一種固定化能降解大豆蛋白過敏原的蛋白酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種固定化能降解大豆蛋白過敏原的蛋白酶的方法，屬于固定化酶領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆具有豐富的必需氨基酸組分，是人和畜禽的優(yōu)質(zhì)植物性蛋白源，具有很高的 營養(yǎng)價(jià)值，此外，大豆蛋白還具有優(yōu)越的加工性能如乳化性和起泡性等，以及良好的生理功 能，能降低膽固醇、減少患心臟疾病的危險(xiǎn)等。隨著大豆蛋白分離技術(shù)的改進(jìn)，大豆蛋白作 為營養(yǎng)性和功能性成分得到了廣泛的應(yīng)用，以大豆蛋白為基礎(chǔ)的加工食品是目前食品工業(yè) 中增長最快的一類。但是，大豆蛋白也是八大類主要致敏原之一，全球有近〇. 3% -0. 4%的 人口對大豆過敏。研宄發(fā)現(xiàn)，約有0. 3%-0. 4%的嬰幼兒會對大豆蛋白過敏，而且隨著大豆 蛋白制品被廣泛使用，成人對大豆蛋白過敏的發(fā)病率也在不斷地攀升。大豆過敏癥狀表現(xiàn) 出多種不同形式，常見的包括濕瘆、過敏性皮炎和哮喘等。此外，大豆蛋白作為動(dòng)物飼料的 主要蛋白源，其致敏成分會損傷動(dòng)物腸道，不利于動(dòng)物的生長。
[0003] 大豆蛋白分為15S球蛋白、IlS球蛋白、7S球蛋白和2S球蛋白，其中IlS球蛋 白和7S球蛋白約占大豆蛋白總量的70%。β-伴大豆球蛋白是7S組分的主要成分，由 a '（76kDa)，a (72kDa)和β (52_54kDa)亞基組成的分子量為150kDa的三聚體化合物，約 占大豆蛋白總量的20%-30%。Ogawa等按照致敏能力和蛋白含量，把Gly m Bd 60K、Gly m Bd 30K和Gly m Bd28K作為主要大?致敏原。Gly m Bd 60K即β-伴大?球蛋白的α 亞基，是一種糖蛋白，可被25%左右的大豆敏感患者的血清識別。Krishnan等發(fā)現(xiàn)Gly m Bd 60Κ、α'亞基和β亞基都是能引發(fā)大豆過敏反應(yīng)的潛在致敏原。引起過敏反應(yīng)的過敏 原閾值水平通常很低，很少量的致敏原就足以引發(fā)過敏反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，大豆致敏原閾值水平 范圍一般為0. 0013-500mg。因而，如何有效降解大豆蛋白中的過敏原就成為了一個(gè)必須解 決的問題。
[0004] 當(dāng)前對酶解法降解大豆蛋白過敏原的研宄中利用的酶都集中于商品化的酶，很少 有針對降解大豆過敏原而篩選得到的菌株及其產(chǎn)酶的分離純化并固定化的研宄。本發(fā)明將 能夠降解大豆過敏原的蛋白酶進(jìn)行固定化，改善其熱穩(wěn)定性，使更適于工業(yè)運(yùn)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種能夠降解大豆蛋白過敏原的蛋白酶的固定化方法，以海藻酸鈉 作為載體，利用包埋法將蛋白酶進(jìn)行固定化。
[0006] 所述方法，具體包括：⑴于4°C下，將蛋白酶活力250-260^111171的蛋白酶酶 液與30g · Γ1海藻酸鈉溶液按照體積比1:2混合均勻；（2)將所得溶液，滴加到冰浴的 20g · L4CaCl^液中，形成直徑l-2mm的凝膠顆粒；（3)于4°C固定化0. 5-6h后，抽慮收集 凝膠顆粒，并洗滌3次后置于4°C備用。
[0007] 所述蛋白酶來源于一株可降解大豆主要過敏原的芽孢桿菌，菌株保藏號為CCTCC No. M2012165,分類學(xué)命名為 Bacillus sp. BBE201108。
[0008] 所述蛋白酶可降解的過敏原包括：β -伴大豆球蛋白的α亞基和β -伴大豆球蛋 白的α '亞基。
[0009] 本發(fā)明還提供一種利用所述固定化蛋白酶降解大豆蛋白過敏原的方法，是將固定 化蛋白酶與10%以下的大豆分離蛋白溶液（Soy protein isolates，SPI)按照每ImL SPI 溶液添加30-500U蛋白酶的比例混合，于20-80°C反應(yīng)5-30min。
[0010] 所述降解大豆蛋白過敏原的方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，按照每ImL的1% SPI溶液中添加120U的蛋白酶。
[0011] 所述降解大豆蛋白過敏原的方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，反應(yīng)溫度為60°C。
[0012] 本發(fā)明以海藻酸鈉為載體，利用包埋法固定化Bacillus sp.BBE201108蛋白酶。海 藻酸鈉是天然多糖碳水化合物，是食品安全級材料。本發(fā)明利用海藻酸鈉對酶進(jìn)行固定后， 在較好地保持酶的生物活性的基礎(chǔ)上，還提高的酶的最適反應(yīng)溫度。固定化后的蛋白酶的 酶活回收率為63. 42%，固定化后的Bacillus sp. BBE201108蛋白酶較游離酶的最適反應(yīng) 溫度升高了 10°C至60°C，對溫度和pH的適應(yīng)范圍均增寬，熱穩(wěn)定性明顯提高。理化性質(zhì)的 改善更有利于該酶在非發(fā)酵大豆制品的處理及加工的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0013] 圖1為固定化蛋白酶對大豆分離蛋白過敏原的降解效果驗(yàn)證，M為marker，C為處 理前的大豆蛋白，S為處理后的大豆蛋白。
[0014] 圖2為pH對固定化酶和游離酶的酶活力的影響。
[0015] 圖3為溫度對固定化酶和游離酶的酶活力的影響。
[0016] 圖4為固定化酶和游離酶的溫度穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1蛋白酶酶活測定
[0018] I. L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：L_酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按表1配制
[0019] 表 1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種能夠降解大豆蛋白過敏原的蛋白酶的固定化方法，其特征在于，以海藻酸鈉作 為載體，利用包埋法將蛋白酶進(jìn)行固定化；所述方法，具體包括：⑴于4°C下，將蛋白酶活 力250-260U?mL-1的蛋白酶酶液與30g?L-1海藻酸鈉溶液按照體積比1:2混合均勻；（2) 將所得溶液，滴加到冰浴的20g?I^1CaCl2溶液中，形成直徑1-2_的凝膠顆粒；（3)于4°C 固定化0. 5-6h后，抽慮收集凝膠顆粒，并洗滌3次后置于4°C備用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶來源于一株可降解大豆主要 過敏原的芽孢桿菌，菌株保藏編號為CCTCCNo.M2012165。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述過敏原包括：0 -伴大豆球蛋白的a 亞基和(6-伴大豆球蛋白的a'亞基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述方法得到的固定化蛋白酶。
5. -種應(yīng)用權(quán)利要求4所述固定化蛋白酶降解大豆蛋白過敏原的方法，其特征在于， 是將固定化蛋白酶與10 %以下的大豆分離蛋白溶液按照每ImL溶液添加30-500U固定化蛋 白酶的比例混合，于20-80°C反應(yīng)5-30min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，按照每ImL的1 %大豆分離蛋白溶液中添 加120U的蛋白酶進(jìn)化混合。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，反應(yīng)溫度為60°C。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種固定化能降解大豆蛋白過敏原的蛋白酶的方法，屬于固定化酶領(lǐng)域。本發(fā)明利用包埋法固定化能降解大豆蛋白過敏原成分的蛋白酶，固定化后，酶的最適反應(yīng)溫度的提高，pH和溫度的適應(yīng)范圍增廣，pH和溫度的穩(wěn)定性增強(qiáng)，理化性質(zhì)的改善更有利于該酶在非發(fā)酵大豆制品的處理及加工的應(yīng)用。
【IPC分類】C12N11-10, C12N9-54
【公開號】CN104877980
【申請?zhí)枴緾N201510247287
【發(fā)明人】張娟, 陳堅(jiān), 付歐, 堵國成
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年5月14日