專利名稱：文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因(cDNA全長(zhǎng)序列和氨基酸序列)的擴(kuò)增、表達(dá)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
文蛤(Meretrix meretrix)是一種重要的海水增養(yǎng)殖灘涂貝類，主要分布于朝鮮、日本、越南、印度和中國(guó)沿海。在我國(guó)主要分布于遼寧遼河口、山東黃河口、江蘇長(zhǎng)江口和廣西的北海等海區(qū)，是我國(guó)主要的出口鮮活水產(chǎn)品之一。近十年來，由于病害等原因，特別是紅肉病的蔓延，文蛤增養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展受到嚴(yán)重制約。因此，對(duì)文蛤病害特別是其自身免疫抗性的研究，已經(jīng)成為解決文蛤產(chǎn)業(yè)瓶頸的重要途徑。
作為一種重要的免疫相關(guān)基因,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD),是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，對(duì)于清除活性氧自由基(reactiveoxygenspecies, R0S),防止活性氧自由基破壞細(xì)胞的組成、結(jié)構(gòu)和功能，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷具有十分重要的作用，對(duì)生物體防御毒性起著關(guān)鍵作用。SOD按其結(jié)合的金屬離子的不同，主要可分為3類Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe_S0D，其中銅鋅超氧化物歧化酶在生物體內(nèi)分布相對(duì)廣泛，也是目前為止研究得最多的超氧化物歧化酶。已有研究表明銅鋅超氧化物歧化酶在生物體內(nèi)有胞內(nèi)形式(icCu/Zn-SOD)和胞外形式(EC-SOD)兩種。Cu/Zn-S0D與貝類免疫水平密切相關(guān)，能夠增強(qiáng)吞噬細(xì)胞防御能力和整個(gè)機(jī)體的免疫功能，使細(xì)胞免受ROS的毒害。由于Cu/Zn-S0D的存在，健康水生動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境中的活性氧自由基能夠維持在有利無害的較低水平。但是當(dāng)Cu/Zn-S0D活性降低時(shí)，生物體內(nèi)自由基量就會(huì)過多，勢(shì)必打破這種有利狀態(tài)，因此，Cu/Zn-SOD在貝類中是一種十分重要的免疫相關(guān)基因。孫虎山等對(duì)櫛孔扇貝中的銅鋅超氧化物歧化酶的活性和性質(zhì)進(jìn)行了研究，證明了 Cu/Zn-SOD的高穩(wěn)定性和櫛孔扇貝可作為SOD的提取材料。Ni等通過同源克隆的方法得到了櫛孔扇貝銅鋅超氧化物岐化酶cDNA全長(zhǎng)，并通過菌刺激后的RT-PCR實(shí)驗(yàn)得出了Cu/Zn-SOD是一種誘導(dǎo)型急性免疫蛋白，并能在鰻弧球菌屬及光球菌感染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。包永波等通過研究，得到了海灣扇貝Cu/Zn-SOD基因的全長(zhǎng)，并分析出海灣扇貝Cu/Zn-SOD基因包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，并通過菌刺激實(shí)驗(yàn)和體外表達(dá)證實(shí)了海灣扇貝Cu/Zn-SOD在免疫防御中的重要作用。Li等人2010年通過同源克隆及RACE克隆得到了菲律賓蛤仔的細(xì)胞內(nèi)銅鋅超氧化物岐化酶(VpSOD) cDNA全長(zhǎng)，并通過鰻弧菌刺激實(shí)驗(yàn)得出了 VpSOD蛋白為誘導(dǎo)型急性免疫蛋白的結(jié)論。而目前還未見文蛤Cu/Zn-SOD基因方面的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用構(gòu)建cDNA文庫、EST分析和3' RACE技術(shù)，對(duì)文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因進(jìn)行了研究，首次從文蛤中克隆到胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明從文蛤中克隆到胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因，它具有SEQ ID NO. I所示的喊基序列，其編碼蛋白具有SEQ ID NO. 2所不的氣基酸序列。本發(fā)明克隆得到的文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因，該基因cDNA全長(zhǎng)1383bp，5' UTR為45bp，3' UTR為876bp，有一個(gè)462bp開放閱讀框，編碼153個(gè)氨基酸，Cu原子分別與 His46、His48、His63、Hisll9 配位，Zn 則與 His63、His71、His80 和 Asp83 配位，半胱氨酸Cys57和Cysl45之間形成唯一的鏈內(nèi)二硫鍵。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中心是由8條反向平行的β折疊圍成的圓桶狀結(jié)構(gòu)。有多聚腺苷酸加尾信號(hào)和多聚腺苷酸尾巴；該基因在文蛤免疫防御方面具有重要功能。本發(fā)明的另一方面在于，構(gòu)建一種重組文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因的質(zhì)粒，其將SEQ ID NO. I的堿基序列所對(duì)應(yīng)的基因片段連接至表達(dá)載體PET-30a中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明的另一方面在于，構(gòu)建一種表達(dá)文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶的基因工程菌，其將SEQ ID NO. I的堿基序列所對(duì)應(yīng)的基因片段連接至表達(dá)載體PET-30a中，構(gòu)建重組 表達(dá)質(zhì)粒。并將所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a宿主細(xì)胞獲得重組基因工程菌。本發(fā)明的另一方面在于，公開一種從文蛤中克隆到胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因的方法，其具體步驟包括(I)文蛤總RNA的提取及mRNA的純化；其中,所述文蛤總RNA的提取的模板是從感染了鰻弧菌的文蛤血淋巴中提取的總RNA。(2)文蛤cDNA文庫構(gòu)建及序列的測(cè)序；(3)用基因特異性引物 Mm-icCuZnSOD-F :5' -TTTCCCGAAGCCCTATTG— 3' (SEQIDNO. 3)和3' RACE克隆到文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因cDNA全長(zhǎng)序列。上述方法中，所述的文蛤cDNA文庫構(gòu)建及序列的測(cè)序等技術(shù)內(nèi)容，還包括EST序列(表達(dá)序列標(biāo)簽)的大規(guī)模測(cè)序、軟件分析同源性等試驗(yàn)方法，以及CDNA3'快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)均為本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施例中也有各試驗(yàn)方法的進(jìn)一步描述。本發(fā)明利用表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)技術(shù)、CDNA3'快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)從文蛤中克隆得到了胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因，可用于胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因的重組表達(dá)和基因轉(zhuǎn)移，并為文蛤病害防治、基因輔助選育及進(jìn)一步開發(fā)為藥物產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。所指定得到的文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因的序列可在文蛤遺傳選育中應(yīng)用；也可在細(xì)菌、酵母和昆蟲細(xì)胞系的表達(dá)；例如克隆到PQE系列、pET等系列表達(dá)載體中，再將構(gòu)建成的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌和酵母，篩選陽性克隆并以IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。利用親和層析對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行多級(jí)純化，獲得體外重組表達(dá)的文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶。該產(chǎn)品可作為藥物、飼料添加劑、防腐劑或保鮮劑使用。本發(fā)明的另一方面在于，具有文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶序列(SEQ ID NO. I)的基因在制備文蛤免疫學(xué)藥品、文蛤病害防治藥品中的應(yīng)用本發(fā)明的另一方面在于，具有文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶序列(SEQ ID NO. I)的基因在文蛤遺傳選育中的應(yīng)用。即本發(fā)明還可以根據(jù)序列表SEQ ID NO. I的序列設(shè)計(jì)PCR和RT-PCR引物，對(duì)文蛤不同個(gè)體和不同地理群體的胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因的部分序列進(jìn)行擴(kuò)增和序列測(cè)定，比較不同個(gè)體在胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因序列上的差異，同時(shí)比較不同個(gè)體和地理群體的胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因mRNA表達(dá)的差異，以此指導(dǎo)文蛤的遺傳選育。有益效果本發(fā)明所獲得文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因(SEQ ID NO. I)可以用于基因轉(zhuǎn)移等方面的研究，也可以用于胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因的體外重組表達(dá)相應(yīng)蛋白，在醫(yī)藥產(chǎn)品制備、文蛤免疫學(xué)研究、遺傳選育和改良、病害防治等方面有廣闊的應(yīng)用前景。


圖I :SDS_PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白1泳道為PET_30a空載體，2泳道為大腸桿菌BL21 (DE3)粗提物的上清液(表達(dá)載體IPTG誘導(dǎo))，3泳道為大腸桿菌BL21粗提物的沉淀， 4泳道為大腸桿菌BL21 (DE3)粗提物未誘導(dǎo)表達(dá)載體，圖中箭頭所示為目的條帶。圖2 SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白純化結(jié)果M是takara低分子量蛋白Marker, I泳道為純化前的重組蛋白，2泳道為純化后的重組蛋白，此結(jié)果證明純度很高。
具體實(shí)施例方式下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例I文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因的克隆本發(fā)明中，實(shí)施例所用感染了鰻弧菌的文蛤采自遼寧省盤山縣雙臺(tái)子河口。文蛤總RNA是從其血淋巴中提取的。(I)文蛤總RNA的提取和mRNA的純化用注射器從感染了鰻弧菌的文蛤的閉殼肌中采集血淋巴，4°C 700g離心10分鐘，利用Omega公司的E. Z. N. A. Total RNA Midi Kit試劑并參照其說明提取總RNA。(2)文蛤cDNA文庫構(gòu)建利用QIAGENE 公司的 01igotex -dT30〈Super>mRNA 純化試劑盒(Takara),進(jìn)行mRNA的分離純化。根據(jù)Creator SMART cDNA文庫構(gòu)建試劑盒(Clontech)說明書，取3 μ L總 RNA，加入 I μ L SMART IV Oligonucleotide, I μ L CDS III /3，PCR Primer ;在 72°C下作用2min，然后加入第I鏈合成試劑，42°C反應(yīng)Ih后，在冰上終止反應(yīng)。雙鏈cDNA的合成按照試劑盒操作說明書加入反應(yīng)試劑和Ily L第I鏈合成產(chǎn)物，在PCR儀器中進(jìn)行如下反應(yīng)72 °C預(yù)變性lOmin，95 V預(yù)變性20s后，95 °C 30s,68°C 8min,進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后取5 μ L合成產(chǎn)物在I. 1%的TBE瓊脂凝膠上，IOOv電泳30min,拍照。蛋白酶K消化取50 μ L ds DNA，加入2(^1^蛋白酶1(，混勻，451孵育201^11，加入50 μ L去離子水，等體積苯酚/氯仿、氯仿/異丙醇各抽提I次，乙醇沉淀，80%乙醇洗滌后，溶于79μ L水中。按照試劑盒操作說明書操作，在反應(yīng)管中加入SFi I酶切試劑和純化的cDNA，50°C水浴酶切2h，然后加入2 μ L 1% 二甲苯胺染料，混勻備用。將上述SFi I酶切產(chǎn)物經(jīng)過CHROMA SPIN-400柱進(jìn)行分級(jí)分離，收集16管，每管I滴。分別取3 μ L于I. 1%凝膠瓊脂糖電泳，收集符合條件的3管，加糖原沉淀后，溶于7 μ L超純水中。
cDNA與XTriplEx 2載體的連接反應(yīng)體積比分別采用1:0. 5、1:1和1:2，于16°〇連接12h。在連接好的DNA樣品中加入50 μ L的包裝蛋白，輕輕混勻并快速離心，室溫放置3h，加入445 μ L噬菌體緩沖液，輕輕混勻，再加入25 μ L氯仿，緩慢顛倒混勻，離心取出氯仿，獲得文蛤原始cDNA文庫。(3)文蛤cDNA文庫EST序列的大規(guī)模測(cè)定文庫送上海美季生物公司，MegaBACElOOO測(cè)序儀上，使用載體通用引物T3 5’ -ATTAACCCTCACTAAAGGGAA-3’進(jìn)行序列測(cè)定，將得到的原始峰圖文件(*. abi, *. abd文件)數(shù)據(jù)經(jīng)Phred程序處理轉(zhuǎn)化為序列文件(*. seq)和質(zhì)量文件(*. seq. qual)，依據(jù)質(zhì)量文件提供的數(shù)值確定獲得序列的誤差概率，去除低質(zhì)量的堿基，用cross-mach程序屏蔽數(shù)據(jù)中的載體序列，從得到的數(shù)據(jù)中選取連續(xù)堿基質(zhì)量大于Q13 (準(zhǔn)確率大于95%)且長(zhǎng)度大于IOObp的序列作為EST數(shù)據(jù)。(4)文蛤EST序列的同源性分析及文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因片段的篩選將獲得的全部有效的EST數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類拼接，生成Contigs和Singletons，分別將所獲得的Contigs和Singletons在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTn和BLASTx分析,根據(jù)相似性分析結(jié)果尋找出與胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因同源的EST序列，Cu/Zn-SOD氨基酸序列同源性比對(duì)結(jié)果如下表證明文蛤icCu/Zn-SOD與紫貽貝等其他9種海洋貝類的Cu/Zn-SOD具有較高的同源性。經(jīng)過上述對(duì)比分析的結(jié)果表明Mm-Cu/Zn-S0D與其他海洋貝類Cu/Zn-SOD具有較高的相似性，也具有較高的同源性。同時(shí)，由于Cu/Zn-SOD在氨基酸組成上有缺乏色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的特點(diǎn)，而已經(jīng)得到的Mm-Cu/Zn_S0D在氨基酸組成上，不含色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，這進(jìn)一步證明該蛋白質(zhì)是銅鋅超氧化物歧化酶，該基因是Cu/Zn-SOD 的 cDNA。Mm-Cu/Zn-SOD 可推測(cè)為文蛤的 Cu/Zn-SOD 基因。
登錄號(hào)rm~同源性/%~
地中海貽貝 Mytilus galloprovincialisCAQ68509. I3e-54 71%
紫貽貝 Mytilus edulisCAE46443. I8e-53 70%
皺紋盤鮑 Haliotis discus discusABG88844. Ile-51 69%
褶紋冠蚌 Cristaria plicataACI28282. Ile-52 69%
近江牡頓 Crassostrea ariakensisABF14366. I2e-54 68%
太平洋牡頓 Crassostrea gigasCAD42722. I6e-53 68%
才節(jié)孔扇貝 Chlamys farreriABD58974. I2e-52 66%
海灣扇貝 Argopecten irradiansACE769546e-50 66%
菲律賓給仔 Venerupis philippinarumACU83236. I2e-49 65%
(5)文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因cDNA全長(zhǎng)序列的克隆從文庫中分別篩選出I條Contigs和I條Singletons與胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因同源的EST序列，發(fā)現(xiàn)已獲得5'全長(zhǎng)；現(xiàn)利用3' RACE技術(shù)克隆文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因cDNA全長(zhǎng)序列，根據(jù)與胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因同源的EST序列設(shè)計(jì)基因特異性引物 Mm-icCuZnSOD-F (SEQ ID NO. 3) 5/ 一TTTCCCGAAGCCCTATTG— 3'，結(jié)合載體通用引物M13Reverse Primer進(jìn)行3'末端的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用I. 5%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)，用膠回收試劑盒(大連寶生物工程有限公司)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收和純化，送大連寶生物工程有限公司克隆測(cè)序，測(cè)得序列經(jīng)CLUSTER分析拼接后得到全長(zhǎng)序列。3'端PCR擴(kuò)增所用體系以及反應(yīng)條件25yL反應(yīng)體系2.5yL IOXPCR (含Mg2+)，2. O μ IdNTP (各 2·5πιΜ)，1·0μ1 cDNA 模板，O. 5μ I 弓丨物 M13Reverse Primer(lOpmole/μ I )，O. 5μ I 引物 Mm-icCuZnSOD-F (SEQ ID NO :3) (lOpmole/μ I), rTaq DNA聚合酶(Takara 公司)(5U/μ I) 0. 2 μ 1，超純水 17. 3 μ I。
反應(yīng)在PTC_200(MJ公司)中進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94°C 5min ;然后94°C 30s，55°C 45s, 72°C 45s，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，并送至寶生物工程大連有限公司測(cè)序。通過上述試驗(yàn)方法，克隆獲得一種文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因，具有以下序列(SEQ ID NO. 1)，序列特征長(zhǎng)度1383堿基對(duì)；類型核酸；鏈型雙鏈；拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形；來源文蛤(Meretrix meretrix)；其氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)的序列特征如下長(zhǎng)度153個(gè)氨基酸；類型氨基酸；鏈型單鏈；拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形；來源文蛤(Meretrix meretrix)。開放閱讀框共編碼153個(gè)氨基酸。按照標(biāo)準(zhǔn)密碼子翻譯后的蛋白質(zhì)推測(cè)分子式為C685Hlltl5N199O221S5，分子量計(jì)算值為15. 82kD，理論等電點(diǎn)為6. 03 ;氨基酸組成中帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys+Arg)25個(gè)，占16. 34%,帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp+Glu)21個(gè)，占13. 73%。極性與極性帶電氨基酸共76個(gè)占49. 67%，非極性氨基酸77個(gè)占50. 33%，極性氨基酸比例較大，決定了文蛤超氧化物歧化酶在水中有較好的溶解性。實(shí)施例2.文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因的重組表達(dá)及重組表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用(一)引物根據(jù)序列表SEQ ID NO. 2中文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶對(duì)應(yīng)cDNA序列設(shè)定引物，引入兩個(gè)不同的限制性內(nèi)切酶突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)帶有Ecor I限制性酶切位點(diǎn)的正向引物SEQ IDN0. 4和帶有Xho I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的反向引物SEQ ID NO. 5，用來擴(kuò)增Mm-Cu/Zn-SOD 的 ORF。SEQ ID NO. 4 CGRaattcatRtcRttaataRatRcaRtRtRtR 正向引物SEQ ID NO. 5 CcgctOgagttatttcttcttaattccaatgacacc 反向引物(二)構(gòu)建克隆載體 PMD-Mm-Cu/Zn-S0D將擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收(TaKaRaAgarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. O :寶生物工程大連有限公司)，(I)與 PMD-IOT 載體連接(PMD-IOT simple vector, Ligation Mix :寶生物工程大連有限公司)，連接體系pMD19-T載體1μ I ；DNA4 μ I ； Solution I 5μ I ;16攝氏度過夜。(2)配sob培養(yǎng)基100ml，其中50ml不加抗生素備用，50ml鋪成2個(gè)平板，鋪平板之前按IOOuL: IOOmL比例加氨芐抗生素。SOB培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基是3. 05g sob: IOOml純水，固體培養(yǎng)基是在此基礎(chǔ)上再加入I. 5g瓊脂粉，煮沸滅菌。(3)將連接好的克隆載體PMD-Mm-Cu/Zn-SOD轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5 α。冰浴30min，42°C熱激I分50秒，冰浴2_3min，加IOOOul不含抗生素的液體培養(yǎng)基，37 °C 培養(yǎng) 45min。(4)涂平板
在無菌操作臺(tái)中吸出200-300ul培養(yǎng)液，均勻涂布在之前準(zhǔn)備好的平板上，待培養(yǎng)液深入平板以后，37攝氏度倒置過夜培養(yǎng)。(5)挑菌每個(gè)I. 5ml離心管中加入IOOOuI含有氨芐抗生素的液體培養(yǎng)基，用滅菌槍頭輕蘸一下菌落插入帶有培養(yǎng)基的離心管中，輕輕攪動(dòng)后移出槍頭。37°C下200轉(zhuǎn)搖菌6個(gè)小時(shí)左右，期間搖2-3個(gè)小時(shí)做一份PCR檢測(cè)是否有片段插入。(6)選結(jié)果較好的一管，取出200ul菌液加200ul甘油_80°C凍存，同一管其余的用來測(cè)序，保留測(cè)序結(jié)果為陽性的菌液。(三)構(gòu)建表達(dá)載體PET-Mm-Cu/Zn-S0D(I)取IOul保存的陽性菌液，加入IOOOul含有氨芐抗生素的液體培養(yǎng)基(每個(gè)做五管)，37攝氏度搖菌過夜(搖目的菌和相應(yīng)的載體菌)。(2)用質(zhì)粒小提試劑盒(北京天根生化科技公司)提目的菌和載體菌的質(zhì)粒。提出來以后檢測(cè)產(chǎn)物濃度X/ul，用于計(jì)算酶切反應(yīng)體系。目的片段和PET_30a載體經(jīng)過內(nèi)切酶EcoRI酶切反應(yīng)后，切膠回收目的片段，純化后與表達(dá)用質(zhì)粒載體PET-30a連接。連接體系(IOul)(保證目的DNA0. 3pmol :載體0. 03pmol)T4連接酶lul, T4連接酶 Bufferl. 6ul, 16°C過夜。(3)將構(gòu)建成的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到克隆感受態(tài)大腸桿菌DH5a上(同步驟2)(4)培養(yǎng)經(jīng)測(cè)序正確的克隆菌株，提取ρΕΤ-Mm-Cu/Zn-SOD表達(dá)載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到表達(dá)感受態(tài)BL21中，剩下的表達(dá)載體質(zhì)粒_20°C保存，涂平板，所用抗生素為卡納(用的抗生素是根據(jù)所用表達(dá)載體的抗性決定的)。轉(zhuǎn)化時(shí)用3ul質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化一個(gè)不帶目的片段的空載體質(zhì)粒作對(duì)照。(5)分別挑取對(duì)照菌和重組菌單菌落接于3ml加有卡納抗生素的的新鮮培養(yǎng)基中，37°C，過夜培養(yǎng)。期間做PCR檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，取200ul菌液加200ul甘油_80°C保存，留做大量表達(dá)用。(四)誘導(dǎo)培養(yǎng)誘導(dǎo)時(shí)菌液與培養(yǎng)基比例為500ul菌液25ml含有卡納抗生素的液體培養(yǎng)基，此步驟需要通氣培養(yǎng)，所以用錐形瓶搖菌時(shí)最好在瓶?jī)?nèi)留有較多空間。37°C，培養(yǎng)2個(gè)半小時(shí)左右，0D600值達(dá)到0. 4-0. 6時(shí)，一個(gè)加入IPTG (IPTG濃度為24mg/ml，終濃度為0. Immo I/ml)誘導(dǎo)，一個(gè)不加IPTG作對(duì)照，在37 °C下200轉(zhuǎn)搖菌3小時(shí)，然后4000轉(zhuǎn)離心5min,棄上清。
(五)SDS-PAGE蛋白電泳后染色所用染色液為天根生化科技有限公司的蛋白膠快速染色液。將膠放入50ml蒸餾水中煮沸后保持lmin，然后搖lOmin。倒掉蒸餾水，加入染色液，沒過膠面即可，煮沸后保持lmin，再搖IOmin (將染色液倒回回收瓶留待下次使用)，再次倒入蒸懼水煮沸保持lmin,搖5min,倒掉蒸懼水,加入清水觀看即可。SDS-PAGE分析周質(zhì)蛋白表明，在表達(dá)的條帶中出現(xiàn)一條相對(duì)分子量約為21kD的條帶(I條帶)，是含有文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶的片段，與理論計(jì)算值相符，如圖I所示。SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白考馬斯亮藍(lán)染色，I泳道為PET-30a空載體，2泳道為大腸桿菌BL21 (DE3)粗提物的上清液(表達(dá)載體IPTG誘導(dǎo))，3泳道為大腸桿菌BL21粗提物的沉淀，4泳道為大腸桿菌BL21 (DE3)粗提物未誘導(dǎo)表達(dá)載體，圖中箭頭所示為目的條帶。(六)大量誘導(dǎo)(I)取_80°C保存的用來做大量誘導(dǎo)的菌放到冰上融化，以IOul菌液1ml培養(yǎng)基(含抗生素)比例搖20ml菌過夜。
(2)將上一步過夜搖的菌液加入含氨芐抗生素的液體培養(yǎng)基。IL的錐形瓶中誘導(dǎo)搖菌300-400ml，共搖菌3瓶，進(jìn)行通氣培養(yǎng)。(3)在大搖床上搖菌，培養(yǎng)室溫度在22°C，搖菌三個(gè)小時(shí)OD值可達(dá)到O. 4-0. 6，測(cè)好OD值加入IPTG誘導(dǎo)(ImlIPTG IOOOml菌液)，繼續(xù)搖6個(gè)小時(shí)，收集菌體分裝后_80°C凍存，留做純化。Mm-Cu/Zn-SOD蛋白片段出現(xiàn)在上清中，未形成包涵體，具有生物學(xué)活性，為可溶性蛋白，表達(dá)量較大，可進(jìn)行后續(xù)活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)。同時(shí)也證明了 Mm-Cu/Zn-SOD為胞質(zhì)蛋白。(七)蛋白純化采用鎳柱層析方法。預(yù)處理(I)從_80°C冰箱中取出大量誘導(dǎo)后收集的菌體2克，冰上解凍。(2)加Lysis Buffer至9ml,加入溶菌酶(每毫升加入I毫克溶菌酶)。(3)超聲破碎，每隔10秒工作10秒至澄清，功率200W。(4)如果液體過于粘稠加入RNA酶,每毫升加入IOug,冰上反應(yīng)10_15min。(此步驟為選擇性操作，一般情況下不做)。(5) 10000 轉(zhuǎn)離心 30min，取上清。(6)取 IOul 上清加入 5ul 2 X SDS Buffer，煮沸 5min 于 _20°C凍存留作 SDS PAGE分析。過柱子(I)加2ml 50%鎳柱(Ni-NTA)至8ml上清液中，輕輕混勻，4攝氏度下放置一個(gè)小時(shí)，期間，間歇性輕輕混勻。Lysis Buffer中的咪唑起到抑制雜質(zhì)蛋白與鎳柱結(jié)合的作用，如果組氨酸標(biāo)記的目的蛋白吸附不上，應(yīng)將咪唑含量減少至10mM。(2)將上述混合液加入層析柱，等待里面的鎳柱沉至柱低。(3)打開底蓋收集2-3滴液體，加入相應(yīng)量的2 X SDS Buffer煮沸于_20°C凍存留作PAGE分析，其余液體流掉。(4)用4ml Wash buffer洗6次，每次將Wash buffer加入后先流掉一點(diǎn)，再收集2-3滴，加入相應(yīng)量的2 X SDS Buffer于_20°C凍存留作PAGE分析，分析第I次和第5、6次的液體，確定有沒有洗掉雜蛋白，和是否有目的蛋白流失，其余流掉。(5)洗脫用O. 5ml Elution buffer洗8-9次,每次的都收集到一個(gè)單獨(dú)的管里,從第I管和第7、8、9管中分別取出IOul加入5ul 2 X SDS Buffer煮沸做PAGE分析。(6) SDS蛋白電泳分析，結(jié)果的判斷參考所述步驟(六)。(A)透析目的去除小于目的片段的小分子蛋白和離子，主要是過柱中引入的咪唑。防止影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，例如小分子蛋白會(huì)影響蛋白濃度檢測(cè)，咪唑會(huì)影響蛋白活性測(cè)定。(I)透析液的選擇I XPBS緩沖液。(2)上海寶曼生物有限公司的纖維素透析袋(MWCO 5000)，4°C下透析48個(gè)小時(shí)，期間換透析液3-4次，透析容器最好要大。經(jīng)SDS蛋白電泳分析，SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白純化結(jié)果如圖2 :M是takara低分子量蛋白Marker，I泳道為純化前的重組蛋白，2泳道為純化后的重組蛋白，此結(jié)果證明純度很高。(九)重組表達(dá)蛋白活性測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，購(gòu)于南京建成生物有限公司。純化蛋白的定量(I)試劑準(zhǔn)備考馬斯亮藍(lán)貯備液60ml X瓶，用時(shí)5倍稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。4°C下6個(gè)月蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0. 563g/L O. 5ml 一支，4°C下I個(gè)月_20°C 3個(gè)月，用前分裝。(2)操作按表配制待測(cè)樣品。
權(quán)利要求
1.文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因，其特征在于具有SEQID NO. I所示的堿基序列。
2.如權(quán)利要求I所述的文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因所編碼的蛋白，其特征在于具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
3.—種重組文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因的質(zhì)粒，其特征在于，將權(quán)利要求I所述的堿基序列所對(duì)應(yīng)的基因片段連接至表達(dá)載體PET-30a中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。
4.一種表達(dá)文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶的基因工程菌，其特征在于，將權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a宿主細(xì)胞獲得重組基因工程菌。
5.權(quán)利要求I所述堿基序列的文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因的克隆方法，其特征在于，包括 (1)文蛤總RNA的提取及mRNA的純化；其中,所述文蛤總RNA的提取的模板是從感染了鰻弧菌的文蛤血淋巴中提取的總RNA ； (2)文蛤cDNA文庫構(gòu)建及序列的測(cè)序； (3)用引物SEQID NO. 3以及3' RACE方法克隆到文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因cDNA全長(zhǎng)序列。
6.具有權(quán)利要求I所述堿基序列的文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因在制備文蛤免疫學(xué)藥品、文蛤病害防治藥品中的應(yīng)用。
7.具有權(quán)利要求I所述堿基序列的文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因在文蛤遺傳選育中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因的克隆方法及其應(yīng)用，本發(fā)明利用構(gòu)建cDNA文庫、EST分析和3′RACE技術(shù)，對(duì)文蛤胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因進(jìn)行了研究，首次從文蛤中克隆到胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因，它具有SEQ ID NO.1所示的堿基序列，其編碼蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。該基因可以用于胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶基因的體外重組表達(dá)和基因轉(zhuǎn)移，為醫(yī)藥產(chǎn)品開發(fā)、文蛤免疫學(xué)研究、遺傳選育和改良、病害防治奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N9/08GK102807987SQ20121030754
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月27日
發(fā)明者高祥剛, 赫崇波, 李宏俊, 劉衛(wèi)東, 王志松, 李云峰, 鮑相勃 申請(qǐng)人:遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院