專利名稱：鹽藻26S蛋白酶體亞基RPN10基因的cDNA序列、其編碼蛋白及其全長基因序列和克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鹽藻("w朋/zW/" v/nVfo)中26S蛋白酶體亞基RPN10基因 (Z)v及P;WO)的cDNA序列、其編碼蛋白以及全長基因序列和克隆方法。
背景技術(shù)：
鹽藻，又叫杜氏藻，它是一種無細(xì)胞壁的單細(xì)胞真核綠藻，是已知的最耐鹽的真 核生物。同時(shí)，它對(duì)光照、環(huán)境pH、溫度等變化造成的脅迫也能夠很好的耐受。因 而被廣泛的用來研究植物對(duì)各種脅迫的反應(yīng)機(jī)制，特別是耐鹽脅迫的機(jī)制。
泛素/26S蛋白酶體蛋白質(zhì)降解途徑(ubiquitin/26S proteasome pathway)是真核細(xì) 胞中蛋白質(zhì)的選擇性降解中一種非常重要的機(jī)制。因其高效的降解細(xì)胞內(nèi)蛋白的能 力，參與了真核細(xì)胞調(diào)控的各個(gè)方面。在眾多26S蛋白酶體亞基中，研究最多就要數(shù) RPN10 了。最初，人們被發(fā)現(xiàn)它在體內(nèi)能夠與多聚泛素鏈結(jié)合。并且由于其特異地 識(shí)別與那些結(jié)合有泛素鏈的蛋白，它被認(rèn)為是26S蛋白酶體中主要的泛素蛋白受體。 但是后來證明酵母^r;w/0菌株仍然可以正常生長，只不過對(duì)氨基酸類似物比較敏感， 這就說明RPN10并不是泛素/26S蛋白酶體途徑中唯一的泛素受體且在蛋白降解的過 程中起到了加強(qiáng)底物特異性的作用。研究發(fā)現(xiàn)在其C末端附近有一段疏水區(qū)域能與 泛素結(jié)合被稱為泛素互作基序(UIM)。出乎人們的意料之外，在氨基酸類似物脅迫 實(shí)驗(yàn)中，這段結(jié)構(gòu)域的缺失并未對(duì)酵母的生長產(chǎn)生影響，說明存在其他的結(jié)構(gòu)域參與 識(shí)別泛素鏈的功能。在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，RPN10在ABA信號(hào)傳導(dǎo)中起到底物特 異性的功能。
此外，RPN10還參與了26S蛋白酶體調(diào)控區(qū)域的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。在酵母的研究中， RPN10的突變使得蛋白酶體的蓋部和基底部在體內(nèi)易于解離。這說明RPN10參與了 兩個(gè)亞基符合體的聯(lián)接。研究發(fā)現(xiàn)RPN10的N末端存在一個(gè)在位置上保守的天冬氨 酸(Asp-ll)對(duì)蛋白酶體的穩(wěn)定起到了關(guān)鍵的作用。該氨基酸位于N端與保守結(jié)構(gòu)域 von Willebrand factor A相關(guān)的150個(gè)氨基酸區(qū)域內(nèi)。von Willebrand factor A結(jié)構(gòu)域可 能也有助于蓋部和基底部的聯(lián)接。
另外，RPN10的功能還可能與其能夠結(jié)合一系列蛋白有關(guān)，包括DSK2和DNA 修復(fù)蛋白R(shí)AD23等。這些蛋白的特征是具有UBL結(jié)構(gòu)域的N末端和泛素結(jié)合結(jié)構(gòu) 域的C末端。由于UIM和UBI結(jié)構(gòu)域的相互作用，RPN10可能與RAD23/DSK2結(jié) 合，參與引導(dǎo)泛素化底物進(jìn)入26S蛋白酶體。
許多研究表明泛素/26S蛋白酶體途徑參與了多種環(huán)境脅迫和激素的應(yīng)答。比如， 在擬南芥的研究中，Smalle等發(fā)現(xiàn)RPN12與細(xì)胞分裂數(shù)的生長應(yīng)答有關(guān)，參與了穩(wěn) 定了一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞分裂素調(diào)控因子；而RPN10可能參與了底物專一性功能，在調(diào) 節(jié)脫落酸信號(hào)傳到的過程中起到了十分重要的作用。此夕卜，RPN10還是P/^cwm'加/to 生長發(fā)育所必須的。在鹽藻和水稻的蛋白組學(xué)的研究中人們發(fā)現(xiàn)在高滲的環(huán) 境下，26S蛋白酶體調(diào)控亞基的表達(dá)有所上調(diào)，這就說明蛋白酶體調(diào)控體系在調(diào)節(jié)滲 透脅迫信號(hào)傳到的過程中起重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供鹽藻26S蛋白酶體亞基RPN10基因(Dv及尸A70) 全長編碼區(qū)序列。
本發(fā)明的目的之二在于提供該序列編碼的氨基酸序列。
本發(fā)明的目的之三在于提供鹽藻26S蛋白酶體亞基RPN10基因(DW 尸JWO) 的全長基因序列。
本發(fā)明的目的之四在于提供該Dv及PiWO基因的克隆方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種鹽藻26S蛋白酶體亞基RPN10基因的cDNA序列，其特征在于該序列具
有SEQ NO 1所示的堿基序列。
上述的cDNA序列編碼的蛋白，其特征在于具有SEQ NO 2所示的氨基酸序列。
一種鹽藻26S蛋白酶體亞基RPN10基因的全長基因序列，其特征在于具有SEQ NO
3所示的堿基序列。
上述的鹽藻26S蛋白酶體亞基RPN10基因的全長基因序列的克隆方法，其特征在 于該方法具有如下步驟
a. 利用限制性內(nèi)切酶I/ATzo I消化含有Dv及PA^0的鹽藻EST文庫質(zhì)粒釋放 出目的片段，獲得26S蛋白酶體亞基RPN10基因全長cDNA序列；
b. 根據(jù)上述的cDNA序列設(shè)計(jì)引物篩選藻基因組BAC文庫，得到鹽藻26S蛋白
酶體亞基RPN10基因的基因組BAC克隆，利用QIAGEN公司的 Large-Construct Kit抽提無大腸桿菌基因組污染的BAC質(zhì)粒，回收的DNA經(jīng) 機(jī)械破碎后，回收大小在2 4kb的DNA片段，連接到pUC18載體，構(gòu)建鳥槍 文庫；所述的引物序列為
RPN10P4a: 5' ACATCGAGGGCGAGTCCAAC 3' RP畫P4b: 5' TGTGCAGCAGTGCATAAGAGC 3'
c. 大通量提取鳥槍文庫的質(zhì)粒DNA，在MegaBACE 4500上進(jìn)行序列的測定；
每個(gè)鳥槍質(zhì)粒利用M13正反向引物，進(jìn)行雙向測序。共測序480個(gè)鳥槍文庫 質(zhì)粒，即5塊96孔板
d. 將上述的480個(gè)鳥槍文庫質(zhì)粒的原始數(shù)據(jù)輸入在RedHat Linux平臺(tái)的并聯(lián)計(jì)
算機(jī)群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所測序列，構(gòu)建亞克隆并測序以 填補(bǔ)出現(xiàn)在序列之中的缺口，得到一段連續(xù)的鹽藻基因組序列；通過與其 cDNA序列的比對(duì)，在該連續(xù)的鹽藻基因組序列中，獲得鹽藻26S蛋白酶體亞 基RPN10基因的全長基因序列。 鹽藻是迄今發(fā)現(xiàn)的最耐鹽的真核生物之一。其極強(qiáng)的耐鹽能力及簡單的細(xì)胞結(jié) 構(gòu)使鹽藻成為研究植物適應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制的重要模式生物。如今鹽脅迫是影響農(nóng) 作物產(chǎn)量的重要因素之一，為了解植物耐鹽機(jī)制，提高作物耐鹽性，對(duì)鹽藻鹽適應(yīng)機(jī) 制的研究已成為目前國際上植物耐鹽研究的一個(gè)熱點(diǎn)。泛素/26S蛋白酶體蛋白質(zhì)降解 途徑是真核細(xì)胞中一種非常重要的選擇性蛋白質(zhì)降解機(jī)制，因其高效的降解細(xì)胞內(nèi)異 常蛋白的能力，參與了真核細(xì)胞調(diào)控的各個(gè)方面。本發(fā)明提供了鹽藻26S蛋白酶體 RPN10亞基完整的編碼序列，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法發(fā)現(xiàn)了鹽藻RPN10 受鹽脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)特性。RPN10在細(xì)胞內(nèi)具有多方面的功能，參與并增加了底物 蛋白的專一性識(shí)別，穩(wěn)定26S蛋白酶體整體結(jié)構(gòu)和結(jié)合泛素化的蛋白。鹽藻細(xì)胞在高 鹽脅迫下產(chǎn)生大量異常蛋白，如果這些蛋白積累過量將會(huì)影響細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。 DW^/W川的上升表達(dá)有助于專一性地識(shí)別這些蛋白，從而降低這些蛋白的胞內(nèi)含量， 維持細(xì)胞正常的生理環(huán)境，對(duì)于鹽藻的抗鹽機(jī)制具有十分重要的意義。因此，本發(fā)明 提供的關(guān)于鹽藻RPN10亞基基因的研究對(duì)揭示鹽藻細(xì)胞內(nèi)泛素/26S蛋白酶體蛋白質(zhì) 降解途徑及其耐鹽機(jī)制，具有一定的理論。此外，本發(fā)明提供了鹽藻26S蛋白酶體 RPN10的基因組序列，為進(jìn)一步研究該基因的表達(dá)調(diào)控并將其用于抗鹽植物的改良
奠定了基礎(chǔ)，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。


圖1為本發(fā)明的鹽藻Dv/ 尸A70基因在酵母力r/7w70突變體中功能互補(bǔ)的結(jié)果。 圖2為生長于不同鹽濃度下，本發(fā)明的鹽藻DW 尸iV70基因轉(zhuǎn)錄水平的實(shí)時(shí)熒光 定量PCR分析結(jié)果
圖3為鹽誘導(dǎo)下，本發(fā)明的鹽藻Dvi 戶A70基因轉(zhuǎn)錄水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析結(jié)果。
圖4為本發(fā)明的鹽藻DW^A70基因的基因結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按 照常規(guī)條件，分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rded.)或植物分子 生物學(xué)一實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Plant Molecular Biology—A Laboratory Manual, Melody S. Clark 編，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述條件，或按照制造廠商所建議的 條件。
實(shí)施例一i)vl PA70全長編碼區(qū)序列的克隆與分析
本實(shí)驗(yàn)所克隆的基因Z)v/ PW川源于鹽藻EST文庫。利用限制性內(nèi)切酶(五coi I/ATw I)消化含有DW 尸A^0的鹽藻EST文庫質(zhì)粒釋放出目的片段并用于以后的實(shí)驗(yàn)。 經(jīng)測序分析，Dvi^iVM最長cDNA片段為1486bp，含有綠藻基因特異的加尾信號(hào) TGTAA及poly(A)結(jié)構(gòu)。Vector NTI軟件的分析結(jié)果顯示，Dv及iW70最長讀碼框編碼 了一個(gè)含377個(gè)氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小為39.4 kDa，等電點(diǎn)是4.43，可見 DW /W^所編碼的蛋白為偏酸性蛋白。
實(shí)施例二 i)v及尸A7fl基因序列的測序及拼接
通過篩選鹽藻BAC文庫，得到含有DW 尸A70基因的BAC克隆。利用QIAGEN 公司的Large-Construct Kit抽提無大腸桿菌基因組污染的BAC質(zhì)粒，回收的DNA經(jīng) 機(jī)械破碎后，回收大小在2 4kb的DNA片段，連接到pUC18載體，構(gòu)建鳥槍文庫。
大通量提取鳥槍文庫的質(zhì)粒DNA，在MegaBACE 4500上進(jìn)行序列的測定。每 個(gè)鳥槍質(zhì)粒利用M13正反向引物，進(jìn)行雙向測序。共測序480個(gè)鳥槍文庫質(zhì)粒，即 5塊96孔板。
在RedHat Linux平臺(tái)的并聯(lián)計(jì)算機(jī)群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所測
序列。構(gòu)建亞克隆并測序以填補(bǔ)出現(xiàn)在序列之中的缺口，最終獲得DW PA7( 全長基 因組序列。通過與其編碼區(qū)序列的比較，得出其基因結(jié)構(gòu)，參見圖4。
實(shí)施例三"vi /WM的功能鑒定
為了鑒定Z)vi 戶A^O的生理功能，本發(fā)明做了以下驗(yàn)證。
將Z)W /W^的全長編碼區(qū)序列連接到酵母表達(dá)載體pAJ401 ，再轉(zhuǎn)化酵母突變體。 由于酵母RPN10基因的突變，使得酵母突變體對(duì)氨基酸類似物敏感，不能在含有 6ug/ml刀豆氮酸(精氨酸類似物)的培養(yǎng)基中生長。但轉(zhuǎn)化DW 尸AA70的酵母突變體 仍然對(duì)刀豆氨酸敏感，參見圖1中的A和B。分析鹽藻編碼序列的密碼子使用頻率， 發(fā)現(xiàn)鹽藻和酵母之間存在巨大的密碼子使用偏好。為了消除或減弱鹽藻基因翻譯過程 中的密碼子偏好，對(duì)酵母tRNA基因進(jìn)行了克隆和修改，將反義密碼子為"CCT"酵 母tRNA (Arg)基因改為"GCG"和"CCG"。
根據(jù)GENEBANK中反義密碼子為"CCT"酵母tRNA (Arg)基因序列設(shè)計(jì)克隆 及修改所需引物
tR(CCU-GCG)J(F)(+): 5' -agtcgacttgatttccatcgtgtaagtttt-3 ， 5""/1 tR(CCU-GCG)J(F)(-): 5，-tctcctt￡g￡agggagacgcgttaccatta-3 ， tR(CCU-GCG)J(L)(+): 5 ， -tctccctg￡gaaggagaagactgcgggttc-3 ， tR(CCU-GCG)J(L)(-): 5'陽agtcgaccaactagttattaccactgtggcac陽3 ， &/1 tR(CCU-CCG)J(F)(+): 5 ， -aeaattcttgatttccatcgtgtaagtttt-3 ， ￡coi I tR(CCU-CCG)J(F)(-): 5 ， -tctcctt￡ggagggagacgcgttaccatta-3 ， tR(CCU-CCG)J(L)(+): 5 ， -tctccct￡￡gaaggagaagactgcgggttc-3 ， tR(CCU-CCG)J(L)(-): 5' -agaattccaactagttattaccactgtggcac-3'五coi I 在兩個(gè)tRNA基因的幫助下，轉(zhuǎn)化了 Z)vi /W70的突變體酵母能夠在有6ug/ml刀 豆氨酸(精氨酸類似物)的培養(yǎng)基中生長，參見圖1中的C和D。這說明1、 Dvi^iVM 能夠部分恢復(fù)酵母突變體的功能缺失。2、經(jīng)修改的兩個(gè)tRNA有助于緩解鹽藻與酵 母的密碼子偏好，在DW 尸A^( 的酵母中表達(dá)起到了十分重要的作用。 實(shí)施例四DW 尸7VM在不同鹽濃度及3M鹽誘導(dǎo)下的表達(dá) 參見圖2，對(duì)于不同穩(wěn)態(tài)鹽濃度下的Z)vi PiV70的研究，我們將鹽藻細(xì)胞在含0.5、 1M、 2M、 3M、 4M和5MNaCl的鹽藻培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在2xl06 cell/ml的時(shí)候收 集細(xì)胞，分別提取鹽藻細(xì)胞總RNA。上述RNA樣品經(jīng)DNaseI消化后，在反轉(zhuǎn)錄酶 的作用下反轉(zhuǎn)成cDNA，稀釋10倍后作為各個(gè)實(shí)驗(yàn)條件的realtime PCR的模板。PCR引物 RPN10P7a: 5，一ACCCTCGTCAAGATAGCCAAGA—3， RP畫P7b: 5，一AGCCGATGAGCACATCAGACAG—3' DvActinRT+: 5'—GCCACTGCTTTAGCTGTTTGC—3' DvActinRT-: 5'—CCTCATGCTCCCAGATGTTCTA—3' Dvi PA70和DMC77iV的文庫質(zhì)粒經(jīng)純化和定量后，按照10倍梯度稀釋作為定 量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，""C77tV的轉(zhuǎn)錄量作為內(nèi)參?；騔)W 戶A^0的轉(zhuǎn)錄變化數(shù)據(jù) 以其在模板中的拷貝數(shù)與Ih^C77iV的拷貝數(shù)的比值來作圖展示。(見圖2)
由于Z^i PW70的轉(zhuǎn)錄在1M-3M的鹽濃度變化中上升了大約3倍，為經(jīng)一步了 解DW 戶iVM受鹽誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄情況，我們對(duì)該基因在高鹽振蕩下的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行了研究。 我們將生長在1MNaCl的鹽藻(2xl06cell/ml)轉(zhuǎn)移至含有3.0MNaCl的新鮮鹽藻培 養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在含有3.0M NaCl的新鮮鹽藻培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)0小時(shí)、12 小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)、和72小時(shí)，然后提取鹽藻細(xì)胞總RNA。 然后以相同的方法檢測i)vi i^V70的轉(zhuǎn)錄變化。(見圖3)
由上述實(shí)驗(yàn)可知，Dvi 尸A^0在0.5M至3M鹽濃度范圍內(nèi)，受鹽誘導(dǎo)表達(dá)，高 鹽濃度下其表達(dá)量約是低鹽濃度下的3倍，且在3M鹽誘導(dǎo)36小時(shí)后其表達(dá)量開始 上升。因此推測其可能參與了鹽藻抗鹽脅迫晚期的某些重要生理活動(dòng)。 序歹U表
<110> 上海大學(xué)
<120>鹽藻26S蛋白酶體亞基RPN10基因的cDNA序列、其編碼蛋白及其全長基因 序列和克隆方法
<160> 3
<210> 1
<211> 1486
<212> DNA
<213> 鹽藻v/Wtfo)
<400> 1
tctctgacaccagctcttaatcaatatgtc卿gtgcgcgatcgtgctaa60
ttgataacagtgagccatgccgcaacggcgactatgtgcccacaaggtacatctcgcaga120
ccgacgcagccaacctgctcgcgggcgcca卿cgcaggcgcaccctgagaacacggtgg180
gCgtgCtg3CC3tggCgggC犯g3tgccgc鄉(xiāng)tgctggtcacgcccacgcaggacctgg240
gtcgcgtgctcsactgcatgaccg3gatcgacatcgagggcgagtccaacttctccgcgg300
cagtccagattgcgcagttggcgctcaagcaccggceigaacaagaaccagcgccagcgcg360
tggtcatcttcgtggccagccccatcaaggagg3c鄉(xiāng)gataccctcgtcasgatagcca420
agaagttgaagaagaacagcgtggctgtgg3CgtggtC3gcttcggctgtgaggctgaca■
gctggccgccttcaacgaggcagtcaac已gcaacaacaacagccatctgg540
tcactgtcccccctggcccagtgctgtctgatgtgctcatcggctcccccatctttcaag600
gcg郷gcggcgacttcggtggcggtggcgctgagggcggagctccctttgagtttggtg660
tggacccc犯catggacccagagctcgcactggcactgcgcgtctccttggaggaggagc720
gcgcacgccagaacaccacggagggcggtgcgcccgccgcaggcgccgaaggcgcgggcc780
ccagtggggctcagcctgcagcaggcgtcgccccagccgcagcatccacaccagctgccg840
cacccgaggctggg卿cctgcgcagccaagcgctgctggtggtggtgagggtatggacc■
ttgatgaggaccagctgctac犯caagcattggcgatgtcgatggaccagccggcaagca960
gcgagcagcagggcggtgggtccacaagcc agggggttagccagcagcagccacagcagc1020
3ggCgC3gC3gC3gC3gC3g C3gC3gC3gC 3gC3gC3gC3 gC3gggCg3C 3gC33C3tgt1080
ttgacaatgtggaggacgag gagctgcgaa aggcgctgag catgagcatg c鄉(xiāng)actcgg1140
caaggactcc agtaaataag ggagcagcag agaagcgtcg eigcttgagga1200
tggaaagtgctcttgcagct caggccaaat ttggcagtgt gaacatggca gaggcgcttg1260
tactagagcatggccgtatg gctgtgtttg tttgttgtgc gcgcatttgt agacccattt1320
gtgcttttgttgtgttagtg gtg3gtgtga CtCC￡LtC￡L￡Lg gtC3gtgCtg tetg3tttC31380
agctgtttagtcacgcactg gcatgactgc tttctgtcta aatcactgta attttgaact1440
ccccaaaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1486
<210> 2 <211> 377 <212> PRT
<213> 鹽藻(D朋of"e〃fl( WnD <400> 2
Met Ser Glu Cys Ala lie Val Leu lie Asp Asn Ser Glu Pro Cys Arg 1 5 10 15
Asn Gly Asp Tyr Val Pro Thr Arg Tyr lie Ser Gin Thr Asp Ala Ala 20 25 30
Asn Leu Leu Ala Gly Ala Lys Thr Gin Ala His Pro Glu Asn Thr Val 35 40 45
Gly Val Leu Thr Met Ala Gly Lys Met Pro Gin Val Leu Val Thr Pro 50 55 60
Thr Gin Asp Leu Gly Arg Val Leu Asn Cys Met Thr Glu lie Asp lie 65 70 75
Glu Gly Glu Ser Asn Phe Ser Ala Ala Val Gin lie Ala Gin Leu Ala 80 85 90 95
Leu Lys His Arg Gin Asn Lys Asn Gin Arg Gin Arg Val Val lie Phe 100 105 110
Val Ala Ser Pro lie Lys Glu Asp Arg Asp Thr Leu Val Lys lie Ala 115 120 125Lys Lys Leu Lys Lys Asn Ser Val Ala Val Asp Val Val Ser Phe Gly 130 135 140
Cys Glu Ala Asp Asn Asp Glu Lys Leu Ala Ala Phe Asn Glu Ala Val 145 150 155
Asn Ser Asn Asn Asn Ser His Leu Val Thr Val Pro Pro Gly Pro Val 160 165 170 175
Leu Ser Asp Val Leu He Gly Ser Pro lie Phe Gin Gly Glu Gly Gly 180 185 190
Asp Phe Gly Gly Gly Gly Ala Glu Gly Gly Ala Pro Phe Glu Phe Gly 195 200 205
Val Asp Pro Asn Met Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ala Leu Arg Val Ser 210 215 220
Leu Glu Glu Glu Arg Ala Arg Gin Asn Thr Thr Glu Gly Gly Ala Pro 225 230 235
Ala Ala Gly Ala Glu Gly Ala Gly Pro Ser Gly Ala Gin Pro Ala Ala 240 245 250 255
Gly Val Ala Pro Ala Ala Ala Ser Thr Pro Ala Ala Ala Pro Glu Ala 260 265 270
Gly Lys Pro Ala Gin Pro Ser Ala Ala Gly Gly Gly Glu Gly Met Asp 275 280 285
Leu Asp Glu Asp Gin Leu Leu Gin Gin Ala Leu Ala Met Ser Met Asp 290 295 300
Gin Pro Ala Ser Ser Glu Gin Gin Gly Gly Gly Ser Thr Ser Gin Gly 305 310 315
Val Ser Gin Gin Gin Pro Gin Gin Gin Ala Gin Gin Gin Gin Gin Gin 320 325 330 335
Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gly Asp Ser Asn Met Phe Asp Asn Val 340 345 350
Glu Asp Glu Glu Leu Arg Lys Ala Leu Ser Met Ser Met Gin Asp Ser 355 360 365
Glu Ala Lys Asp Lys Asp Ser Ser Lys 370 375
<210> 3 <211> 5409 <212> DNA
<213> 鹽藻(￡)w2af//e〃a v/〃Vfo)
<220〉
<221> Exon
<222〉 (557)...(1246)
<220〉
<221〉 Exon
<222〉 (2009)...(2142)
<220>
<221〉 Exon
<222〉 (2700)...(2900)
<220>
<221〉 Exon
<222〉 (3366)...(3781)
<220>
<221〉 Exon
<222〉 (4341)...(4634)
<400> 3
caacactggctgcctactgctggtattgct gtgtgcatgggggtg8gC￡Ltgcacgctgcg60
cggtgggccaaagctgcactgcatggcgga ggg卿ggaggtggaaaeigcagcacagcct120
tgcagagctaatttagtttaaacatttcct atgaagcagcaaactcctccccagcttgaa180
aatcg鄉(xiāng)agcgggcg卿aatgatgtgca caacatcacacgcacgattg240
attctaatagtgcgccgtttcatttgcatc agcagcctggcaggggtctcctgcgacacc300
cgactccccctgtgacttctagcgagcagt gaacttcgag3ga犯ggCC3caatcctttt360
ggtctgtcaagaaCCgg￡L￡L￡Laatagggtgg gggcacggatg組gtgtagctgatgccat420
tgctatgcataatcgac犯t gagtaagaacccctctccccggcacttggc480
ataagt3ttgccaaatcattttta朋ttggtgttcgaaaagtgcctgcccactggstgaa540
ggcacaccgcattccaatgct caacaaaattcctgcacggceigagcaaeiacaacaagagc600
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tCCgtg犯35409
權(quán)利要求
1.一種鹽藻26S蛋白酶體亞基RPN10基因的cDNA序列，其特征在于該序列具有SEQ NO 1所示的堿基序列。
2. —種根據(jù)權(quán)利要求l所述的cDNA序列編碼的蛋白，其特征在于具有SEQN0 2所 示的氨基酸序列。
3. —種鹽藻26S蛋白酶體亞基RPN10基因的全長基因序列，其特征在于具有SEQ NO 3所示的堿基序列。
4. 一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的鹽藻26S蛋白酶體亞基RPNIO基因的全長基因序列 的克隆方法，其特征在于該方法具有如下步驟a. 利用限制性內(nèi)切酶&oi I消化含有Dvi 戶A^0的鹽藻EST文庫質(zhì)粒釋放 出目的片段，獲得26S蛋白酶體亞基RPNIO基因全長cDNA序列；b. 根據(jù)上述的cDNA序列設(shè)計(jì)引物篩選藻基因組BAC文庫，得到鹽藻26S蛋白 酶體亞基RPNIO基因的基因組BAC克隆，利用QIAGEN公司的 Large-Construct Kit抽提無大腸桿菌基因組污染的BAC質(zhì)粒，回收的DNA經(jīng) 機(jī)械破碎后，回收大小在2 4kb的DNA片段，連接到pUC18載體，構(gòu)建鳥槍 文庫；所述的引物序列為RPN10P4a: 5' ACATCGAGGGCGAGTCCAAC 3' RPN10P4b: 5' TGTGCAGCAGTGCATAAGAGC 3'c. 大通量提取鳥槍文庫的質(zhì)粒DNA，在MegaBACE4500上進(jìn)行序列的測定； 每個(gè)鳥槍質(zhì)粒利用M13正反向引物，進(jìn)行雙向測序。共測序480個(gè)鳥槍文庫 質(zhì)粒，即5塊96孔板d. 將上述的480個(gè)鳥槍文庫質(zhì)粒的原始數(shù)據(jù)輸入在RedHat Linux平臺(tái)的并聯(lián)計(jì) 算機(jī)群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所測序列，構(gòu)建亞克隆并測序以 填補(bǔ)出現(xiàn)在序列之中的缺口，得到一段連續(xù)的鹽藻基因組序列；通過與其 cDNA序列的比對(duì)，在該連續(xù)的鹽藻基因組序列中，獲得鹽藻26S蛋白酶體亞 基RPN10基因的全長基因序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鹽藻(Dunaliella viridis)中26S蛋白酶體亞基RPN10基因(DvRPN10)的cDNA序列、其編碼蛋白以及全長基因序列和克隆方法。本發(fā)明提供的關(guān)于鹽藻RPN10亞基基因的研究對(duì)揭示鹽藻細(xì)胞內(nèi)泛素/26S蛋白酶體蛋白質(zhì)降解途徑及其耐鹽機(jī)制，具有一定的理論意義。此外，本發(fā)明提供了鹽藻26S蛋白酶體RPN10的基因組序列，為進(jìn)一步研究該基因的表達(dá)調(diào)控并將其用于抗鹽植物的改良奠定了基礎(chǔ)，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K14/405GK101096677SQ20071004119
公開日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2007年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月24日
發(fā)明者孫曉斌, 孟祥宗, 宋任濤, 許政暟 申請(qǐng)人:上海大學(xué)