一種提高豆粨降解效率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高豆栢降解效率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豆柏是大豆提取豆油后得到的一種副產(chǎn)品，是棉籽柏、花生柏、菜籽柏等動(dòng)植物油 柏飼料產(chǎn)品中產(chǎn)量最大，用途最廣的一種。作為一種高蛋白質(zhì)，豆柏是制作牲畜與家禽飼料 的主要原料，大約85%的豆柏被用于家禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的飼料。
[0003] 但消化酶系統(tǒng)尚未發(fā)育完全的幼畜（特別是對(duì)于早期斷奶的動(dòng)物）會(huì)對(duì)豆栢中 存在的抗?fàn)I養(yǎng)因子產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，對(duì)以豆栢作為植物蛋白來(lái)源的飼料消化能力較弱。而營(yíng) 養(yǎng)拮抗因子的存在也是影響大豆蛋白源在飼料中使用的主要因素。而大豆肽中富含許多 小肽，能直接被動(dòng)物吸收，而且大豆肽抗原性較低，幼畜使用后發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)的概率大大降 低。研究表明在早期斷奶子豬飼料中添加大豆肽作為血漿蛋白粉的替代品，其日均增質(zhì)量 率、餌料系數(shù)、特定生長(zhǎng)率等無(wú)顯著性差異。但目前使豆柏降解為易吸收的小肽的過(guò)程中還 存在水解效率較低的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種提高豆栢降解效率的方法，有效的提供豆栢的酶解效 率。
[0005] 為了提高堿性蛋白酶對(duì)豆栢的降解效率（以水解度作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)），申請(qǐng)人對(duì)堿 性蛋白酶的序列進(jìn)行改造，獲得了能高效降解豆栢為多肽的堿性蛋白酶，該堿性蛋白酶的 氨基酸序列為SEQ ID N0:4,其一種編碼基因的序列為SEQ ID N0:3。
[0006] 本發(fā)明還提供一種重組的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，是將攜帶有上述 編碼基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后制備的；
[0007] 另一方面，申請(qǐng)人用該重組的枯草芽孢桿菌來(lái)發(fā)酵豆栢。
[0008] 本發(fā)明使用優(yōu)化后的堿性蛋白酶來(lái)制備重組枯草芽孢桿菌，從而再更短的時(shí)間內(nèi) 對(duì)豆栢發(fā)酵完全，從而有效的提高了發(fā)酵效率，節(jié)省了成本。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 本發(fā)明所述的蛋白水解度（Degreeofhydrolysis, DH)是指蛋白質(zhì)中的肽鍵被水 解的百分?jǐn)?shù)，其計(jì)算公式如下：
[0010] DH%= h/htotx100 %
[0011] h是蛋白質(zhì)水解后每克蛋白中被裂解的妝鍵的暈?zāi)枖?shù)（mmlo/g蛋白質(zhì)）、
[0012] htat，以酪蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，其值為8. 2mmlo/g蛋白質(zhì)；
[0013] 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的肽鍵全部被水解生成游離的氨基酸時(shí)，則水解度為100% ;沒(méi)有被水解 時(shí)，其水解度為0。由于蛋白質(zhì)水解時(shí)每裂解一個(gè)肽鍵就新生成一個(gè)_NH2和一個(gè)-C00H基， 因此，在測(cè)定蛋白質(zhì)的水解度時(shí)，只要定量的測(cè)定新生成的的_順2和-C00H基量就可以計(jì) 算h值；這樣就可以算出蛋白質(zhì)的水解度來(lái)。
[0014] 本發(fā)明采用甲醛固定法來(lái)測(cè)定h值（中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)甲醛值法 GB12143. 2-89)〇
[0015] 下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說(shuō)明，實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克（Sambrook)等編寫(xiě)的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所 述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。
[0016] 實(shí)施例1堿性蛋白酶的優(yōu)化
[0017] 1、利用易錯(cuò)PCR的技術(shù)在體外向核苷酸序列為SEQIDNO: 1的堿性蛋白酶基因 (編碼的成熟肽氨基酸序列為SEQIDN0:2)中引入核苷酸突變，易錯(cuò)PCR的體系如下：
[0018] 10XPCR Buffer (不含 MgCI2)5yL，dCTP(25mmol/L)2yL，d!TP(25mmol/L)2yL， dGTP(10mmol/L) 1 y L, dATP (lOmmol/L) 1 y L, F (lOpmol/y L) 1 y L, R (lOpmol/y L) 1 yL, Mg2+ (20mM) 14 y L，Mn2+ (3mM) 1. 5 y L，pQC670. 5 y L，Taq DNA polymerase (2. 5U) 1 y L，ddH20 20 y L〇
[0019] ：5r -tagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaat-3'
[0020] 下游引物：5' -atttttcttttgcttcttcagcagccgatgcgatcgatgaacta-3'；
[0021] 擴(kuò)增條件為：94°C lOmin ;94°C 60s，58°C 60s，72°C 2min，30 個(gè)循環(huán)；72°C 10min。 利用Gel Extraction Kit回收突變體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0022] 2、擴(kuò)增得到的突變產(chǎn)物與表達(dá)載體連接 [0023] 以PQC67質(zhì)粒為模板，利用
[0024] 上游引物：tgcagaagcggcaacacgctaaattaagcatgcaagctagttgc
[0025] 和下游引物 atttttcttttgcttcttcagcagccgatgcgatcgatgaacta 作為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，獲得載體基因序列。擴(kuò)增條件為：98°C lOmin ;98°C 10s，55°C 20s，72°C 3min，30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin。利用Gel Extraction Kit回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0026] 將回收的突變體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體片段通過(guò)重疊延伸PCR形成多聚體，擴(kuò)增體 系如下：5XPhusionHFBuffer10iiL，2.5mMdNTPs8tiL，Insertgene(aprE片段）4uL， Linearizedvector(pQC67)6iiL，PhusionDNAPolymeraselyL，ddH20 21yL。擴(kuò)增條件 為98。(：1〇1^11;98。(：1〇8,721€3111111，20個(gè)循環(huán) ；98。(：1〇8,721€6111111，15個(gè)循環(huán)；72。(：1〇111111。
[0027] 將多聚體轉(zhuǎn)化Bacillus subtilis 1A751宿主菌，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，即為能表達(dá)堿 性蛋白酶突變體的重組菌株（實(shí)驗(yàn)菌株）。同時(shí)以序列為SEQ ID N0:2的堿性蛋白酶基因 (野生型）構(gòu)建后作為對(duì)照菌株。
[0028] 3、堿性蛋白酶突變體的篩選
[0029]無(wú)菌條件下將步驟2中獲得的重組菌株分別接種于加入50mL培養(yǎng)基試管中（種 子培養(yǎng)基的組成為〇. 5 %的酵母粉，1 %胰蛋白胨，1 %葡萄糖，1. 8 % K2HP04，麥芽糊精5~ 10 %，檸檬酸鈉 〇? 1 ~〇? 5 %，CaCl20.1 ~0? 5 %，MgS040. 1 ~0? 5 %，K2HP040.5 ~2 % ) 中，34°(：、210印111振蕩培養(yǎng)811;然后再加入3〇1111濃度為12%的大豆分離蛋白容易（5?1溶 液），于34°C、250rpm振蕩培養(yǎng)36h ;然后進(jìn)行離心，獲得的上清液測(cè)定水解度值DH，從而篩 選出對(duì)大豆蛋白粉降解能力增強(qiáng)的重組菌株。最終篩選出2個(gè)對(duì)大豆蛋白粉降解能力明 顯增強(qiáng)的重組菌株（相比于對(duì)照株，），命名為8 &以111^-&和8&(^111^-13，其中重組菌株 Bacillus-a的DH值為12、重組菌株Bacillus-b的DH值為17,而對(duì)照菌株的DH值為8。 但絕大部分的重組菌株與對(duì)照菌株的水解度沒(méi)有差別，且有的重組菌株的DH值比對(duì)照菌 株降低；重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也相同。
[0030] 實(shí)施例2篩選出的菌株中堿性蛋白酶序列的確定
[0031] 利用質(zhì)粒提取試劑盒分別提取Bacillus - a和Bacillus - b菌株中的質(zhì)粒；由上 海生工公司對(duì)上述質(zhì)粒分別進(jìn)行基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示：Bacillus - a菌株中的質(zhì)粒攜 帶的堿性蛋白酶基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:3,其編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0:4， 命名為Ba-enzyme ;枯草芽孢桿菌Bacillus - b中的質(zhì)粒攜帶的堿性蛋白酶基因的核苷酸 序列為3￡〇10勵(lì):5，其編碼的氨基酸序列為3￡〇10勵(lì):6，命名為他-61^ 71116。對(duì)序列比 較發(fā)現(xiàn)，Bacillus-a獲得的堿性蛋白酶Ba-enzyme的氨基酸序列（SEQ ID N0:4)與野生 型的堿性蛋白酶SEQ ID N0:2相比，第41位氨基酸由Leu突變?yōu)镾er，第101位氨基酸由 Ser突變?yōu)長(zhǎng)eu ;第201位氨基酸由Ser突變?yōu)锳SN。而B(niǎo)b-enzyme的氨基酸序列（SEQ ID N0:6)與野生型的堿性蛋白酶SEQ ID N0:2相比，第65位氨基酸由His突變?yōu)長(zhǎng)eu，第125 位氨基酸由Gly突變?yōu)閂al，第148位氨基酸由Val突變?yōu)長(zhǎng)eu ;第205位氨基酸由Gly突 變?yōu)閂al。
[0032] 同時(shí)，申請(qǐng)人也與對(duì)照菌株的水解度沒(méi)有差別，以及比對(duì)照菌株降低的重組菌株 中的堿性蛋白酶的序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中有些菌株的堿性蛋白酶與原始的堿性蛋 白酶序列相比也存在一個(gè)或多個(gè)氨基酸的突變。
[0033] 實(shí)施例3 :Ba_enzyme、Bb-enzyme酶重組表達(dá)后酶學(xué)性質(zhì)分析
[0034] 將攜帶能Ba-enzyme、Bb-enzyme菌株，以及對(duì)照菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化后獲得 Ba-enzyme和Bb-enzyme，以及對(duì)照組的重組堿性蛋白酶，按照如下的方法進(jìn)行水解度檢 測(cè)：
[0035] 配制濃度為4% (w/v)的SPI溶液各200mL于50°C預(yù)處理lOmin，在50°C、pH10. 0 條件下加入Ba-enzyme、Bb-enzyme和對(duì)照的原始?jí)A性蛋白酶各5g進(jìn)行酶解，酶解40min進(jìn) 行水解度的測(cè)定，設(shè)置3個(gè)平行樣，取平均值。結(jié)果表明，對(duì)照的原始?jí)A性蛋白酶的DH值為 14, Ba-enzyme的DH值為22,而B(niǎo)b-enzyme的DH值為26,表明突變的酶比原始酶具有更好 的效果。
[0036] 同時(shí)對(duì)Ba-enzyme、Bb-enzyme的酶活進(jìn)行了測(cè)定，采用中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 蛋白酶制劑測(cè)定方法（GB/T 25327-2009)。運(yùn)用福林法測(cè)定蛋白酶的活力，使用到的溶液 包括：福林使用溶液（一份市售福林溶液與兩份水混合，搖勻），碳酸鈉溶液（42. 4g/L)，三 氯乙酸（65. 4g/L)，梯度pH值緩沖液，酪蛋白溶液（10.0 g/L)。反應(yīng)過(guò)程如下：試管中加入 lmL酶液，40°C溫浴2min，加入酪蛋白溶液lmL，搖勻后40°C溫浴lOmin，加入2mL三氯乙酸 溶液，搖勻（空白對(duì)照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液）。取出靜止lOmin，慢速定性 濾紙過(guò)濾。取lmL濾液，加碳酸鈉溶液5mL，加福林試劑使用溶液lmL，40°C顯色20min，于 680nm波長(zhǎng)，用10mm比色皿測(cè)定吸光度。結(jié)果表明Bb-enzyme的酶活高于Ba-enzyme，與水 解度的結(jié)果一致。
[0037] 將Ba-enzyme和Bb-enzyme菌株來(lái)發(fā)酵豆栢，豆柏粉碎至40目以下，豆柏和水按 1 :1. 5的比例混合，然后在混合物中接種菌株，在35°C的條件下發(fā)酵36小時(shí)，同時(shí)用陽(yáng)性對(duì) 照株接種進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵后檢測(cè)粗蛋白、三氯乙酸可溶性氮（TCA-NSI)含量、胰蛋白酶抑制 因子和尿素酶活性。結(jié)果表明，相比于陽(yáng)性對(duì)照菌，Ba-enzyme和Bb-enzyme菌株可以在更 短的時(shí)間內(nèi)使發(fā)酵豆栢達(dá)到作為飼料添加劑的使用要求，從而有效的節(jié)省了成本，發(fā)酵后 產(chǎn)物用于制備飼料組分。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種堿性蛋白酶，其特征在于，所述的堿性蛋白酶包含有： 1) 氨基酸序列為SEQ ID NO:4的堿性蛋白酶； 2) 與1)的堿性蛋白酶具有95%或以上同源性，且具有堿性蛋白酶活性的蛋白酶。2. -種基因，其特征在于，所述的基因編碼權(quán)利要求1所述的堿性蛋白酶。3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的序列為SEQ ID N0:3。4. 一種重組枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，是將攜帶有權(quán)利要求2所述的基因 的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后制備的。5. -種豆栢的發(fā)酵方法，其特征在于，所述的發(fā)酵方法是用權(quán)利要求4所述的重組枯 草芽孢桿菌來(lái)發(fā)酵的。
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種提高豆粨降解效率的方法，有效的提供豆粨的酶解效率。為了提高堿性蛋白酶對(duì)豆粨的降解效率，提供一種能高效降解豆粨為多肽的堿性蛋白酶，該堿性蛋白酶的氨基酸序列為SEQ？ID？NO:4，其一種編碼基因的序列為SEQ？ID？NO:3。本發(fā)明使用優(yōu)化后的堿性蛋白酶來(lái)制備重組枯草芽孢桿菌，從而再更短的時(shí)間內(nèi)對(duì)豆粨發(fā)酵完全，從而有效的提高了發(fā)酵效率，節(jié)省了成本。
【IPC分類】A23K1/16, C12N15/57, C12N9/54, C12N15/75, C12R1/125, C12N1/21
【公開(kāi)號(hào)】CN105132397
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510555686
【發(fā)明人】孫翠言, 張培, 類延樂(lè)
【申請(qǐng)人】孫翠言
【公開(kāi)日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年9月5日