一種角蛋白酶及其編碼基因和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種角蛋白酶及其編碼基 因和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 角蛋白是一種廣泛存在于動物毛發(fā)、鱗片、羽毛、角等結(jié)構(gòu)中的硬性纖維狀蛋白， 主要分為a角蛋白和0角蛋白。角蛋白分子中富含半胱氨酸，形成了大量的二硫鍵， 加上分子中的氫鍵、疏水相互作用等分子作用，使角蛋白分子結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，難以被胰蛋 白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等普通蛋白酶降解(Thysetal. ,2004;Riffeletal., 2007:Mazottoetal. .2011)〇截止2011年，全世界每年將產(chǎn)生四五百萬噸羽毛廢棄物， 僅我國就將產(chǎn)生近百萬噸(Kornillowicz-Kowalska&Bohacz, 2011)。而自然消耗是個漫 長的過程，靠傳統(tǒng)的物理化學方法處理羽毛，既破壞環(huán)境，又無法利用羽毛角蛋白中大量的 營養(yǎng)價值。因此迫切的需要一種環(huán)境友好又可回收利用角蛋白價值的轉(zhuǎn)化手段。
[0003] 角蛋白酶是一種可以有效降解角蛋白的蛋白水解酶，廣泛存在于真菌、細菌、古菌 中(Brandellietal. ,2010;Kornillowicz-Kowalska&Bohacz, 2011)〇
[0004] 然而，現(xiàn)有技術(shù)所得角蛋白酶對角蛋白的水解效果并不十分理想，同時，在利用微 生物水解角蛋白底物時，通常是聯(lián)合包括某一角蛋白酶在內(nèi)的多種因素才能獲得水解角蛋 白的效果。因此，對具有高效角蛋白水解能力的角蛋白酶的氨基酸序列及其編碼基因序列 的研究是本領(lǐng)域所亟待解決的，這不僅可以獲得更優(yōu)質(zhì)的角蛋白酶，更為重要的是這更加 利于角蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個目的在于提供能高效降解角蛋白底物的角 蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，該角蛋白酶在廣泛pH條件下可保持良好的蛋 白酶活性且熱穩(wěn)定性優(yōu)秀。
[0006] 如本發(fā)明的實施例所示，本發(fā)明角蛋白酶的比活力為92. 55 KU/mg，在pH為 4. 0-11. 0時能保持很好的角蛋白酶活性，在溫度為45-95°C時，仍具有較高的活性。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的在于提供上述角蛋白酶的編碼基因，該基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0. 2 所示。
[0008] 本發(fā)明的第三個目的在于提供制備所述角蛋白酶的方法，該方法包括步驟： 1) 利用PCR獲得SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列； 2) 將SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列克隆到原核表達載體上； 3) 將步驟2)所得物轉(zhuǎn)化入基因工程菌上； 4) 將步驟3)所得物進行誘導培養(yǎng)，即得所述角蛋白酶粗液。
[0009] 優(yōu)選的，步驟2)所述原核表達載體為pET28a。
[0010] 優(yōu)選的，步驟3)所述基因工程菌為大腸桿菌(DE3)表達菌株。
[0011] 優(yōu)選的，步驟4)所述誘導培養(yǎng)為：在含Kan抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，225 rpm，震蕩培養(yǎng)至 0D600 0.6~0.8,加入 0.5 mmol/L IPTG，37°C，225rpm，培養(yǎng) 6 小時。取 1 ml菌液12000 rmp離心2 min收集菌體，加入5 ml Lysis Buffer緩沖液充分混勾，超聲波 破碎細菌，4°C 12000g離心30 min，取上清。
[0012] 本發(fā)明的目的還在于提供所述角蛋白酶在處理含角蛋白物質(zhì)的處理上的應用，所 述含角蛋白物質(zhì)包括羽毛。
[0013] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的角蛋白酶不僅具有非常有效的降解角蛋白底物 的能力，其比活力高達59. 5 KU/mg，且能在pH為4. 0-11. 0以及溫度為45-95°C時保持良好 的活性，能很好的水解羽毛粉等角蛋白底物，具有良好的市場應用前景。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明所得角蛋白酶的pH穩(wěn)定性實驗結(jié)果，其中，"1854"代表實施例2所 得角蛋白酶； 圖2為本發(fā)明所得角蛋白酶的適應溫度范圍實驗結(jié)果； 圖3為本發(fā)明所得角蛋白酶對羽毛的降解效果圖，其中，"1854"代表實施例2所得角 蛋白酶，" Con"代表對照組。
【具體實施方式】
[0015] 下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用 于對本發(fā)明進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練 人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
所做出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0016] 實施例1 2. 1、載體、菌株及培養(yǎng)基 菌株：A coJi DH5 a、A coJi yPossete (DE3) 載體：pET28a 培養(yǎng)基：1) LB培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0. 5%酵母粉，l%NaCl。
[0017] 固體培養(yǎng)基：液體LB培養(yǎng)基中加入1. 5%瓊脂粉。
[0018] 2. 2、實驗方法(重組質(zhì)粒構(gòu)建） 引物合成 本實驗所用引物由上海英俊合成。引物序列見表1。
[0019] PCR反應/酶切/連接
以DNA為模板，合成需要克隆的基因上游及下游引物1854-F和1854-R，進行PCR反應， 反應體系為30 yl (表2)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳后，切下目的片斷的膠塊，按膠 回收試劑盒步驟進行純化，回收DNA片斷。將上述目的DNA與pMD19T Vector進行TA克隆 連接反應(表3)。目的基因DNA與載體的摩爾比優(yōu)化至2:1-10:1即可，推薦3:1，DNA濃 度通過核酸定量儀測定。各反應物混勻后16°C連接過夜。
[0020] 2. 3連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 從-80°C中取出A coJi DH5 a感受態(tài)細胞(每管1〇〇 y 1)置于冰上融化，將連接產(chǎn)物 全量加入感受態(tài)中，再冰浴30min，42°C熱激90 s，再冰浴2 min，加入890 yl S0C培養(yǎng)基， 37°C，180 r/min振蕩培養(yǎng)60 min;取適量轉(zhuǎn)化好的感受態(tài)細胞涂布于含Amp和IPTG的LB 平板，37°C培養(yǎng)14-18h。挑選陽性克隆提取質(zhì)粒并對陽性克隆質(zhì)粒進行PCR和雙酶切鑒定 重組克隆子。
[0021] 2. 4陽性克隆篩選與鑒定 隨機挑取陽性單菌落，分別接種于5 ml含有卡那霉素（100 mg/ml)的LB培養(yǎng)液中， 37°C搖床過夜培養(yǎng)。離心收集菌體，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。經(jīng)雙酶切和PCR鑒定 所得質(zhì)粒是否攜帶插入片段將篩選出的重組質(zhì)粒送金唯智公司測序以驗證其正確性。
[0022] 2. 5序列分析 將測序結(jié)果去除載體序列后與GenBank中的序列進行Blast比對分析。判斷擴增序列 正確性，利用〇RF finder工具進行酶基因完整0RF的預測。序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0023] 2. 6表達質(zhì)粒構(gòu)建及表達宿主菌轉(zhuǎn)化 將pET28a載體和上述陽性克隆子重組質(zhì)粒進行EcoR I和Xhol I雙酶切(表4)，瓊脂 糖凝膠回收，再用T4DNA連接酶連接酶切后的載體和目的基因片段(表5)。目的基因DNA與 載體的摩爾比優(yōu)化至2:1-10:1即可，推薦3:1，DNA濃度通過核酸定量儀測定。各反應物 混勻后16°C連接過夜。連接產(chǎn)物全量轉(zhuǎn)化至100 y 1 A coJi Rosseta(DE3)，并涂布于含 Kan和Amp的LB平板，37°C培養(yǎng)(方法同2. 3)。
[0024] 37°C 水浴 4-5 h。
[0025] 2.7陽性克隆篩選及誘導表達 挑取單克隆接種至50 mL含Kan和Amp的液體LB培養(yǎng)基中，37°C180rpm/min恒溫 搖床培養(yǎng)到0D600至0.5-0. 6左右。添加0.5 mM IPTG，37°C180rpm/min繼續(xù)培養(yǎng)4-5h。 培養(yǎng)結(jié)束后，取適量收集菌體，加入Lysis Buffer緩沖液重懸菌體，超聲波破碎菌體，4°C 12000g離心30min，取上清，即得所述角蛋白酶粗液。
[0026] 實施例2 1) 準備實施例2所得的序列SEQ ID N0. 2 ; 2)將SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列克隆到pET28a載體上； 3) 將步驟2)所得物轉(zhuǎn)化入A coB (DE3)工程菌上； 4)將步驟3)所得物，在含Kan抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，225 rpm，震蕩培養(yǎng) 至0D6。。0.6~0.8,加入0.5mmol/LIPTG，37°C，225 rpm，培養(yǎng)6小時。取 lml 菌液12000 rmp離心2min收集菌體，加入5ml Lysis Buffer緩沖液充分混勾，超聲波破碎細菌，4°C 12000g離心30min，取上清，即得所述角蛋白酶粗液。
[0027] 實施例3 將實施例2所得角蛋白酶進行pH穩(wěn)定性和適應溫度范圍檢測，檢測結(jié)果如圖1和圖2 所示。
[0028] 實施例4 將實施例2所得角蛋白酶用于羽毛粉的處理，處理后，羽毛降解效果圖如圖3所示。其 中對照組的處理方式為：對照組以50mM，pH 8. 5的Tris-HCl緩沖液代替酶液，與實驗組在 相同條件下孵育羽毛。
【主權(quán)項】
1. 一種角蛋白酶，其特征在于，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示或在 SEQ ID NO. 1的基礎(chǔ)上進行缺失、突變、重組獲得的具有角蛋白酶活性的氨基酸序列。2. 編碼權(quán)利要求1所述角蛋白酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示或在SEQ ID NO. 2的基礎(chǔ)上進行缺失、突變、重組而獲得的能表達所述角蛋白 酶的核苷酸序列。3. 權(quán)利要求1所述角蛋白酶的制備方法，其特征在于，所述方法包括步驟： 1) 利用PCR獲得SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列； 2) 將SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列克隆到原核表達載體上； 3) 將步驟2)所得物轉(zhuǎn)化入基因工程菌上； 4) 將步驟3)所得物進行誘導培養(yǎng)，即得所述角蛋白酶粗液。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述原核表達載體為pET28a。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟3)所述基因工程菌為大腸桿菌 (a (DE3 )表達菌株。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟4)所述誘導培養(yǎng)為：在含Kan 抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，225 rpm，震蕩培養(yǎng)至0D600 0.6~0.8,加入0.5 mmol/L IPTG，37°C，225rpm，培養(yǎng)6小時；取I ml菌液12000 rmp離心2 min收集菌體，加入5 ml Lysis Buffer緩沖液充分混勻，超聲波破碎細菌，4°C 12000g離心30 min，取上清。7. 權(quán)利要求1所述角蛋白酶在處理含角蛋白物質(zhì)的處理上的應用，所述含角蛋白物質(zhì) 包括羽毛。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種角蛋白酶，該角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示或在SEQ？ID？NO.1的基礎(chǔ)上進行缺失、突變、重組獲得的具有角蛋白酶活性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼所述角蛋白酶的基因，該基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示或在SEQ？ID？NO.2的基礎(chǔ)上進行缺失、突變、重組而獲得的能表達所述角蛋白酶的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了制備所述角蛋白酶的方法。本發(fā)明提供的角蛋白酶不僅具有非常有效的降解角蛋白底物的能力，其比活力高達92.55KU/mg，且能在pH為4.0-11.0以及溫度為45-95℃時保持良好的活性，能很好的水解羽毛粉等角蛋白底物，具有良好的市場應用前景。
【IPC分類】C12P21/06, C12N15/70, C12N15/57, C12N9/52
【公開號】CN105132396
【申請?zhí)枴緾N201510575220
【發(fā)明人】黃艷, 鄧宇, 馬詩淳, 陳璐, 周正, 尹小波
【申請人】農(nóng)業(yè)部沼氣科學研究所
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年9月11日