約受控名單的12種持久性有機(jī)污染物(Persistent Organic Pollutants，POPs)之一。多氯聯(lián)苯與常規(guī)污染物不同，它在自然界中極難降解，并在全球范圍內(nèi)長距離遷移，被生物體吸收后不易分解，并沿食物鏈放大，不僅具有致癌、致畸、致突變性，而且還干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)，對人體健康危害巨大(李國剛，2004)。據(jù)WHO統(tǒng)計，全世界共生產(chǎn)了2×106t工業(yè)PCBs。我國1965-1974年共生產(chǎn)10000t工業(yè)PCBs，其中PCB3 9000t，PCB51000t(劉靜，2006)。1968年在日本以及1979年在臺灣都曾發(fā)生過因食用受多氯聯(lián)苯污染的食物而導(dǎo)致上千人中毒的事件(“米糠油”事件)(石碧清，2005)。2005年，我國正式啟動實施了全球第一個POPs履約示范項目——“中國多氯聯(lián)苯管理與處置示范項目”。雖然在政府和職能部門的大力推進(jìn)下，PCBs的清理處置工作取得了很大的進(jìn)展，但由于污染范圍廣、污染時間長，今后的工作仍然任重道遠(yuǎn)，尤其在處置技術(shù)方面還缺乏經(jīng)濟(jì)有效的方法，比如土壤生物修復(fù)技術(shù)由于缺少高效PCBs降解菌等而無法實施，必須考慮構(gòu)建基因工程菌以提高降解效率，而構(gòu)建基因工程菌的前提是獲得盡可能多的降解酶基因資源并探明其功能。因此開展這方面的理論和應(yīng)用技術(shù)研究，不僅具有重要的學(xué)術(shù)價值，更具有重大的現(xiàn)實意義。

研究表明，絕大多數(shù)PCBs降解菌能以聯(lián)苯為共代謝機(jī)質(zhì)降解更多氯原子的PCBs，并將此途徑稱為bph途徑。bph基因是PCBs降解途徑上游的功能基因，在許多革蘭氏陰性菌中都顯示了聯(lián)苯代謝基因的保守性(Abramowicz D A.，1995)，降解PCB的前三步酶的編碼基因:bphA(聯(lián)苯雙加氧酶)、bphB(聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶)、bphC(2，3-二羥基聯(lián)苯雙加氧酶)呈bphABC的排列方式，而革蘭氏陽性菌Rhodococcus sp.RHA1呈bphACB的排列方式(Sakai M.，2003)。Furukawa和Miyazaki于1986年首先克隆得到一段來自假單胞細(xì)菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)KF707的基因簇，他們發(fā)現(xiàn)這些基因簇翻譯表達(dá)聯(lián)苯降解途徑中3個連續(xù)的相關(guān)酶(Furukawa K.，1986)。接著，Mondello從Burkholderia xenovorans LB400(Pseudomonas sp.LB400)細(xì)菌中克隆得到整個聯(lián)苯代謝途徑所涉及到的基因(Mondello F.J.，1989)。其他實驗室也從各類革蘭氏陰性(Taira K.，1988；Yates J.R.，1989；Kimbara K.，1989；Hayase N.，1990；Ahmad D.，1990；Erickson B.D.，1992；Hofer B.，1993；Fukuda M.，1994；Hofer B.，1994；Kikuchi Y.，1994；Sylvestre M.，1996)或革蘭氏陽性(Maed M.，1995；Kosono S.，1997；Asturias J.A.，1993；Peloquin L.，1993；Masai E.，1995；Wang Y.，1995；Hauschild J.E.，1996；Sakai M.，2003)細(xì)菌菌株中分離得到了能夠進(jìn)行PCB降解的基因。

國內(nèi)外研究的多氯聯(lián)苯降解酶，主要是指bph途徑中涉及的酶。如聯(lián)苯雙加氧酶，2，3-二羥基聯(lián)苯-1，2-雙加氧酶或鐵氧化還原蛋白酶(Sylvestre M.，2009)。Haddock等人分離純化得到了來自LB400菌株的多元酶體系(Haddock J.D.，1995；Haddock J.D.，1995；Broadus R.M.，1998)。通過X射線晶體衍射，人們也對聯(lián)苯雙加氧酶組件的三維立體結(jié)構(gòu)(Imbeault N.Y.，2000；Nagarajan V.，2003；Colbert C.L.，2000；Senda T.，2000)，2，3-二羥基聯(lián)苯雙加氧酶(Han S.,1995；Senda T.,1996；Sugiyama K.,1995；Uragami Y.,2001)以及其他參與聯(lián)苯代謝途徑的酶展開了研究。

近年來，人們通過基因工程和生化工程已經(jīng)對PCBs的好氧降解途徑，酶催化作用的特異性底物和關(guān)鍵酶以及不同異化代謝途徑等方面有了較詳盡的研究。盡管人們通過優(yōu)化關(guān)鍵酶或重組代謝途徑等方式來優(yōu)化PCB降解效率，但顯然還沒有一個真正高效的技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供了一種源于多氯聯(lián)苯降解菌的雙加氧酶基因，還公開了該基因在多氯聯(lián)苯和聯(lián)苯類物質(zhì)降解中的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決：

源于多氯聯(lián)苯降解菌的雙加氧酶基因，其堿基序列如SEQ ID No 1所示。本發(fā)明中的雙加氧酶基因和蛋白可用于制備降解多氯聯(lián)苯和其它聯(lián)苯類物質(zhì)的基因工程菌，有望應(yīng)用于多氯聯(lián)苯污染土壤的修復(fù)，在環(huán)境污染治理和保護(hù)人們身體健康方面發(fā)揮作用。

作為優(yōu)選，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。

作為優(yōu)選，還包括雙加氧酶基因，雙加氧酶基因為bphC2基因。

作為優(yōu)選，bphC2基因編碼閱讀框包括903bp堿基，編碼成含有300個氨基酸的蛋白質(zhì)。

以上提到的源于多氯聯(lián)苯降解菌的雙加氧酶基因在多氯聯(lián)苯和聯(lián)苯類物質(zhì)降解中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，用于基因工程菌的構(gòu)建。

作為優(yōu)選，用于雙加氧酶的制備及利用。

作為優(yōu)選，作為材料用于環(huán)境監(jiān)測。

以上提到的源于多氯聯(lián)苯降解菌的雙加氧酶基因的制備方法，包括以下步驟：

(1)多氯聯(lián)苯降解菌WB1染色體總DNA的提?。?/p>

多氯聯(lián)苯降解菌WB1提前兩天劃平板活化，挑取單菌落接種于5ml的試管，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜，10％的接種量轉(zhuǎn)接至50ml LB液體培養(yǎng)基搖至穩(wěn)定期(>10⁸cfu/ml)，12000rpm離心5分鐘，TEN洗滌菌體，離心收集菌體，懸浮于10ml的TEN中，加入50μL的蛋白酶K(20mg/ml)，再加入1ml的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的SDS，在50℃的溫水浴保溫3小時，加入1/3體積的飽和NaCl溶液劇烈振蕩15秒，12000rpm離心5min，上清液用體積比為1:1的酚：氯仿溶液抽提兩次，12000rpm離心5min收集上清液，加入0.6體積的異丙醇沉淀，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70％的乙醇洗滌，吹干，溶于TER中，備用。

2)基因組文庫的構(gòu)建

將多氯聯(lián)苯降解菌WB1總DNA用Sau3AI酶切，回收2～4kb的酶切片段，與用限制性內(nèi)切酶BamHI徹底酶切并進(jìn)行脫磷處理的pUC18質(zhì)粒以大約摩爾比2：1的混合，16℃連接反應(yīng)12小時以上。酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α高效感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB/AMP平板，構(gòu)建了WB1菌株基因組文庫。

3)篩選降解多氯聯(lián)苯的轉(zhuǎn)化子

挑取上述平板上的轉(zhuǎn)化子菌落，接入加有2,3-二羥基聯(lián)苯(DHBP)的酶標(biāo)板中，37℃，15min，挑選有黃色產(chǎn)物(HOPD)生成的陽性克隆。

4)序列測定

將上述陽性克隆轉(zhuǎn)化子接種LB/AMP液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行序列測定。

5)序列分析

通過對核苷酸序列進(jìn)行分析，獲得編碼多氯聯(lián)苯降解菌的雙加氧酶基因的序列，它具有以下的堿基和氨基酸序列信息。

核酸序列如下，SEQ ID No 1：

氨基酸序列如下，SEQ ID No 2：

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明從多氯聯(lián)苯降解菌中克隆了雙加氧酶基因bphC2，并進(jìn)一步分析該基因及其編碼蛋白在多氯聯(lián)苯及其他聯(lián)苯類物質(zhì)降解中的應(yīng)用。本發(fā)明中的雙加氧酶基因和蛋白可用于制備降解多氯聯(lián)苯和其它聯(lián)苯類物質(zhì)的基因工程菌，有望應(yīng)用于多氯聯(lián)苯污染土壤的修復(fù)，在環(huán)境污染治理和保護(hù)人們身體健康方面發(fā)揮作用。

附圖說明

圖1多氯聯(lián)苯降解菌WB1總DNA的Sau3AI酶切片段；M為λ-HindⅢdigest DNA Marker，1、2為2-4kb片段，3、4為4-10kb片段。

圖2多氯聯(lián)苯降解酶陽性轉(zhuǎn)化子降解2,3-二羥基聯(lián)苯(DHBP)的紫外掃描圖譜；2,3-二羥基聯(lián)苯濃度為50mg/L，CK為2,3-二羥基聯(lián)苯空白對照，處理為陽性轉(zhuǎn)化子。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖與實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實施例1

源于多氯聯(lián)苯降解菌的雙加氧酶基因，其堿基序列如SEQ ID No 1所示。其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。還包括雙加氧酶基因，雙加氧酶基因為bphC2基因。bphC2基因編碼閱讀框包括903bp堿基，編碼成含有300個氨基酸的蛋白質(zhì)。

以上提到的源于多氯聯(lián)苯降解菌的雙加氧酶基因在多氯聯(lián)苯和聯(lián)苯類物質(zhì)降解中的應(yīng)用。應(yīng)用的方式包括用于基因工程菌的構(gòu)建，用于雙加氧酶的制備和獲取利用，作為材料用于環(huán)境監(jiān)測。

實施例2

實施例1提到的源于多氯聯(lián)苯降解菌的雙加氧酶基因的制備方法，包括以下步驟：

(1)多氯聯(lián)苯降解菌WB1染色體總DNA的提?。?/p>

多氯聯(lián)苯降解菌WB1提前兩天劃平板活化，挑取單菌落接種于5ml的試管，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜，10％的接種量轉(zhuǎn)接至50ml LB液體培養(yǎng)基搖至穩(wěn)定期(>10⁸cfu/ml)，12000rpm離心5分鐘，TEN洗滌菌體，離心收集菌體，懸浮于10ml的TEN中，加入50μL的蛋白酶K(20mg/ml)，再加入1ml的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的SDS，在50℃的溫水浴保溫3小時，加入1/3體積的飽和NaCl溶液劇烈振蕩15秒，12000rpm離心5min，上清液用體積比為1:1的酚：氯仿溶液抽提兩次，12000rpm離心5min收集上清液，加入0.6體積的異丙醇沉淀，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70％的乙醇洗滌，吹干，溶于TER中，備用。

(2)多氯聯(lián)苯降解菌WB1基因組文庫的構(gòu)建：

將步驟(1)中獲得的多氯聯(lián)苯降解菌WB1總DNA用Sau3AI酶切，回收2-4kb的酶切片段(圖1)，由圖1可見，酶切后回收的酶切片段純度較高，片段大小與目標(biāo)一致，可以用于后續(xù)試驗。將2-4kb的酶切片段與用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ徹底酶切并進(jìn)行脫磷處理的pUC18質(zhì)粒以大約2：1的摩爾比混合，16℃連接反應(yīng)12小時以上。酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α高效感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB/AMP平板，構(gòu)建了WB1菌株基因組文庫。

(3)多氯聯(lián)苯降解酶陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

按照步驟(2)中的方法，待轉(zhuǎn)化子長出后，將平板放置于凈化工作臺上，用配制好的DHBP顯色液(1g/L)噴灑在LB瓊脂平板上的菌落上，30-37℃溫育1-5min，觀察是否有白斑菌落呈黃色，將顯黃色的菌落標(biāo)記，并分離培養(yǎng)后對插入的外源DNA片斷進(jìn)行測序。

實施例3

實施例2中來源于多氯聯(lián)苯降解菌的多氯聯(lián)苯降解酶的功能驗證試驗一。

將實施例2步驟(3)中帶有降解酶基因的陽性轉(zhuǎn)化子接入加有AMP抗生素的LB試管中，37℃培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)好的菌液移加到10ml離心管內(nèi)，8000rmp，離心5min，收集沉淀，用5mlPBS磷酸緩沖液(pH8.0)清洗沉淀兩次，用適量PBS磷酸緩沖液懸浮菌體。在無菌離心管中加入1.8mlPBS懸浮細(xì)菌，以PBS最對照，加200μlDHBP(500ppm)，30-37℃溫育1-5min，觀察是否顯色。結(jié)果顯示，對照為無色，加入菌懸液的樣品顯黃色，證明多氯聯(lián)苯降解酶陽性轉(zhuǎn)化子可以將2,3-二羥基聯(lián)苯降解，產(chǎn)生了黃色產(chǎn)物。

實施例4

實施例3中來源于多氯聯(lián)苯降解菌的多氯聯(lián)苯降解酶的功能驗證試驗二。

將實施例3中的不加菌液的對照和加入菌液的樣品分別轉(zhuǎn)移至10ml帶塞試管中，分別加入4ml乙酸乙酯，在渦旋混勻器上振蕩30s，靜置30min，取上層溶液轉(zhuǎn)移至干燥的試管中，加入烘干的無水硫酸鈉，樣品用紫外掃描儀進(jìn)行200nm-350nm掃描檢測(圖2)。結(jié)果顯示，對照在245nm處有一個最大的吸收峰，而加入菌液處理的樣品在245nm處無明顯吸收峰，證明DHBP已被降解。

總之，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所作的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明專利的涵蓋范圍。