3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶及 其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物萜類(lèi)的生物合成途徑有兩條：甲戊二羥酸途徑甲戊二羥酸途徑（mevalonic pathway，MVA)和脫氧木糖磷酸酯途徑（l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway，DXP) 〇 MVA途徑位于細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，萜類(lèi)化合物主要是以MVA途徑在細(xì)胞質(zhì)中合成。3-羥 基-3-甲基戊二酰輔酶 A 還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl_CoA reductase，HMGR)催 化HMG-CoA形成甲輕戊酸（mevalonate，MVA)，MVA的生成是一個(gè)不可逆的過(guò)程，所以3-輕 基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶被認(rèn)為是MVA途徑中的限速酶。
[0003] 萜類(lèi)化合物廣泛存在于高等動(dòng)、植物及真核生物體內(nèi)。它是由三十個(gè)碳結(jié)合成六 角形或五角形的天然有機(jī)化合物的總稱(chēng)。其在醫(yī)療衛(wèi)生、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、能源等領(lǐng)域均有重要 作用。研究發(fā)現(xiàn)，三萜類(lèi)化合物具有多種生物活性，包括調(diào)節(jié)免疫、抑制血管新生、抗腫瘤、 抗炎癥、抗氧化等。
[0004] 藥理研究表明，三萜類(lèi)化合物是極具開(kāi)發(fā)潛力的天然資源，如從紅豆杉中發(fā)現(xiàn)的 紫杉醇可用于腫瘤的治療，來(lái)自于黃花蒿的青蒿素是治療瘧疾的特效藥，丹參酮對(duì)心血管 系統(tǒng)疾病有良好的療效并被制成多個(gè)劑型供臨床使用，大戟屬植物中的松香烷內(nèi)酯型成分 具有抗炎抗腫瘤和致炎致癌的雙重生理活性等。
[0005] 目前，隨著應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，三萜類(lèi)化合物需求量急劇上升；但植物中三萜類(lèi) 化合物含量較低，化學(xué)合成雖然條件成熟，但由此產(chǎn)生的活性成分含量和質(zhì)量極不穩(wěn)定?，F(xiàn) 代生物工程與生物技術(shù)的發(fā)展，使得多種三萜類(lèi)化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因被克隆、 分離、鑒定，為通過(guò)DNA重組技術(shù)和遺傳工程調(diào)控生產(chǎn)三萜類(lèi)化合物提供了新途徑。
[0006] 灰樹(shù)花是食、藥兼用蕈菌，其屬于非褶菌目、多孔菌科、樹(shù)花屬，含有多種功能性成 分，如多糖、萜類(lèi)、氨基酸等，具有良好的防癌抗癌、抗衰老、抗病毒等功能，目前，以擬南芥、 煙草、辣椒、穿心蓮、人參、鐵皮石斛、靈芝中已克隆得到3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原 酶基因，但未見(jiàn)以灰樹(shù)花為材料克隆3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶及其編碼基因和應(yīng)用，該 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶可顯著提高植物三萜類(lèi)化合物的合成量。
[0008] -種3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，氨基酸序列如SEQ ID N0. 6所示。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種編碼所述的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的基因。
[0010] 優(yōu)選地，所述基因的堿基序列如SEQ ID N0. 5所示。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種包含所述的基因的表達(dá)盒。
[0012] 本發(fā)明又提供了一種包含所述的基因的重組載體。所述的重組載體的原始載體為 pGEM-T 或 pCAMBIA1302。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種包含所述的基因的轉(zhuǎn)化子。宿主為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì) 胞或樟芝菌絲體細(xì)胞。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種所述的轉(zhuǎn)化子在生產(chǎn)三萜類(lèi)化合物中的應(yīng)用。作為優(yōu)選，所 述三萜類(lèi)化合物為樟芝三萜。
[0015] 本發(fā)明所述的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因可提高植物中三萜的合 成量，提高植物的抗病性和抗逆性，可應(yīng)用于植物基因工程，制備轉(zhuǎn)基因植物品種、轉(zhuǎn)基因 食用真菌品種，如：轉(zhuǎn)基因水稻、擬南芥、人參、靈芝等植物和食用真菌。
[0016] 本發(fā)明通過(guò)提取灰樹(shù)花子實(shí)體的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后構(gòu)建cDNA文庫(kù)，二代測(cè)序數(shù)據(jù) 分析發(fā)現(xiàn)了一個(gè)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆了灰樹(shù)花的 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（Gfhg)，得到了 3669bp的完整基因序列；構(gòu)建了 真核表達(dá)載體pCAMBIA1302-Gfhg-hyg轉(zhuǎn)化樟芝菌絲體表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)克隆的Gfhg基因功能 進(jìn)行了驗(yàn)證，Gfhg基因能夠在樟芝菌絲體中正常表達(dá)，產(chǎn)生樟芝三萜及其衍生物。灰樹(shù)花 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（Gfhg)能夠提高樟芝菌絲體中樟芝三萜的含量 以及下游次級(jí)代謝產(chǎn)物，使植物產(chǎn)生或提高三萜的含量、提高植物的抗病性。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為本發(fā)明pGEM-T-Gfhg載體的示意圖；
[0018] 圖2為本發(fā)明pCAMBIA1302-Gfhg-hyg載體的示意圖；
[0019] 圖3為本發(fā)明pCAMBIA1302-Gfhg-hyg載體的酶切結(jié)果；
[0020] 左為 DNA ladder (碧云天，D0107)，右為 pCAMBIA1302-Gfhg-hyg 載體酶切結(jié)果；
[0021] 圖4為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因樟芝子實(shí)體陽(yáng)性克隆的PCR檢測(cè)結(jié)果；
[0022] M為DNA Marker III (TIANGEN)，1-7為轉(zhuǎn)基因樟芝子實(shí)體陽(yáng)性克隆，CK為未轉(zhuǎn)基 因?qū)φ眨?br>[0023] 圖5為本發(fā)明樟芝菌絲體對(duì)照及轉(zhuǎn)基因克隆中、其他物種中3-羥基-3-甲基戊二 酰輔酶A還原酶活性檢測(cè)結(jié)果；
[0024] 從左至右分別為未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?、轉(zhuǎn)基因樟芝菌絲體、靈芝、煙草、人參、擬南芥中 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的活性測(cè)定結(jié)果。
[0025] 圖6為本發(fā)明樟芝菌絲體對(duì)照及轉(zhuǎn)基因克隆中樟芝三萜的含量檢測(cè)結(jié)果；
[0026]CK 1、CK2為未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩姓林ト频暮浚?、2、4、5、6、7為轉(zhuǎn)基因PCR陽(yáng)性克隆 中樟芝三萜的含量。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件以及手冊(cè)中所述的條 件，或按照制造廠商所建議的條件；所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得 到。
[0028] 實(shí)施例1灰樹(shù)花總RNA的抽提
[0029] 抽提步驟如下：
[0030] (1)樣品的裂解：取灰樹(shù)花子實(shí)體50~100mg置于研缽中，加入液氮快速研成粉 末，移入已經(jīng)加入lml Trizol的離心管中，用移液器吹打混勻；
[0031] (2)室溫靜置 5min，4°C，12000rpm 離心 lOmin ;
[0032] (3)將上清液移入另一離心管中，加入200 yL氯仿，顛倒混勻，室溫放置lOmin， 4°C，12000rpm 離心 15min ;
[0033] (4)轉(zhuǎn)移上層水相，將其移至另一離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置 5 ~lOmin ;
[0034](5) 4°C，12000rpm離心 lOmin，棄上清；
[0035](6)加入500 y L的75%乙醇，混勾片刻后，4°C，7500rpm，離心5min，小心棄上清；
[0036] (7)室溫靜置lOmin左右，干燥RNA沉淀，加入適量無(wú)RNase的水溶解，電泳檢測(cè) RNA質(zhì)量。
[0037] 實(shí)施例2灰樹(shù)花的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（Gfhg)的克隆
[0038]取 1 y g總 RNA，以random hexamers為引物，按照 Superscript III First-Strand Synthesis System說(shuō)明操作，反轉(zhuǎn)錄生成第一鏈。
[0039] 根據(jù)灰樹(shù)花3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因⑶S序列設(shè)計(jì)引物如下：
[0040]上游引物 SEQ ID NO. lGfhg-F :ga aga tct atg cgt gcg ata ctt cgc ccg c ; [0041]下游引物 SEQ ID NO. 2Gfhg_R :cc cac gtg tea ctt cgt etc cac age ata gc ;
[0042] 取灰樹(shù)花總RNA反轉(zhuǎn)錄生成的第一鏈cDNA為模板做PCR擴(kuò)增。
[0043] PCR反應(yīng)體系如下：
[0044]
[0045] PCR擴(kuò)增程序如下：
[0046]
[0047] 參考Quick Gel Extraction Kit (康為世紀(jì)）說(shuō)明書(shū)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。
[0048] 實(shí)施例3克隆載體pGEM-T-Gfhg的構(gòu)建
[0049]參考 pGEM-T Vector Systems (Promega)，米用試劑盒中的 T4 DNA Ligase 將切膠 回收的Gfhg基因片段（SEQ ID NO. 5)與T載體連接起來(lái)。
[0050] 參考pGEM-T Vector Systems (Promega)說(shuō)明書(shū)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 a大腸桿菌 感受態(tài)細(xì)胞。在轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中加入400 y L LB液體培養(yǎng)基，37°C，200rpm搖床培養(yǎng)2h后，均勻 涂布于含X-Gal，IPTG，AMP的LB固體培養(yǎng)皿上，正置lh晾干，37°C倒置培養(yǎng)28-24h形成單 菌落。
[0051] 以上述引物Gfhg-F和Gfhg-R對(duì)10個(gè)單克隆進(jìn)行PCR鑒定，PCR條件：93°C，3min ; 93°C，30s ;56°C，30s ;72°C，3min，30 個(gè)循環(huán)；72°C，10min。PCR 產(chǎn)物電泳驗(yàn)證，選擇電泳條 帶正確的克隆送上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與灰樹(shù)花二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)， 克隆載體圖譜見(jiàn)圖1。
[0052] 實(shí)施例4真菌表達(dá)載體pCAMBIA1302-Gfhg_hyg的構(gòu)建
[0053] 將克隆載體pGEM-T-Gfhg和pCAMBIA1302真菌表達(dá)空載體，用Bgl II，Pml I (Promega)分別酶切，真核表達(dá)載體圖譜見(jiàn)圖2。
[0054] 其反應(yīng)體系為：
[0055]
[0056] 37°C 溫浴 3h。
[0057] 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶后，參考瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Invitrogen) 說(shuō)明書(shū)對(duì)Gfhg片段和pCAMBIA1302真菌表達(dá)空載體進(jìn)行回收，參考T4連接酶反應(yīng)試劑 盒說(shuō)明書(shū)（takara)對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ecoli DH5a，涂布于含卡那霉素 50mg/mL的LB平板。挑選單克隆，于5mL含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm振 蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將菌液倒入1. 5mL的EP管中，12000rpm離心lmin，收集菌體，用于質(zhì)粒抽提， 參考柱式質(zhì)粒小量提取試劑盒（Invitrogen)說(shuō)明書(shū)抽提質(zhì)粒。以質(zhì)粒為模板，以Gfhg基 因上下游引物Gf-F和Gf-R進(jìn)行PCR反應(yīng)，以檢驗(yàn)表達(dá)載體pCAMBIA1302-Gfhg-hyg是否構(gòu) 建成功。
[0058] PCR反應(yīng)體系如下：
[0059]
[0060] PCR擴(kuò)增程序如下：
[0061]
[0062] PCR產(chǎn)物進(jìn)行