專利名稱：藥劑、牙科材料及篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于治療牙髓炎及/或促進(jìn)象牙質(zhì)形成的藥劑及其使用，特別涉 及利用基質(zhì)金屬蛋白酶-3對牙髓及其附近組織損傷及缺損時(shí)的修復(fù)。
背景技術(shù)：
以往，在齲齒等治療方法中，當(dāng)發(fā)生齲齒并深入牙髓時(shí)，通常通過拔除全部牙髓， 然后在空隙處填充根管充填材料進(jìn)行封閉處置。然而，近年來，由于拔髓產(chǎn)生的弊端(如象 牙質(zhì)脆化、喪失咬合感覺而引起再度齲齒)，期望盡可能保留牙髓組織。保留牙髓的方法有 直接蓋髓術(shù)和活髓切斷術(shù)(vital pulpotomy)，其中，直接蓋髓術(shù)用覆髓劑覆蓋露出的牙髓 表面，活髓切斷術(shù)只去除一部分牙髓并用覆髓劑覆蓋根部牙髓組織。在考慮到牙髓的保存時(shí)，在牙髓外側(cè)形成象牙質(zhì)很重要。為此，如文獻(xiàn)1、2、3所 述，嘗試以提高象牙質(zhì)促進(jìn)作用為目的的覆髓劑。另外，在考慮到牙髓的保存時(shí)，抑制牙髓炎癥及疼痛，且促進(jìn)血管新生及牙髓再生 很重要。為此，如非文獻(xiàn)1所述，嘗試以抗炎癥作用為目的的覆髓劑。文獻(xiàn)1 特開2002-363084號公報(bào)文獻(xiàn)2 特開平6-256132號公報(bào)文獻(xiàn)3 特開2005-263681號公報(bào)非文獻(xiàn) 1 Kawanishi HN, Kawashima N, et al. , Effects of an iNOS inhibitor onexperimentalIy induced rat pulpitis, J.Oral. Sci. ,112,332-337,2004.

發(fā)明內(nèi)容
但，這些現(xiàn)有覆髓劑的促進(jìn)象牙質(zhì)形成的作用還不十分令人滿意。文獻(xiàn)1所記載 的覆髓劑是以血液抽提物為有效成分的，然而，文獻(xiàn)1所記載的覆髓劑其促進(jìn)象牙質(zhì)形成 的功效還不足，而且還存在安全方面的問題。另外，文獻(xiàn)2所記載的覆髓劑是以N-乙酰葡 萄糖胺(Ο-GlcNAc)為有效成分的。然而，如文獻(xiàn)2所記載的覆髓劑不包含成齒質(zhì)細(xì)胞分化 誘導(dǎo)所必須的形態(tài)形成因子、細(xì)胞增殖分化因子、細(xì)胞遷移因子，所以只不過是間接吸附游 離在局部的因子而已。因此，文獻(xiàn)2所記載的覆髓劑在促進(jìn)象牙質(zhì)形成以及象牙質(zhì)-牙髓 復(fù)合體再生方面的功效不足。文獻(xiàn)3所記載的覆髓劑是以聚磷酸為有效成分的，然而使促 進(jìn)象牙質(zhì)形成的功效發(fā)揮不足。非文獻(xiàn)1中記載的覆髓劑是以一氧化氮誘導(dǎo)酶抑制劑為有 效成分的，非文獻(xiàn)1所記載的覆髓劑通過阻斷一氧化氮誘導(dǎo)酶、破壞炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的一端 來發(fā)揮消炎作用的。然而，促進(jìn)新生血管及牙髓再生的作用不足。因此，本發(fā)明以提供一種用于治療牙髓炎及/或促進(jìn)象牙質(zhì)形成的藥劑為目的。 另外，本發(fā)明還以提供一種用于治療牙髓炎及/或促進(jìn)象牙質(zhì)形成的牙科材料為目的。另 外，本發(fā)明還以提供一種治療牙髓炎及/或促進(jìn)象牙質(zhì)形成的藥劑的有效成分的篩選方法 為目的。本發(fā)明人從含有豐富牙髓干細(xì)胞的SP細(xì)胞(CD31_ ；CD146_SP細(xì)胞)中采集具有高血管再生能力的細(xì)胞，同時(shí)對牙髓SP細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。其結(jié)果為本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)， 涉及細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜分解的細(xì)胞外基質(zhì)分解酶的基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-:3)為高表 達(dá)。進(jìn)一步，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)可促進(jìn)牙髓創(chuàng)傷的愈合，同時(shí)有利于牙髓、象牙質(zhì) 的形成 再生以及牙髓炎的治愈，本發(fā)明人基于上述發(fā)現(xiàn)完成了此項(xiàng)發(fā)明。S卩，本發(fā)明具有 如下步驟。根據(jù)本申請發(fā)明的第一實(shí)施方式的藥劑，其含有有效成分，其中，該有效成分至少 包括具有基質(zhì)金屬蛋白酶-3活性的蛋白質(zhì)以及基質(zhì)金屬蛋白酶-3前體蛋白中的任意一 個(gè)。本發(fā)明的藥劑可以作為牙髓損傷或部分缺失時(shí)的藥劑使用。尤其，本發(fā)明的藥劑可以 作為牙髓炎及/或根尖性牙周炎等牙髓相關(guān)疾病的預(yù)防或治療劑使用。優(yōu)選地，有效成分的含量比例為12ng/ml-1000ng/ml之間，其中，該有效成分為至 少含有具有基質(zhì)金屬蛋白酶-3活性的蛋白質(zhì)以及基質(zhì)金屬蛋白酶-3前體蛋白中的任意一 種。根據(jù)本申請發(fā)明的第二實(shí)施方式的牙科材料，其含有有效成分，其中，該有效成分 至少含有具有基質(zhì)金屬蛋白酶-3活性的蛋白質(zhì)以及基質(zhì)金屬蛋白酶-3前體蛋白中的任意一種。優(yōu)選地，所述牙科材料含有機(jī)體親和性載體。該載體為符合藥理學(xué)的載體。優(yōu)選地，所述載體具有的一側(cè)縱向排列多個(gè)同一指向的凹形結(jié)構(gòu)，由氧透過性及/ 或物質(zhì)透過性的材料制成的膜狀載體。優(yōu)選地，所述載體至少含有膠原蛋白、人造蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖 (glycosaminoglycan)、明膠、水凝膠、纖維素、磷酸膽堿(phosphocholine)、透明質(zhì)酸、幾丁 質(zhì)、氨基葡萄糖、纖連蛋白、海藻酸、硫酸乙酰肝素(h印aransulfate)、肝素、層粘連蛋白、 磷酸鈣、羥基磷灰石、β-TCP、多聚乳酸、聚乙醇酸、DL-聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚 乙二醇、多晶硅、聚已酸內(nèi)酯(poIycapro 1 actone)、碳酸鈣、鈦、金、陶瓷、硅樹脂、硅水凝膠 (silicone hydrogel)中的任意一禾中。優(yōu)選地，本發(fā)明的牙科材料中至少還含有牙髓細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、牙髓前體細(xì)胞、 能分化為牙髓細(xì)胞的細(xì)胞、成齒質(zhì)細(xì)胞(odontoblast)以及能分化為成齒質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞中 的任意一種。優(yōu)選地，所述牙髓細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、牙髓前體細(xì)胞、可分化為牙髓細(xì)胞的細(xì)胞、成 齒質(zhì)細(xì)胞(odontoblast)以及可分化為成齒質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞含量在1 X IO3個(gè)/ μ 1 1 X IO6 個(gè)/μ 1之間。優(yōu)選地，本發(fā)明的牙科材料含有血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮前體細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的牙科材料含有上皮細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的牙科材料含有象牙質(zhì)基質(zhì)即牙本質(zhì)基質(zhì)(dentin matrix) 0另外，優(yōu)選地，在本發(fā)明的牙科材料中，所述基質(zhì)金屬蛋白酶-3活性的蛋白質(zhì) 以及基質(zhì)金屬蛋白酶-3前體蛋白中的任意一種所構(gòu)成的有效成分的含量比例在12ng/ ml-1000ng/ml 之間。優(yōu)選地，所述牙髓干細(xì)胞至少包含牙髓SP細(xì)胞、⑶3Γ ；⑶146—SP細(xì)胞、⑶M+細(xì)胞、 ⑶105+細(xì)胞、⑶150+細(xì)胞中的任意一種。根據(jù)本申請發(fā)明的第三實(shí)施方式的篩選方法，一種用于治療牙髓炎及/或促進(jìn)象牙質(zhì)形成的藥劑有效成分的篩選方法；在牙髓干細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞中添加被檢驗(yàn)化合 物，然后測定牙髓干細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-3編碼基因的表達(dá)量；在牙髓干 細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞中沒有添加被檢驗(yàn)化合物時(shí)，測定基質(zhì)金屬蛋白酶-3編碼基因的表 達(dá)量；將兩者基質(zhì)金屬蛋白酶-3編碼基因的表達(dá)量進(jìn)行比較，以將基質(zhì)金屬蛋白酶-3編碼 基因表現(xiàn)量所增加的被檢驗(yàn)化合物作為所述藥劑的有效成分進(jìn)行選擇。根據(jù)本發(fā)明的藥劑，能夠達(dá)到減輕牙髓炎的炎癥狀態(tài)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移， 防止血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的效果，并促進(jìn)牙髓干細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞在創(chuàng)面的增殖，同時(shí) 促進(jìn)新生血管，從而促進(jìn)象牙質(zhì)的形成，因此在牙髓炎的治療效果方面優(yōu)秀。另外，通過將 根據(jù)本發(fā)明的牙科材料填充至活體牙窩洞處，可減輕牙髓炎的炎癥狀態(tài)，并促進(jìn)牙髓干細(xì) 胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞在創(chuàng)面的增殖，促進(jìn)新生血管，從而促進(jìn)象牙質(zhì)的形成。并且，根據(jù)本 發(fā)明提供的篩選方法，通過比較基質(zhì)金屬蛋白酶-3編碼基因的表達(dá)量，從被檢驗(yàn)化合物中 可篩選出能夠促進(jìn)牙髓炎以及/或象牙質(zhì)形成的藥劑的有效成分。


圖IA為具有凹狀部的膜狀載體的平面圖。圖IB為具有凹狀部的膜狀載體的側(cè)面圖。圖IC為將凹狀部擴(kuò)大的說明圖。圖2A為嚴(yán)重齲齒引起牙髓裸露的牙齒的說明圖。圖2B為表示牙齒模具的說明圖。圖2C為對將帶有間葉干細(xì)胞(mesenchymal stem cell)的凹狀部載體置入牙形 模具中的牙窩洞內(nèi)的情況進(jìn)行說明的說明圖。圖2D為對將帶有MMP3活性蛋白的載體以及凹面載體置入牙形模具中的牙窩洞的 情況進(jìn)行說明的說明圖。圖2E為對在培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)干細(xì)胞的情況進(jìn)行說明的說明圖。圖2F為對垂直加壓后，干細(xì)胞分化為成齒質(zhì)細(xì)胞以及成釉細(xì)胞(enameloblast) 的情況進(jìn)行說明的說明圖。圖2G為對將帶有凹狀部的載體移植至牙窩洞后的情況進(jìn)行說明的說明圖。圖3A為對大鼠上顎切齒情況進(jìn)行說明的說明圖。圖:3B為對使用鉆石牙鉆(diamond point bur)去除大鼠上顎切齒牙冠上部的情 況進(jìn)行說明的說明圖。圖3C為使用球鉆(round bur)切斷大鼠上顎切齒牙髓的情況進(jìn)行說明的說明圖。圖3D為對清洗、止血處理斷面的情況進(jìn)行說明的說明圖。圖3E為對在斷面開口處填充明膠、樹脂的情況進(jìn)行說明的說明圖。圖4為對牙髓創(chuàng)傷處進(jìn)行說明的低倍圖片。圖5A為創(chuàng)傷出現(xiàn)1小時(shí)后的情況的顯微照片。圖5B為圖5A中方框區(qū)域的顯微照片。圖5C為創(chuàng)傷出現(xiàn)M小時(shí)后的情況的顯微照片。圖5D為圖5C中方框區(qū)域的顯微照片。圖5E為創(chuàng)傷出現(xiàn)72小時(shí)后的情況的顯微照片。
圖5F為圖5E中方框區(qū)域的顯微照片。圖5G為創(chuàng)傷出現(xiàn)7天后的情況的顯微照片。圖5H為圖5G中方框區(qū)域的顯微照片。圖6A為創(chuàng)傷下部牙髓處的mRNA表達(dá)的經(jīng)時(shí)變化示意圖；MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、 MMP14的表達(dá)示意圖。圖6B為創(chuàng)傷下部牙髓處的mRNA表達(dá)的揭示變化示意圖；VEGF、SDFl以及CXCR4 的表達(dá)示意圖。圖7A為活髓切斷M小時(shí)后，經(jīng)MMP3及BSl-血凝素(BSl-Iectin)雙重免疫熒光 染色后的MMP3顯微照片。圖7B為活髓切斷M小時(shí)后，經(jīng)MMP3以及BSl-Iectin雙重免疫熒光染色后 BSl-Iectin的顯微照片。圖7C為活髓切斷M小時(shí)后，經(jīng)MMP3以及BSl-Iectin雙重免疫熒光染色后Merge 處理的顯微照片。圖7D為活髓切斷M小時(shí)后，經(jīng)MMP3以及CXCR4雙重免疫熒光染色后MMP3的顯 微照片。圖7E為活髓切斷M小時(shí)后，經(jīng)MMP3以及CXCR4雙重免疫熒光染色后CXCR4的顯 微照片。圖7F為活髓切斷M小時(shí)后，經(jīng)MMP3以及CXCR4雙重免疫熒光染色后經(jīng)Merge處 理的顯微照片。圖7G為經(jīng)MMP3及CXCR4雙重免疫熒光染色后，MMP3的放大顯微照片。圖7H為經(jīng)MMP3及CXCR4雙重免疫熒光染色后，CXCR4的放大顯微照片。圖71為經(jīng)MMP3及CXCR4雙重免疫熒光染色后，Merge處理的放大顯微照片。圖7J為活髓切斷M小時(shí)后，牙髓創(chuàng)面經(jīng)HE染色后的顯微照片。圖7K為活髓切斷M小時(shí)后，牙髓斷面新生毛細(xì)血管以及新生大血管經(jīng)HE染色后 的顯微照片。圖7L為活髓切斷72小時(shí)后，新生毛細(xì)血管以及新生大血管經(jīng)HE染色后的顯微照 片。圖7M為活髓切斷M小時(shí)后，經(jīng)原位雜交，MMP3 mRNA在血管內(nèi)皮細(xì)胞以及血管內(nèi) 皮前體細(xì)胞中表達(dá)情況的顯微照片。圖7N為活髓切斷72小時(shí)后，經(jīng)原位雜交，MMP3 mRNA在血管內(nèi)皮細(xì)胞以及血管內(nèi) 皮前體細(xì)胞中表達(dá)情況的顯微照片。圖8A為在體外，MMP3促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的示意圖。圖8B為在體外，MMP3促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的示意圖。圖8C為在體外，MMP3促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞抗凋亡的示意圖。圖9A為大鼠活髓切斷M小時(shí)后，添加MMP3后經(jīng)BSl-Iectin染色的顯微照片。圖9B為大鼠活髓切斷M小時(shí)后，未添加MMP3 JSBSl-Iectin染色的顯微照片。圖9C為大鼠活髓斷面處的上部牙髓組織，在添加MMP3后，新生血管密度定量增加 的示意圖。圖9D為大鼠活髓切斷M小時(shí)后，添加MMP3 JSPCNA免疫染色時(shí)的顯微照片。
圖9E為大鼠活髓切斷M小時(shí)后，未添加MMP3，經(jīng)PCNA免疫染色后的顯微照片。圖9F為大鼠活髓切斷72小時(shí)后，添加MMP3，經(jīng)HE染色的顯微照片。圖9G為大鼠活髓切斷72小時(shí)后，未添加MMP3，經(jīng)HE染色時(shí)的顯微照片。圖9H為大鼠活髓切斷72小時(shí)后，添加MMP3，經(jīng)馬松染色(Masson' sTrichrome Stain)的顯微照片。圖91為大鼠活髓齒切斷72小時(shí)后，添加MMP3，原位雜交的顯微照片。圖9J為大鼠活髓齒切斷72小時(shí)后，未添加MMP3，經(jīng)馬松染色的顯微照片。圖9K為大鼠活髓切斷72小時(shí)后，添加MMP3及NNGH，經(jīng)馬松染色的顯微照片。圖9L為大鼠活髓切斷7天后，未添加MMP3，經(jīng)馬松染色的顯微照片。圖9M為大鼠活髓切斷7天后，添加MMP3及NNGH，經(jīng)馬松染色的顯微照片。圖9N為大鼠活髓切斷72小時(shí)后，添加MMP3，膠原蛋白基質(zhì)增加情況示意圖。圖90為大鼠活髓齒切斷7天后，添加MMP3，膠原蛋白基質(zhì)增加情況示意圖。圖IOA為狗活髓切斷14天后，添加MMP3，狗上顎臼齒象牙質(zhì)的形成情況的顯微照 片。圖IOB為狗活髓切斷14天后，添加MMP3，狗上顎臼齒象牙質(zhì)的形成情況的高倍顯 微照片。圖IOC為狗活髓切斷14天后，添加MMP3，狗上顎臼齒象牙質(zhì)的形成情況的超高倍 顯微照片。圖IOD為狗上顎臼齒活髓切斷14天后，PBS控制時(shí)的顯微照片。圖IOE為狗上顎臼齒活髓切斷14天后，PBS控制時(shí)的高倍顯微照片。圖IlA為發(fā)生牙髓炎的狗上顎臼齒添加MMP3 14天后，炎癥治療情況的顯微照片。圖IlB為發(fā)生牙髓炎的狗上顎臼齒添加MMP3 14天后，炎癥治療情況的高倍顯微 照片。圖IlC為發(fā)生牙髓炎的狗上顎臼齒的PBS控制時(shí)的14天后的顯微照片。圖IlD為發(fā)生牙髓炎的狗上顎臼齒的PBS控制時(shí)的14天后的高倍顯微照片。圖12A為將源于豬牙髓的CD31_ ；CD146_SP細(xì)胞附著于帶有凹狀部的硅氧樹脂 (silicone)膜載體上，培養(yǎng)12小時(shí)后的相差顯微照片。圖12B為垂直加壓6小時(shí)，培養(yǎng)48小時(shí)后，β -肌動(dòng)蛋白(β -actin)、Dspp以及 釉質(zhì)溶解素(Enamelysin)的mRNA表達(dá)的示意圖。附圖標(biāo)記說明100帶有凹狀部的載體；110凹狀部；200牙齒；210牙髓;290模具;300吸附有MMP3蛋白的載體；400培養(yǎng)設(shè)備；500大鼠上顎切齒；510鉆石牙鉆(diamond point bur)
520 球鉆(round bur)；540 斷面；550:明膠;560 樹脂。
具體實(shí)施例方式以下將參照添加的圖片來具體說明本發(fā)明的實(shí)施方式。本發(fā)明涉及一種可促進(jìn)牙髓炎治愈及/或象牙質(zhì)的形成的藥劑、牙科材料及有效 成分的篩選方法，其中，至少含有具有基質(zhì)金屬蛋白酶-3活性的蛋白質(zhì)以及基質(zhì)金屬蛋白 酶-3前體蛋白中的任意一種。本發(fā)明的各種實(shí)施方式均是利用基質(zhì)金屬蛋白酶-3對牙髓炎的進(jìn)行治療以及/ 或促進(jìn)象牙質(zhì)的形成?；|(zhì)金屬蛋白酶-3屬于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)族，相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì) 的分解。但是，每種MMP的特性還不完全知曉。本發(fā)明人根據(jù)從牙髓細(xì)胞中采集的特定SP細(xì)胞的表達(dá)圖譜，在SP細(xì)胞內(nèi)大量表 達(dá)的蛋白質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)了 MMP3具有特異地促進(jìn)象牙質(zhì)形成的作用。關(guān)于MMP3已進(jìn)行了多方 面的研究，示出了 MMP3對相關(guān)各種軟骨基質(zhì)成分的分解作用，從而MMP3作為破壞軟骨的蛋 白，已被認(rèn)為是作為風(fēng)濕癥(rheumatism)的參與因子或標(biāo)志使用。另外，在相關(guān)牙周病引 起的牙周組織，現(xiàn)在已嘗試使用MMP3編碼基因的表達(dá)抑制劑作為預(yù)防或治療牙周病(特開 2006-298913號公報(bào))。但，有關(guān)對MMP3的牙髓炎的治愈參與還完全不清楚。同時(shí)，對MMP3 的牙髓及/或象牙質(zhì)的形成、再生也完全不清楚。本發(fā)明的藥劑和牙科材料將具有具有基質(zhì)金屬蛋白酶-3活性的蛋白質(zhì)直接應(yīng)用 于創(chuàng)傷部位及/或炎癥部位，根據(jù)本發(fā)明的藥劑及牙科材料，可以促進(jìn)牙髓炎治療。另外， 根據(jù)本發(fā)明的藥劑和牙科材料，可以促進(jìn)牙髓及/或象牙質(zhì)的形成并再生。本發(fā)明的效果 并不限于發(fā)明，推測MMP3作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮前體細(xì)胞遷移、增殖、抗凋亡，通 過新生血管，在促進(jìn)牙髓的再生以及象牙質(zhì)形成、再生方面具有獨(dú)特的功效。下面，將說明本發(fā)明的各種實(shí)施方式。(牙髓炎治療及/或促進(jìn)象牙質(zhì)形成的藥劑)本藥劑含有具有MMP3活性的蛋白質(zhì)(以下稱MMP3活性蛋白)、MMP3前體蛋白 或這些蛋白的混合物為其有效成分。以下將MMP3活性蛋白、MMP3前體蛋白或它們的混 合物定義為MMP 3蛋白。MMP 3屬于MMP族中的一種蛋白質(zhì)成分，也被稱為基質(zhì)降解因子 (stromelysin) 1。MMP3可來源于各種生物，例如，人類MMP3的氨基酸序列以及堿基序列可 在 GenBank 中，通過 Accession 號碼 NP_002413. 1 獲得。MMP3活性蛋白可采用重組MMP3，即可來源于大腸桿菌、昆蟲或人纖維組織母細(xì) 胞(fibroblast)。MMP3活性蛋白是指天然MMP3的氨基酸序列中，具有任何1個(gè)或多個(gè) 氨基酸發(fā)生替換、缺失、插入以及增加的任何一種或2種以上的氨基酸序列，具有MMP3 活性的尤佳。也就是說，可以是一種天然MMP3的突變體。這些突變體的獲得，除了本領(lǐng) 域技術(shù)人員中公知的方法以夕卜，還可參照Molecular Cloning :A laboratory Mannual, 3nd Ed., Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY. ,2001(以下簡 禾爾為 Molecular Cloning 第三版)或 Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1-38, John Wiley &Sons (1987-1997)(以下簡稱為 Current Protocols in Molecular Biology)獲得。MMP3的活性可通過MMP3活性測定系統(tǒng)(Nagase et al.， J. Biol. Chem. 1994269 =20952-20957)等進(jìn)行測定，其中，MMP3活性測定系統(tǒng)使用明膠酶譜 (Gelatin-zymography) > Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)或焚光月太。另夕卜， 對于突變體中MMP3的活性程度無特殊限制。MMP3前體蛋白是由結(jié)締組織細(xì)胞分泌的一種 無活性前體(pro MMP3)，是前體肽(Pro-p印tide)被有限分解前的前體，還包含天然MMP3 前體的突變體。MMP3活性蛋白是將MMP3前體蛋白利用人工胰朊酶、纖溶酶(plasmin)、絲氨酸蛋 白酶(serine proteinase)等切斷得到。也就是說，MMP3前體蛋白通過其他或自身的蛋白 酶酶解活性，前體肽經(jīng)有限分解，從而具有了酶活性。因此，使藥劑中含有MMP3前體蛋白質(zhì) 可防止藥物在用于活體前藥效發(fā)生劣化，MMP3前體蛋白進(jìn)入機(jī)體后，會(huì)自然地或因其他作 用而被激活。若使用MMP3活性蛋白和MMP3前體蛋白的混合物，二者混合的比例無特別限 制，可適當(dāng)配比。本發(fā)明的藥劑中的MMP3蛋白，在允許藥理學(xué)以及藥劑學(xué)原理的情況下，可與其他 添加物混合，制作成適用于患處的各種制劑。本發(fā)明中的覆髓劑可采用多種劑型如注射劑、 外用液劑(注入劑、搽劑)、固體制劑(顆粒劑、細(xì)粒劑、散劑、軟膏劑、錠劑)、軟膏劑等。藥理學(xué)以及藥劑學(xué)范圍內(nèi)容許的添加物包括如賦形劑、崩解劑或崩解助劑、等張 化劑(isotonization)、酸度調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、保護(hù)劑、分散劑、乳化劑、膠化劑、增稠 劑、粘合劑、增味劑等。關(guān)于膠化劑，如吸收牙齒的浸出液，能使之膠化即可。粉劑以及液劑 等劑型，使用時(shí)可混合或攪拌。本發(fā)明藥物中可含有殺菌劑、抗生素、消炎藥物等其他有效成分。本發(fā)明藥物除可用于治療齲齒時(shí)的牙科修復(fù)以及修補(bǔ)處置外，還可用于外傷引起 的牙髓裸露以及拔髓后用于露髓面或其附近。例如，可將本發(fā)明藥物涂抹或填充于髓腔擴(kuò) 大、拔髓后的牙窩洞處、象牙質(zhì)、活髓齒的斷面處。另外，在拔髓或根管清創(chuàng)擴(kuò)創(chuàng)后的牙髓再 生治療時(shí)，也可將本藥物用于再生牙髓表面或根管內(nèi)及其附近處。本發(fā)明藥物可單獨(dú)使用，也可與直接覆髓劑或間接覆髓劑配伍使用。在使用直 接覆髓劑或間接覆髓劑前后均可使用本發(fā)明藥物，也可將本藥物與直接覆髓劑或間接覆 髓劑混合使用。在本發(fā)明中，「直接覆髓劑」是指部分牙髓暴露時(shí)，用于保護(hù)牙髓的藥劑， 如氫氧化鈣等制劑?！搁g接覆髓劑」是指象牙質(zhì)變薄而牙髓未裸露時(shí)，用于阻斷外來刺激、 殺菌等目的的藥劑，如氧化鋅丁香油酚(zinc oxide eugenol)、鋅化雜酚油(zinc oxide Creosote)。本發(fā)明藥物中MMP3蛋白的含量可在12ng/ml lOOOng/ml之間，適宜含量為 50ng/ml 500ng/ml，最佳含量為 80ng/ml 200ng/ml。若其含量低于 10ng/ml，則 MMP3 對HUVEC遷移的促進(jìn)作用不明顯。若MMP3的含量高于lOOOng/ml，則本發(fā)明藥物用于人體 時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)期的副作用。本發(fā)明藥物的用量無特別限制，可根據(jù)患者的癥狀(齲 齒的程度、牙髓損傷·缺損程度)、年齡、劑型酌情處置。本發(fā)明藥物中有效成分MMP3活性 蛋白的每次用量可在Ing IOOyg之間，適宜用量為IOng 10 μ g，最佳用量為IOng 1 μ g，所述用量均指干重。本發(fā)明藥物可促進(jìn)牙髓及/或象牙質(zhì)形成，在其損傷或缺損時(shí)還會(huì)促進(jìn)其再生。因此，將藥物用于裸露的牙髓表面或其附近可較好的發(fā)揮保存牙髓的功效。另外，在發(fā)生牙髓炎時(shí)，本發(fā)明藥物還有利于牙髓或其附近炎癥的治愈或改善其 癥狀。因此，本藥物可用于包括牙髓炎或根尖性牙周炎等牙髓及其附近炎癥疾病在內(nèi)的牙 髓相關(guān)疾病的預(yù)防或治療。(牙科材料)本發(fā)明提供的牙科材料中，除含有MMP3蛋白外，也可含有機(jī)體親和性、MMP3蛋白 的支撐載體。將本材料用于牙髓缺損部位及其附近處，可促進(jìn)牙髓及/或象牙質(zhì)的形成，能 較好地保留牙髓或促進(jìn)其再生。(載體)在本牙科材料中，由于載體的作用可使本牙科材料中的MMP3蛋白更易于到達(dá)患 處。另外，在牙髓及象牙質(zhì)再生或形成時(shí)載體還可將MMP3蛋白長期地保留于患處。同時(shí)， 載體還可成為富集各種細(xì)胞，促進(jìn)組織再生的支架或充填材料而發(fā)揮作用。載體既可事先 與MMP3蛋白組成復(fù)合物，也可與MMP3蛋白分別獨(dú)立制成試劑盒使用。MMP3蛋白與載體可通過某種相互作用而被保留在載體表面。載體最好由具有機(jī)體親和性材料制成。機(jī)體親和性材料如I型及III型膠 原蛋白、缺端膠原(atelocollagen)等各種膠原蛋白、人造蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖 (glycosaminoglycan)、明膠、/K凝膠(hydrogel)、纖維素、磷酸膽堿(phosphocholine)、透 明質(zhì)酸、幾丁質(zhì)、氨基葡萄糖、纖連蛋白、海藻酸、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、肝素、 層粘連蛋白、三磷酸鈣、羥磷灰石(hydroxyapatite)、β-TCP等天然材料及其衍生物，除所 述物質(zhì)外還可使用PLA (聚乳酸)、PGA (多聚葡萄糖酸)、PDLLA (DL-聚乳酸)、PLGA (乳酸 葡萄糖共聚物)、PEG(聚乙二醇)、聚硅氧烷(poly silicone) ,PCL(caprolactone)等高分 子材料。機(jī)體親和性載體材料可采用如碳酸鈣、鈦、金及陶瓷等無機(jī)材料。另外，蛋白聚糖 是蛋白質(zhì)與糖苷鍵共價(jià)結(jié)合的一種復(fù)合糖蛋白?？紤]到細(xì)胞的粘附性及細(xì)胞的增殖性，可 在聚硅氧烷等高分子材料載體表面使用等離子涂層材料(Plasma-Coating)、膠原蛋白溶液 或纖連蛋白等天然材料及其衍生物制成載體材料層。為了提高細(xì)胞的粘附性，可對載體表 面采取等離子(plasma)處理、制作膠原蛋白涂層(Collagen Coat)等措施。I和III型膠原蛋白系將I型膠原蛋白和III型膠原蛋白混合組成的混合膠原蛋 白。I型膠原蛋白是一種基礎(chǔ)性膠原，屬于纖維性膠原蛋白。III型膠原蛋白與膠原纖維不 同，會(huì)形成細(xì)網(wǎng)狀的構(gòu)型即網(wǎng)狀纖維，可成為細(xì)胞的支架。III型膠原蛋白在混合膠原蛋白 中的比例最好在30% 50% (重量比)，III型膠原蛋白的重量比若大于50%，混合膠原 蛋白可能不發(fā)生凝固。若III型膠原蛋白的重量比低于30%，多量的I型膠原蛋白有可能 引起象牙質(zhì)的再生而影響新生血管的形成。I型和III型膠原蛋白的重量比最好為1 1。 機(jī)體親和性載體可使用平均直徑在Inm lOOOnm、海綿狀的具有三維立體結(jié)構(gòu)的納米纖維 (一種熱塑性高分子)制成。三維立體結(jié)構(gòu)納米纖維的孔隙率最好在80% 99. 99%之 間。另外，納米纖維的平均直徑可通過下列方法求得使用掃描電鏡觀察海綿狀三維立體結(jié) 構(gòu)的橫斷面或縱斷面，用圖像處理軟件分析在同一斷面內(nèi)隨機(jī)選取的150根單纖維的斷面 積，計(jì)算圓周換算直徑，從而求得平均直徑。載體的三維立體結(jié)構(gòu)無特別限制，長纖維狀(filament)、薄膜狀、纖維集合體狀、 網(wǎng)狀、海綿狀、微粒狀等各種形狀均可。另外，載體既可涂于牙髓表面，也可制成牙窩洞的形狀(拔髓或牙髓切斷后所產(chǎn)生的三維立體空隙的形狀)。載體的表面最好既能成為MMP3蛋白的支架，又有利于細(xì)胞的粘附，最理想的載體 是具有一定表面積與空隙的多孔材質(zhì)或網(wǎng)狀骨架材質(zhì)。也可將具有不同三維立體結(jié)構(gòu)的載體組合使用，如將多孔材質(zhì)的載體(適合用于 覆蓋在裸露牙髓表面和填充于裸露牙髓上側(cè)的空隙處)與用于象牙質(zhì)再生支架的載體組 合使用。這樣使用時(shí)，兩種載體上都可吸附有MMP3蛋白，若牙髓側(cè)的載體中也有MMP3蛋白 的話，促進(jìn)組織再生的效果會(huì)更好。牙科材料含有載體時(shí)，可將MMP3蛋白事先吸附于載體上。將MMP3蛋白吸附于載 體上時(shí)，若二者依靠相互作用較易粘附的話，只要將二者混合、浸泡等相互接觸即可。用于象牙質(zhì)再生的支架載體，如圖IA所示，可使用表面具有微小凹陷結(jié)構(gòu)110的 載體100。這種微小凹陷結(jié)構(gòu)110可模擬象牙質(zhì)的象牙細(xì)管(或齒細(xì)管)的形態(tài)來制作。 凹陷結(jié)構(gòu)110不需完全模仿象牙質(zhì)的象牙細(xì)管形態(tài)，最好參照象牙細(xì)管的尺寸(直徑與深 度)、方向及空隙(即節(jié)距(pitch))來制作。載體上之所以準(zhǔn)備凹陷結(jié)構(gòu)110是為了促進(jìn) 象牙質(zhì)的再生。如圖IB所示，凹陷結(jié)構(gòu)110在載體100的一側(cè)需設(shè)有開口。凹陷結(jié)構(gòu)110的深 度d可制成Iym至幾十μπι，深度d的較好范圍值在Iym 15 μ m之間，最好在1 μ m 13 μ m之間，最理想在2 μ m 10 μ m之間。如圖IC所示，凹陷結(jié)構(gòu)110的直徑t及傾斜度ρ 可在數(shù)μπι至數(shù)十μ m之間，其中直徑t可在Iym 12μπι之間，較好的范圍值為Iym 10 μ m,更好的范圍值為2 μ m 8 μ m。凹陷結(jié)構(gòu)110的傾斜度ρ值可在2μπι 30μπι之 間，較好的范圍值為3 μ m 30 μ m，最好在4 μ m 26 μ m之間。牙髓的斷面積大約為1mm2。 對于牙髓(露髓面)來說，凹陷結(jié)構(gòu)110最好在5000個(gè) 50000個(gè)左右。另外，凹陷結(jié)構(gòu) 110既可制成非貫通型的(未貫穿至開口面的對側(cè))，也可制成貫通型的。不過，凹陷結(jié)構(gòu) 110制成非貫通型的較好。具有凹陷結(jié)構(gòu)110的載體100的厚度無特別限制，可在200 μ m 1000 μ m 之間。具有凹陷結(jié)構(gòu)的載體100最好由氧透過性或物質(zhì)透過性的材料制成，這樣可促 進(jìn)成齒質(zhì)細(xì)胞及象牙質(zhì)的形成。這種載體最常用硅樹脂材料制成。硅樹脂載體不需采用 激光及一些后加工工藝形成凹陷結(jié)構(gòu)，在參照牙窩洞形態(tài)加工成立體三維結(jié)構(gòu)時(shí)即可形 成凹陷結(jié)構(gòu)。例如，參照牙窩洞形態(tài)的母模(cavity)模具在加工成形的同時(shí)，凹陷結(jié)構(gòu) 也隨之形成了。硅樹脂材料制成的載體在用于病灶部位后，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)比較容易清 除。硅水凝膠(siliconehydrogel)也可制成的凹面載體100。硅水凝膠是由含有聚碳 酸酯(Polycarbonate)骨架的共聚物(copolymer)和由親水性單體聚合而成的親水性高 聚物(Polymer)構(gòu)成的，是共聚物與高聚物相互形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的一種透明膠狀物。 除硅水凝膠外，硅橡膠(PDMS)、Poly(dimethylacrylamide-co-glycidyl methacrylate) (PDMA-co-GMA)、甲基丙烯酸羥乙酯(hydroxyethyl methacrylate)也可制成凹面載體 100。將細(xì)胞接種至凹面載體100進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基通常采用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中常用 的血清培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件一般選擇動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件(例如，37°C、5% C02)。具體培養(yǎng)方法如下準(zhǔn)備凹陷結(jié)構(gòu)載體100，從牙髓等組織中采集牙髓細(xì)胞，然后使 之附著于載體凹陷結(jié)構(gòu)開口的一面，再將載體置于適當(dāng)?shù)闹挝锷?，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，將凹面載體100的開口面朝下浸泡在液體培養(yǎng)基中，從液體培養(yǎng) 基的表面沿載體凹陷結(jié)構(gòu)的縱深方向?qū)嵤┓磸?fù)加壓操作，通過所述培養(yǎng)后，附著于載體上 的細(xì)胞會(huì)排列生長、分化為成齒質(zhì)細(xì)胞。加壓操作可以使用機(jī)械裝置進(jìn)行，機(jī)械壓力的大小 無特別限制，不過，壓力過大的話，對干細(xì)胞或成齒質(zhì)細(xì)胞可能會(huì)產(chǎn)生損傷，所以，壓力可選 在0. 75N/cm2 1. 5N/cm2之間，壓力較好的范圍值為0. 85N/cm2 1. 25N/cm2，最好在0. 95N/ cm2 1. ON/cm2之間。另外，加壓操作的頻率為每分鐘1次-10次左右，最好在3次-8次/ 每分鐘，每次持續(xù)數(shù)秒至數(shù)十秒，壓力應(yīng)施加于置于容器中的液體培養(yǎng)基。加壓的原則應(yīng)以 不影響細(xì)胞的增殖為原則。經(jīng)過所述的加壓操作后，成齒質(zhì)細(xì)胞就會(huì)形成象牙質(zhì)。將上皮細(xì)胞粘附于載體100凹陷結(jié)構(gòu)110開口方向的對側(cè)面時(shí)，通過加壓操作，上 皮細(xì)胞會(huì)分化為成齒質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)也能分化為成釉細(xì)胞(enameloblast)。當(dāng)凹面載體100的凹狀部開口面一側(cè)接種并培養(yǎng)齒髓干細(xì)胞時(shí)，也可以在該開口 面處以與吸附有MMP活性3蛋白質(zhì)的其他載體(吸附有MMP3蛋白的載體)相接觸的狀態(tài) 下進(jìn)行培養(yǎng)。這樣，該其他載體變成重新產(chǎn)生的成齒質(zhì)細(xì)胞的支架的同時(shí)，MMP3活性蛋白 質(zhì)速進(jìn)成齒質(zhì)細(xì)胞的生長。凹面載體100可直接覆蓋在拔髓或牙髓切斷后裸露的牙髓表面。將凹面載體100 直接覆蓋在拔髓或牙髓切斷后裸露的牙髓表面時(shí)，可根據(jù)拔髓后所留空隙的形狀，特別是 對于象牙質(zhì)處空隙的三維立體形狀，將載體制成合適的形狀使用。另外，可以將吸附有MMP3 蛋白的載體置于進(jìn)行拔髓或牙髓切斷處置后產(chǎn)生空隙的牙髓側(cè)面(通常在里面)，而將凹 面載體100置于該空隙的表面。同時(shí)，還需盡可能將載體100的象牙細(xì)管狀的凹陷結(jié)構(gòu)100 的開口面朝向牙髓側(cè)放置。凹面載體100和MMP3蛋白載體可分別制作，然后移植在處置后 的部位。凹面載體100和MMP3蛋白載體也可做成預(yù)定的形狀成為一體后，再移植至處置后 的部位。下面將參照圖2A-圖2G說明凹面載體100與MMP3載體的使用。圖2A-圖2G為 使用凹面載體(膜)100，形成象牙細(xì)管及牙釉質(zhì)的模式圖。首先，如圖2A所示，以牙齒200 為治療對象，因嚴(yán)重齲齒牙髓210已裸露，進(jìn)行活髓切斷處置。如圖2B所示，用物理法取牙 形，制作模型四0，也可以不使用物理法取牙形，而通過計(jì)算機(jī)測量后制作模型。如圖2C所 示，將源于牙髓的干細(xì)胞或前體細(xì)胞等間葉干細(xì)胞附著于凹面載體100的凹面結(jié)構(gòu)110的 表面，然后再放入牙形模具290的牙窩洞內(nèi)。在所述操作過程中，也可事先將口腔粘膜上皮 等上皮細(xì)胞吸附于凹面載體100的凹面結(jié)構(gòu)110表面。如圖2D所示，也可將MMP3蛋白載 體300放入牙形窩洞的牙髓側(cè)(內(nèi)側(cè))。另外，有時(shí)也將源于牙髓的干細(xì)胞 前體細(xì)胞注入 MMP3蛋白載體300內(nèi)。如圖2E所示，在培養(yǎng)裝置400內(nèi)，沿凹面結(jié)構(gòu)110的縱深方向垂直加 壓，進(jìn)行間葉干細(xì)胞的三維細(xì)胞培養(yǎng)。如圖2F所示，三維細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間后，細(xì)胞會(huì)排列 分布，分化為成齒質(zhì)細(xì)胞及成釉細(xì)胞，從而形成象牙質(zhì)及牙釉質(zhì)。如圖2G所示，將凹面載體 的凹面部分110朝下，移植至牙窩洞內(nèi)，再用樹脂封閉。這種情況下，有時(shí)也可將MMP3蛋白 載體置于牙髓裸露面或活髓斷面上，在其上面再直接放置未粘附有源于牙髓的干細(xì)胞·前 體細(xì)胞的凹面載體300。通過上面的一系列操作，牙髓、象牙細(xì)管及牙釉質(zhì)(牙釉質(zhì)是在口 腔粘膜上皮等上皮細(xì)胞粘附于凹面載體100的凹面對側(cè)的時(shí)候形成的)即可形成。也可以只將凹面載體100覆蓋在裸露的牙髓表面。牙髓斷面較淺時(shí)，只將MMP3蛋 白吸附在載體上然后覆蓋在牙髓表面即可見效。
(牙髓細(xì)胞)本發(fā)明提供的牙科材料可單獨(dú)含有牙髓細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、牙髓前體細(xì)胞、能分化 為牙髓細(xì)胞的細(xì)胞、成齒質(zhì)細(xì)胞及能分化為成齒質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞中1種或2種以上的細(xì)胞成 分，也可與載體共同含有所述細(xì)胞成分。將這些細(xì)胞置于缺損部位時(shí)，會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)牙髓及 /或象牙質(zhì)的形成·再生。其中，牙髓細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、牙髓前體細(xì)胞及能分化為牙髓細(xì)胞 的細(xì)胞能促進(jìn)牙髓及象牙質(zhì)的形成及再生，而成齒質(zhì)細(xì)胞及能分化為成齒質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞能 促進(jìn)象牙質(zhì)的形成及再生。本牙科材料以載體為支持物，成為這些細(xì)胞的支架，使之粘附其 上，細(xì)胞才能得以增殖。這些細(xì)胞(牙髓細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、牙髓前體細(xì)胞、能分化為牙髓細(xì) 胞的細(xì)胞、成齒質(zhì)細(xì)胞及能分化為成齒質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞)的含量最好在IXIO3個(gè)/μ I-IXlO6 個(gè)/μ ι之間。若其含量低于IXIO3個(gè)/μ 1，則促進(jìn)牙髓及象牙質(zhì)形成、再生的效果可能不 理想。若其含量高于IXlO6個(gè)/μ 1，在填充至牙窩洞內(nèi)時(shí)則會(huì)產(chǎn)生無法預(yù)期的副作用。牙髓干細(xì)胞來源于恒齒或乳齒。特別是在源于人乳齒的牙髓細(xì)胞中，CD105+細(xì)胞 含量較多，大約占50%左右(在源于人恒齒的CD31_ ；SP細(xì)胞中，CD105+細(xì)胞的含量約為 20% )，源于人乳齒的牙髓細(xì)胞在試管內(nèi)的實(shí)驗(yàn)表明，這種細(xì)胞具有誘導(dǎo)血管再生、恢復(fù)下 肢缺血部位的血流、促進(jìn)新生血管形成的功能。牙髓干細(xì)胞包括人牙髓SP細(xì)胞、⑶3Γ ；⑶146—細(xì)胞、⑶M+細(xì)胞、⑶105+細(xì)胞、 CD150+細(xì)胞等。例如，人牙髓SP細(xì)胞在促進(jìn)血管新生等組織再生方面的功能較強(qiáng)。在促進(jìn) 下肢缺血部位血管新生能力上，人牙髓SP細(xì)胞與人乳齒牙髓細(xì)胞比較，前者是后者的1. 2 倍；人牙髓SP細(xì)胞是人恒齒牙髓細(xì)胞的2. 6倍。這些細(xì)胞可從拔掉的人齒中采集。人牙髓細(xì)胞可參照Nakashima M. Archs oral boil. 36(9)，655-663，1991文獻(xiàn)中記載的方法采集。能分化為人牙髓細(xì)胞的細(xì)胞可按照下 列方法采集無菌取出阻生牙(impacted tooth)，在Phosphate Buffered Saline(以下簡 稱PBQ溶液等適當(dāng)?shù)谋３忠褐斜４妗Ｇ宄例X中的鈣化部分，再將組織切成小塊，用PBS 溶液清洗。接著用膠原酶(Collagenase)或中性蛋白酶(dispase)酶解組織。酶解后，通 過過濾和離心操作以分離細(xì)胞。所得細(xì)胞為均質(zhì)的同類細(xì)胞較好，最好為自體細(xì)胞。也可 以是經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)所得的細(xì)胞。成齒質(zhì)細(xì)胞的采集方法如下將重組子Bone MorphogeneticProteins (BMPs)(從 BMP2、BMP7及BMPll中選擇1種或2種以上)加入至牙髓細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞或牙髓前體細(xì) 胞內(nèi)或?qū)肫渚幋a基因，在Dulbecco ‘sModified Eagle Medium(DMEM)中進(jìn)行二維或三維 培養(yǎng)，使所述細(xì)胞發(fā)生分化即可得到成齒質(zhì)細(xì)胞。能分化為成齒質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞是指牙髓細(xì) 胞、牙髓干細(xì)胞或牙髓前體細(xì)胞等細(xì)胞。牙髓細(xì)胞是通過膠原酶酶解牙髓組織后，分離得到 的(參照文獻(xiàn) Nakashima M. Archs oral boil. 36 (9)，655-663，1991)。牙髓前體細(xì)胞及牙 髓干細(xì)胞是經(jīng)流式細(xì)胞儀，從大量排出Hoechst33342的組分Side population (SP)中分選 后得到的。另外，牙髓前體細(xì)胞及牙髓干細(xì)胞也可用⑶對、⑶；34、⑶105、⑶133或⑶150抗 體來分選⑶24+、⑶34+、⑶105+、⑶133+或⑶150+細(xì)胞進(jìn)而得到所需細(xì)胞。本發(fā)明牙科材料還可含有血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮前體細(xì)胞。因MMP3活性蛋白 可促進(jìn)這些細(xì)胞向損傷部位遷移增殖、促進(jìn)新生血管的形成，同時(shí)還能促進(jìn)牙髓及/或象 牙質(zhì)的形成。這些細(xì)胞為同類細(xì)胞較好，最好為自體細(xì)胞。這二種細(xì)胞也可通過細(xì)胞培養(yǎng) 的方法獲得。
本發(fā)明牙科材料還可含有上皮細(xì)胞或其前體細(xì)胞。上皮細(xì)胞或其前體細(xì)胞隨著成 齒質(zhì)細(xì)胞的成齒質(zhì)形成及再生，分化為成齒質(zhì)細(xì)胞及成釉細(xì)胞，從而形成象牙質(zhì)及牙釉質(zhì)。 這樣的上皮細(xì)胞或其前體細(xì)胞可以從口腔粘膜上皮或羊膜上皮采取。相比同種細(xì)胞，這種 細(xì)胞更加優(yōu)選同族細(xì)胞。另外，這種細(xì)胞可以是培養(yǎng)細(xì)胞。本發(fā)明牙科材料含有牙髓細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、牙髓前體細(xì)胞及能分化為牙髓細(xì)胞 的細(xì)胞、成齒質(zhì)細(xì)胞、能分化為成齒質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮前體細(xì)胞、上皮細(xì)胞或 其前體細(xì)胞，也可在所述細(xì)胞中添加從骨髓、胎盤及臍帶血等組織中采集的間葉干細(xì)胞或 未分化的間葉干細(xì)胞。另外，也可通過下列方法將采集的細(xì)胞作為本牙科材料中含有的細(xì)胞成分即 用CD31、⑶146、⑶105及VEGFR2抗體標(biāo)記牙髓細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀分選⑶3Γ及/或 ⑶146_及/或⑶105+及/或VEGFR2+細(xì)胞，進(jìn)而獲得所需細(xì)胞。本發(fā)明發(fā)明人通過所述方 法，分離得到一種大量分泌MMP3活性蛋白的SP細(xì)胞，這種細(xì)胞中可能富含牙髓干細(xì)胞。牙科材料中若含有細(xì)胞成分，無論是否添加MMP3活性蛋白，只要含有細(xì)胞培養(yǎng)增 殖后產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)物即可。另外，如果牙看材料中含有細(xì)胞，有無載體均可。如果牙科材 料中含有載體，只要將細(xì)胞(或培養(yǎng)細(xì)胞)接種至載體上即可，也可將其培養(yǎng)物接種至載 體。在牙科材料包含細(xì)胞和載體時(shí)，MMP3蛋白最好吸附于載體上。MMP3蛋白既可在細(xì) 胞接種前吸附于載體上，也可在細(xì)胞接種的同時(shí)、細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)或細(xì)胞培養(yǎng)后吸附于載體上。本發(fā)明牙科材料中也可含有象牙質(zhì)基質(zhì)。象牙質(zhì)基質(zhì)可促進(jìn)損傷部位象牙質(zhì)的形 成。膠原蛋白、羥磷灰石(hydroxyapatite)、三磷酸鈣等均可作為象牙質(zhì)基質(zhì)。象牙質(zhì)基 質(zhì)中也可含有蛋白質(zhì)成分，如dentin sialophosphoprotein(Dspp)、人造蛋白聚糖、dentin matrix protein(Dmpl)等。本發(fā)明牙科材料中還可含有形態(tài)形成因子，該因子可促進(jìn)細(xì)胞分化誘導(dǎo)為成齒 質(zhì)細(xì)胞。這種形態(tài)形成因子包括1，25 二羥維生素D3、地塞米松(dexamethasone)、Bone morphogenetic proteins (BMPs)、Insulin-like growthfactors(IGFs) > Fibroblast growth factors (FGFs)等。(篩選方法)本發(fā)明提供的篩選方法是指下列所述工藝即在牙髓干細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞中添 加被檢化合物，然后測定牙髓干細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞中的基質(zhì)金屬蛋白酶-3編碼基因的 表達(dá)量，與未添加被檢化合物時(shí)進(jìn)行比較，通過此種方法來篩選能夠增加金屬蛋白酶-3編 碼基因表達(dá)量的被檢化合物并以此作為治療牙髓炎及/或促進(jìn)象牙質(zhì)形成藥物的有效成 分。根據(jù)此篩選方法來選擇能促進(jìn)牙髓干細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MMP3蛋白的被檢化合 物。這些被檢化合物可與MMP3蛋白同時(shí)或代替MMP3蛋白作為所述藥物的有效成分。MMP3基因的表達(dá)量，按照下述方法測定，即從接觸被檢化合物的細(xì)胞中采集全 RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從擴(kuò)增產(chǎn)物中得出MMP3基因的表達(dá)量。MMP3 活性蛋白的表達(dá)量可通過測定牙髓細(xì)胞的上清培養(yǎng)液中的MMP3活性來獲得。MMP3的活 性可通過 MMP3 活性測定系統(tǒng)(Nagase et al.，J. Biol. Chem. 1994 269 :20952-20957) 進(jìn)行測定，這些測定系統(tǒng)主要是基于明膠酶譜(Gelatin-zymography)、Enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA)或焚光妝等方法。
以下，將通過應(yīng)用實(shí)例具體說明本發(fā)明。本發(fā)明并不只限于以下幾個(gè)應(yīng)用實(shí)例。應(yīng)用實(shí)例(應(yīng)用實(shí)例1牙髓創(chuàng)傷治愈過程中，MMP3的表達(dá)情況)1.大鼠活髓切斷模型的制作首先準(zhǔn)備大鼠上顎切齒500，如圖3A所示。大鼠體重在220g ^Og之間，為8周 齡雄鼠(購于日本東京CLEA公司)。如圖:3B所示，使用鉆石牙鉆510，將大鼠上顎左右切 齒的牙冠上部除去2mm。如圖3C所示，用#1/2球鉆520疏通，然后對大鼠上顎左右切齒進(jìn) 行活髓切斷處置。如圖3D所示，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗斷面540并止血。如圖3E所 示，將含有50ng MMP3的明膠和樹脂(Unifil low、GC、東京)填充至斷面開口處。暫封處 置后，分別于1小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)及7天后，使用4%的多聚甲醛固定液進(jìn)行 灌流固定，摘除上顎切齒。將摘除的上顎切齒在4°C下、置于4%的多聚甲醛溶液中浸泡固 定過夜，然后在10%乙酸中脫鈣2周。將所述處理后的上顎切齒使用乙醇進(jìn)行脫水，石蠟 (Sigma)包埋，制成5μπι厚度的切片，將石蠟切片置于APS Coated slide (Matsunami東京) 上。玻片在進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)(hybridization)及HE染色之前需4°C保存。將免疫組化 用的sample使用OCT復(fù)合物進(jìn)行包埋處理，制成12 μ m厚的冷凍切片后，置于APS Coated slide 上。圖4為創(chuàng)傷出現(xiàn)12小時(shí)后的低倍圖片，在箭頭處進(jìn)行斷髓操作。圖5A為1小時(shí) 后的創(chuàng)傷狀態(tài)，圖5B為圖5A方形區(qū)域的放大圖片。如圖5A和圖5B所示，在創(chuàng)傷出現(xiàn)1小 時(shí)后，圖中可觀察到出血及血管擴(kuò)張現(xiàn)象。大鼠覆髓后，創(chuàng)傷表面出現(xiàn)壞死、變性現(xiàn)象，在創(chuàng) 傷面下可見以嗜中性粒細(xì)胞為主的炎癥性細(xì)胞浸潤，整個(gè)牙髓組織出現(xiàn)浮腫。圖5C為創(chuàng)傷M小時(shí)后的情況，圖5D為圖5C中方框區(qū)域的放大圖片。ν表示新生 血管。如圖5C和圖5D所示，在創(chuàng)傷出血M小時(shí)后炎癥性細(xì)胞浸潤減輕，在變性牙髓正下 方，可見斷面下的牙髓組織內(nèi)出現(xiàn)很多成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞、多角形細(xì)胞及新生血管。圖5Ε為創(chuàng)傷72小時(shí)后的情況，圖5F為圖5Ε中方框區(qū)域的放大圖片。OD表示骨 樣象牙質(zhì)。如圖5Ε及圖5F所示，創(chuàng)傷72小時(shí)后，斷面下牙髓組織內(nèi)的上部附近，紡錘形細(xì) 胞周圍有膠原蛋白基質(zhì)并形成了 一些骨樣象牙質(zhì)。圖5G為創(chuàng)傷7日后的情況，圖5Η為圖5G中方框區(qū)域的放大圖片。OB表示成齒質(zhì) 細(xì)胞，TD表示細(xì)管象牙質(zhì)。如圖5G及圖5Η所示，創(chuàng)傷7日后，出現(xiàn)了具有一定方向性的、 1 2層成齒質(zhì)細(xì)胞(0Β :odontoblast-like cells)，骨樣象牙質(zhì)下形成了細(xì)管象牙質(zhì)(TD tubular dentin) 0如圖5G所示，新生血管已延伸至成齒質(zhì)細(xì)胞層附近，顯示牙髓創(chuàng)傷已治 愈。所述情況說明，在牙髓創(chuàng)傷治愈過程中，此模型有助于研究分析MMP3的表達(dá)情況并推 測其功能。2.牙髓創(chuàng)面中mRNA表達(dá)的變化情況在形成創(chuàng)傷后的0(剛創(chuàng)傷后)、12、M、48、72小時(shí)，分離牙髓組織。從上顎切齒 中采集的正常牙髓組織做對照。從切碎的牙髓組織中，使用TRIzoI(R)試劑(invitrogen) 分離全RNA，取2 μ g的RNA用ReverTra Ace- α (購于東洋紡，東京)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。通過實(shí) BiRT-PCRj^MLightCycler FastS tart DNAMaster SYBR Green I (Roche diagnostics, Pleasanton)對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。在95 "C，10秒、62 "C 15秒、72 "C 8秒條件下，以經(jīng) LightCycler FastStart DNA MasterSYBR Green I (Roche diagnostics, Mannheim)標(biāo)記的 β-肌動(dòng)蛋白(3-actin)、MMPl、MMP2、MMP3、MMP9、MMP10、MMP14、VEGF、CXCR4、SDFl 為 引物(如表1所示)，在LightCycler(Roche Diagnostics)中進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR擴(kuò)增。根 據(jù)GenBank中大鼠基因序列來設(shè)計(jì)引物。根據(jù)對解鏈曲線的分析和PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果， 來確認(rèn)擴(kuò)增片段的大小，另外，將各自的RT-PCR產(chǎn)物亞克隆至pGEM-Easy Vector (Τ載體) (Promega, Madison, WI，美國)上，在數(shù)據(jù)庫中確認(rèn)基因序列，從而進(jìn)行PCR產(chǎn)物特異性分 析。β-actin值標(biāo)準(zhǔn)化后，用與大鼠切齒牙髓正常組織的比值來表示各產(chǎn)物的表達(dá)量。結(jié) 果如圖6A和圖6B所示。基因名#5' ~ K' ^ !i —3*(bp)GenBankβ凋A蛋力Forward ReverseAAGTACCCCATTGAACACGG ATCACAATGCCAGTGGTACG257NM 一031144MMPIForward ReverseTTGATGGACCTGGAGGAAAC GGTACATCAAAGCCCCAATG192EU597482ΜΜΡ2forward ReverseGATGGCAAGGTGTGGTGTG AATCGGAAGTTCTTGGTGTAGG191NM.031054ΜΜΡ3Forward ReverseTGGCAGTGAAGAAGATGCTG GCTTCCCTGTCATCTTCAGC167NMJ 33523ΜΜΡ9Forward ReverseCGCTTGGATAACGAGTTCTCTC GCAGGAGGTCATAGGTCACG163NM.031055AfMPfOForward ReverseACCCCACTCACATTCTCCAG CATCGAAGTGAGCATCTCCA163NMJ 33514ΜΜΡ14Forward ReverseAGTCAGGGTCACCCACAAAG GGTATCCGTCCATCACTTGG204NM-031056VEGFForward ReverseCTACCTCCACCATGCCAAGT ACACAGGACGGCTTGAAGATt83NM.031836CXCR4Forward ReverseTCCGTGGCTGACCTCCTCTT CAGCTTCCTCGGCCTCTGGC210NM.022205SDFIForward ReverseGCTCTGCATCAGTGACGGTA TAATTTCGGGTCAATGCACA184NM.022177DsppForward ReverseGGAACCGCAGCACAGAATGA CACTGTTCCCCTGTGCGTTT199NM—012790濰意溶.解第Forward ReverseGGCGAGATGGTGGCAAGA GGAAGAGGCGGTAGTTAG163NM.OOt 106800表1在創(chuàng)傷產(chǎn)生后的0小時(shí)、12小時(shí)、M小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，利用real-timeRT_PCR 來分析 MMPl、MMP2、MMP3、MMP9、MMP14、VEGF、SDFl、CXCR4mRNA 的表達(dá)情況。如圖 6A 所示， 在大鼠牙髓創(chuàng)傷的治愈過程中，MMP3mRNA的表達(dá)量在切斷牙髓M小時(shí)時(shí)開始上升，其表達(dá) 量是正常牙髓組織的9倍。MMP3 mRNA的表達(dá)量在切斷牙髓M小時(shí)時(shí)開始減少，其表達(dá)量 是正常牙髓組織的4倍，72小時(shí)后是正常牙髓組織的2倍。MMP9 mRNA的表達(dá)量在12小時(shí) 后為牙髓組織的2倍，其表達(dá)水平較低，但在牙髓創(chuàng)傷治愈過程中均維持此低水平表達(dá)。在 牙髓創(chuàng)傷的治愈過程中，MMP1、MMP2、MMP14/MTI-MMPmRNA的表達(dá)量與正常牙髓組織基本相 同，未見表達(dá)水平的變化。MMPlOmRNA在正常和創(chuàng)傷牙髓組織中均未表達(dá)。由此可見，MMP3 的表達(dá)情況與創(chuàng)傷治愈的關(guān)系最為密切。另一方面，如圖6B所示，VEGF的表達(dá)量在經(jīng)治療處置后上升了 3. 5倍，M小時(shí)后， 上升了 5倍，然后其表達(dá)量開始減少，72小時(shí)后，其表達(dá)量與正常牙髓組織相同。SDFl在M 小時(shí)后開始上升以至表達(dá)高峰，其表達(dá)量是正常組織的3. 5倍，表達(dá)水平較低。SDFl配體的受體CXCR4的表達(dá)量在M小時(shí)后達(dá)到正常牙髓組織的3. 5倍。3.牙髓創(chuàng)傷模型中，MMP3、SDF1、CXCR4表達(dá)的局部性在處置牙髓M小時(shí)、72小時(shí)后，用4%的多聚甲醛固定液進(jìn)行灌流固定，然后浸泡 固定過夜。過夜后用OCT復(fù)合物(購于sakura，東京)包埋，制作12μπι厚的冷凍切片，最 后置于 APS Coated slide 上(Matsunami Glass ，大阪)。對 CXCR4 和 MMP3、MMP3 和 BSl-血凝素分別進(jìn)行免疫熒光雙重染色。將切片置于2%的H2A中反應(yīng)20min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，再加入 10mg/ml blocking reagent (Invitrogen corporation, carlsbad，CA, USA)在室溫下反 應(yīng)1小時(shí)以消除非特異性反應(yīng)，然后加入溶于Cangent 1 buffer (東洋紡，大阪)中的一 抗羊抗大鼠CXCR4 (Santa cruze、Santa Cruz，CA) (1 50)，室溫反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成 后，用PBT(PBS，0. 05% Tween20, ρΗ7· 4)洗滌3次，再加入Alexa488標(biāo)記的二抗兔抗羊 IgG(Invitrogen) (1 200)，室溫下反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后，用PBT洗滌3次，最后將切 片置于一抗小鼠抗大鼠MMP3中(第一化學(xué)，富山)(0.5 48/!111)，41過夜。過夜后，用PBT 洗滌3次，再加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，室溫下反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用lOng/ml的 Hoechst 33342 (Sigma,St. Louis,MO,USA)細(xì)胞核染色 lOmin，最后用封片劑 prolong Gold antifade reagent (Invitrogen)封片。如圖 7D-圖 71 所示。為進(jìn)一步研究MMP3與血管之間的關(guān)系，將冷凍切片置于20μ g/ml的proteinase K (Invitrogen)中，室溫下反應(yīng)6min，反應(yīng)結(jié)束后用PBS洗滌3次，再用20 μ g/ml的 Fluorescein Griffonia(Bandeiraea)染色，染色完成后將切片置于 Simplicifolia lectin(BSl-lectin、vector laboratories, Burlingame, CA)中反應(yīng) 15min。上面的 BSl-Iectin是用于對血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮前體細(xì)胞進(jìn)行染色。反應(yīng)結(jié)束后，用PBS洗 滌3次，再按照所述方法對MMP3進(jìn)行熒光染色。陰性對照只使用一抗和二抗。結(jié)果如圖 7A-圖7C所示。在切斷活髓后，MMP3和CXCR4均未表達(dá)。圖7J是活髓切斷M小時(shí)后的牙髓創(chuàng)傷 面，經(jīng)HE染色后的情況。圖7K是活髓切斷M小時(shí)后，牙髓斷面下新生毛細(xì)血管和新生大 血管經(jīng)HE染色后的情況。圖7L是活髓切斷72小時(shí)后，新生毛細(xì)血管和新生大血管經(jīng)HE 染色后的情況。MV表示新生毛細(xì)血管，LV表示新生大血管。圖7A為活髓切斷M新生后，對MMP3及BSl-Iectin進(jìn)行免疫熒光雙重染色后 MMP3的圖片。圖7B為活髓切斷M小時(shí)后，對MMP3及BSl-Iectin進(jìn)行免疫熒光雙重染色 后BSl-Iectin的圖片。圖7C為活髓切斷M小時(shí)后，對MMP3及BSl-Iectin進(jìn)行免疫熒光 雙重染色后，經(jīng)Merge處理的圖片。如圖7A-圖7C所示，活髓切斷M小時(shí)后，在牙髓創(chuàng)面 下，通過BSl-Iectin染色可見新生毛細(xì)血管和新生大血管已延伸至血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管 內(nèi)皮前體細(xì)胞，且在新生血管周圍表達(dá)有MMP3。圖7D為活髓切斷M小時(shí)，MMP3和CXCR4經(jīng)免疫熒光雙重染色后，MMP3的表達(dá)情 況。圖7E為活髓切斷M小時(shí)時(shí)，MMP3和CXCR4經(jīng)免疫熒光雙重染色后，CXCR4的表達(dá)情 況。圖7F為活髓切斷M小時(shí)時(shí)，MMP3和CXCR4經(jīng)免疫熒光雙重染色后，經(jīng)Merge處理的 圖片。圖7G為MMP3和CXCR4經(jīng)免疫熒光雙重染色后，MMP3的放大圖像。圖71為MMP3和 CXCR4經(jīng)免疫熒光雙重染色后，經(jīng)Merge處理的圖片。CXCR4是SDFl配體的受體，在干細(xì)胞 中可表達(dá)，如圖7D-圖71所示，可見CXCR4靠近SDF1，表達(dá)具有局部性。在血管周圍可見MMP3和CXCR4的重復(fù)表達(dá)。圖7M為活髓切斷M小時(shí)后，經(jīng)原位雜交，MMP3mRNA在血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮 前體細(xì)胞中的表達(dá)情況。圖7N為活髓切斷72小時(shí)后，經(jīng)原位雜交，MMP3 mRNA在血管內(nèi) 皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮前體細(xì)胞中的表達(dá)情況。如圖M的箭頭所示，在活髓切斷M小時(shí)時(shí)，經(jīng) 原位雜交，可見血管周圍MMP3 mRNA大量表達(dá)。如圖7N箭頭所示，在活髓切斷72小時(shí)時(shí)， MMP3 mRNA的表達(dá)量減弱。由此可見，牙髓干細(xì)胞遷移至牙髓創(chuàng)傷處，定居在血管周圍，分泌 MMP3，通過旁分泌(paracrine)作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)新生血管的形成。(應(yīng)用實(shí)例2 MMP3在體外對血管內(nèi)皮細(xì)胞和牙髓細(xì)胞的作用)1.MMP3促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用將1000個(gè)源于人臍帶血的血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelialcells、HUVECs) (kurabo公司、大阪)接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，在各種 EBM2 (cambrex Bio Science ffalkersville, Inc. ,ffalkersville,MD,USA)中培養(yǎng)(EBM2 中 可分另Ij添力口 MMP3 (50ng/ml、Chemicon，Temecula, CA)、NNGH (N-IsobutyI-N- (4-methoxyphe nylsulfonyl)) -glycylhydroxamic Acid) 0. 13 μ m, Biomol, Plymouth Meeting, PA)、MMP3 和 NNGH、MMPlO (50ng/ml, R&Dsystems, Minneapolis, MN)等共 4 種 EBM2)。添加 10 μ 1 的 Tetra-color one (Seikagaku Kogyo, Co.，東京)后，分別于 2，12，24，36，48，60 小時(shí)測定 450nm處的吸光度。未接種細(xì)胞的孔值做對照。圖8A為體外，MMP3促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況的圖片。圖8B為體外，MMP3促進(jìn) 血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移情況的圖片。圖8C為體外，MMP3對血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗凋亡作用的圖片。 如圖8A所示，添加MMP3后，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖。在MMP3添加組中，活髓 切斷48小時(shí)的增殖效果與添加2小時(shí)進(jìn)行比較，前者增加了約10倍。在未添加MMP3組中， 活髓切斷48小時(shí)的增殖效果與切斷2小時(shí)比較，約增加了 5倍。所述數(shù)值均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異(P < 0. 01)。另一方面，同時(shí)添加NNGH(MMP3的特異抑制劑)時(shí)，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，MMP3 刺激細(xì)胞增殖的活性均被抑制。添加NNGH組的增殖效果與未添加MMP3組進(jìn)行比較，結(jié)果 顯示二者幾乎無差異。另外，MMP3對HUVEC的增殖促進(jìn)作用與添加VEGF-A(50ng/ml)組基 本相同。2. MMP3對血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移促進(jìn)作用在24 孔 PET 膜(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)上，37°C條件下，進(jìn)行 24 小 時(shí)的Modified Boyden Chamber 實(shí)驗(yàn)。分別在 10ng/ml 的MMP3 或 100ng/ml 的MMP3 或 IOOng/ ml 的 MMP3 與 0. 13 μ mol 的 NNGH 或 50ng/ml 的 MMPlO 或 50ng/ml 的 MMPlO 和 0. 13 μ mol 的 NNGH 或 0. 13 μ mol 的 NNGH 或 50 μ g/ml 的 VEGF-A 存在下，將 5 X IO4 的 HUVEC 置于 Chamber 的上部進(jìn)行培養(yǎng)。0. 02%小牛血清白蛋白(Sigma)做對照。培養(yǎng)完成后，使用胰蛋白酶剝離 遷移至filter下部的HUVEC并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用橡膠刮刀(Scraper)的將殘留在filter 上部未遷移的細(xì)胞刮掉。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用4個(gè)樣品的平均值士SD來表示。結(jié)果如圖8B所示。如圖8B所示，在lOng/ml水平下，MMP3對HUVE的遷移促進(jìn)作用與對照組比較無 統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在lOOng/ml水平下，MMP3的遷移促進(jìn)作用是對照組的3. 5倍且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異(P < 0. 01)。100ng/ml的VEGF對細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用約為對照組的2倍且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異(ρ <0.01)。也就是說，MMP3具有濃度依賴性，確實(shí)具有遷移促進(jìn)作用。另外，若在添加 MMP3的同時(shí)添加NNGH，其促進(jìn)遷移作用受到抑制。
3. MMP3對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用為研究MMP3的凋亡抑制作用，將HUVEC置于EGM2中，用；35_ dish培養(yǎng)3天， 接著在分別加有 50ng/ml 的 MMP3 或 50ng/ml 的 MMP3 和 0. 13 μ mol 的 NNGH 或 50ng/ml 的 MMPlO 或 0. 13 μ mol 的 NNGH 或 50ng/ml 的 VEGF-A 的 EBM-2 中添加 IOOnM 的星型胞 菌素(staurosporine) (Sigma)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。NNGH在添加MMP3的30min前加入。在 Stauroporine存在下，未添加任何成分的EBM-2中培養(yǎng)的細(xì)胞做對照。4小時(shí)后，剝離 HUVEC，在所得細(xì)胞懸液中加入 Annexin V-FITC (Roche)和 Propidium Iodide(Sigma)作用 15min，然后使用flow cytometer JSAN(Bay Bioscience，神戶)測定壞死和凋亡細(xì)胞的比 例。每個(gè)數(shù)據(jù)測量3次，取典型數(shù)據(jù)作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8C所示。如圖8C所示，HUVEC中加入IOOnM的Mauroporine誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡4小時(shí)后，52 %的 細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。同時(shí)添加Mauroporine與MMP3時(shí)，凋亡細(xì)胞的比例減少至20%，與添 加VEGF-A的結(jié)果相同，均出現(xiàn)了凋亡抑制現(xiàn)象。同時(shí)添加NNGH時(shí)，其抑制凋亡的作用受到 抑制。MMP10/Stromelysin-2 是MMP3 的異構(gòu)體。如圖 8A-圖 8C 所示，MMP10/^tromelysin_2 實(shí)驗(yàn)組中未觀察到MMP3實(shí)驗(yàn)組中所見的細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、凋亡抑制現(xiàn)象。4. MMP3誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞分化為成齒質(zhì)細(xì)胞的功能從大鼠上顎切齒中，用酶解法(胰蛋白酶和膠原酶)分離得到的牙髓細(xì)胞，在含 有 100 單位 /ml 的 penicillin G> 100 μ g/ml 的 dtreptomycin (Invtrogen, Carlsbad, CA, USA) >50 μ g/ml 的 Magnesium ascorbyl phosphate (禾口光純藥)禾口 10% (v/v)小牛白血i青 (SAFC Biosciences, Lenexa, Kansas, USA)的 DMEM(Sigma，St. Louis，M0，USA)中培養(yǎng)。二 次傳代細(xì)胞鋪滿(confluent)后，添加 100ng/ml 的 MMP3 或 0. 13 μ mol 的 NNGH 和 50ng/ml 的重組人BMP2。14天或21天后，提取RNA，使用Real time RT-PCR來分析成齒質(zhì)細(xì)胞的分 化標(biāo)志、Dentin Sialophosphotein (Dspp)及 enamelysin 的表達(dá)情況(如表 1 所示)。所 述物質(zhì)的表達(dá)量，用標(biāo)準(zhǔn)β-actin值η與大鼠第二代牙髓細(xì)胞鋪滿(confluent)時(shí)的比值 來表示。添加MMP3實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，14天和21天后，均未觀察到細(xì)胞分化為成齒質(zhì)細(xì) 胞的現(xiàn)象。因此，根據(jù)所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在大鼠牙髓創(chuàng)傷治愈過程中，MMP3可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì) 胞 血管內(nèi)皮前體細(xì)胞向創(chuàng)傷局部遷移、增殖、抗凋亡，同時(shí)在血管新生、象牙質(zhì)及牙髓再生 過程中可能發(fā)揮作用。(應(yīng)用實(shí)例3在大鼠及狗活髓切斷模型中，體內(nèi)MMP3對象牙質(zhì) 牙髓再生促進(jìn)作 用)1.在大鼠活髓切斷模型中添加MMP3切斷大鼠上顎切齒，用生理鹽水清洗斷面，在明膠(gelafusal)內(nèi)添加50ng的 MMP3,然后用于斷面的牙髓表面上。將50ng的MMP3及30nmol的NNGH加至明膠上，用 于斷面牙髓的表面作為實(shí)驗(yàn)對照。最后將粘合劑涂布于表面，再用光聚合型composite resin (Unifillow flow、GC、東京)暫封。接著分別于M小時(shí)、72小時(shí)、7天后制作5 μ m 厚的石蠟切片，然后做HE染色或馬松三色染色，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。新生血管的定量檢測 如下取4顆牙齒分別制作40張切片，經(jīng)MMP3及PBS處理M小時(shí)后，每顆牙齒選取5張 切片用 FluoresceinGriffonia (Bandeirase) Simplicifolia lectin (BSl-Iectin)染色。 在每顆牙齒的5張切片的斷面下方的牙髓組織上，選取面積為0. Imm2的矩形區(qū)域。使用KeyenceBZ-9000熒光顯微鏡(Keyence，東京)的BZ-II Anaalyzer (Keyence)軟件對總面積 為1. 5mm2的lectin陽性區(qū)域進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用4顆牙齒所得數(shù)據(jù)的平均值士SD 來表示。為研究MMP3對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，通過PCNA(proliferating Cell Nuclear Antigen)法，進(jìn)行免疫組化分析。將切斷牙髓M小時(shí)后制作的石蠟切片進(jìn)行脫蠟處理，按 照標(biāo)準(zhǔn)操作方法，使用抗原修復(fù)液(vectorlaboratories，Burlingame, CA)進(jìn)行抗原修復(fù)。 同時(shí)需封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性及非特異性染色。切片中加入抗PCNA抗體(Dako)，4°C 孵育過夜，抗PCNA抗體使用時(shí)需用抗體稀釋液進(jìn)行1 100稀釋。孵育過夜后加入過氧 化物酶標(biāo)記的二抗(ImmPRESS reagent ；Vector Laboratories)室溫孵育 30min。用 DBA Liquid System顯色后，再用蘇木精進(jìn)行對比染色，然后用Olympus Vanox-s顯微鏡(購于 Olympus公司，東京)拍照。增殖細(xì)胞的定量分析方法如下用MMP3和PBS處理M小時(shí)后， 從每個(gè)牙齒的3張石蠟切片斷面下方的牙髓組織上部，取3個(gè)面積為0. Imm2的矩形區(qū)域。 對染色陽性細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、定量分析。細(xì)胞外基質(zhì)的定量分析如下分別取4顆切齒 的5張切片，經(jīng)MMP3、NNGH、PBS處理，7天后，進(jìn)行馬松三色染色。在陽性區(qū)域中，對斷面下 Ornm深)的上部牙髓組織，用BZ-II Analyzer軟件進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用4顆牙齒的 平均值士 SD來表示。通過實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證MMP3在機(jī)體內(nèi)是否能誘導(dǎo)牙髓創(chuàng)傷部位產(chǎn)生新生血管。在大鼠 切齒牙髓處分別加入MMP3、MMP3與NNGH，PBS為陰性對照。圖9A為大鼠活髓切斷后加入 MMP3,24小時(shí)后再經(jīng)BSl-Iectin染色后的圖片。圖9B為大鼠活髓切斷后未使用MMP3J4 小時(shí)后，再經(jīng)BSl-Iectin染色后的圖片。添加MMP3的實(shí)驗(yàn)組與未使用MMP3組進(jìn)行比較， 在M小時(shí)后經(jīng)BSl-Iectin染色，牙髓斷面下形成了大量的新生血管。圖9C為大鼠活髓斷面下的上方牙髓組織，通過使用MMP3使其血管密度增加的定 量顯示圖。如圖9C所示，MMP3使用組與PBS對照組比較，其新生血管的密度增加了 2倍并 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖9D為大鼠活髓切斷處加入MMP3 24小時(shí)后，PCNA的免疫染色圖片。圖9E為 大鼠活髓切斷后未使用時(shí)后，PCNA的免疫染色圖片。MMP3使用組細(xì)胞密度為 98. 5cells/mm2士 17. 7，MMP 3 未使用組(PBS 對照組)為 36. Ocells/mm2士 14. 1。也就是說， MMP3使用組與PBS對照組比較，在其創(chuàng)面下牙髓組織中，PCNA染色陽性的增殖細(xì)胞是對照 組的2. 7倍。另外，在其斷面下方可觀察到大量的PCNA染色陽性細(xì)胞。圖9F為大鼠活髓切斷處加入MMP3 72小時(shí)后的HE染色圖片。圖9G為大鼠活髓 切斷處未使用MMP3，72小時(shí)后的HE染色圖片。如上圖所示，MMP3使用組與未使用組比較， 前者已形成了大量的骨樣象牙質(zhì)。2組均未出現(xiàn)炎癥性細(xì)胞浸潤。圖9H為大鼠活髓切斷處加入MMP3 72小時(shí)后，經(jīng)馬松三色染色的圖片。如圖9H 所示，72小時(shí)后，在MMP3使用組中，新分化的成齒質(zhì)細(xì)胞/骨樣成齒質(zhì)細(xì)胞周圍可觀察到骨 樣象牙質(zhì)的形成。圖91為大鼠活髓切斷處加入MMP3 72小時(shí)后，原位雜交的圖片。如圖91所示，原 位雜交圖片顯示，在骨樣象牙質(zhì)基質(zhì)周圍新近分化的成齒質(zhì)細(xì)胞/骨樣成齒質(zhì)細(xì)胞中已有 DSPP mRNA的表達(dá)。圖9J為大鼠活髓齒切斷72小時(shí)后，未添加MMP3，經(jīng)馬松染色的染色圖。如圖9J 所示，PBS添加組及MMP3周圍觀察不到成齒質(zhì)細(xì)胞/骨樣成齒質(zhì)細(xì)胞。
圖9K為大鼠活髓切斷72小時(shí)后，添加MMP3及NNGH，經(jīng)馬松染色的染色圖。如圖 9K所示，MMP3及NNGH添加組周圍觀察不到成齒質(zhì)細(xì)胞/骨樣成齒質(zhì)細(xì)胞。圖9L為大鼠活髓切斷后未加入MMP37天后經(jīng)馬松三色染色的圖片。如圖9L所示， 未使用MMP3組(PBS對照組)未觀察到成齒質(zhì)細(xì)胞/骨樣成齒質(zhì)細(xì)胞。圖9M為大鼠活髓切斷后加入MMP3和NNGH 7天后經(jīng)馬松三色染色的圖片。如圖 9M所示，在使用MMP3和NNGH組中，未見成齒質(zhì)細(xì)胞/骨樣成齒質(zhì)細(xì)胞的形成。圖9N為大鼠活髓切斷后加入MMP3和NNGH 72小時(shí)后，膠原蛋白基質(zhì)增加情況的 圖片。如圖9N所示，72小時(shí)后，在 斷面下象牙質(zhì)基質(zhì)的形成方面，MMP3使用組與PBS對照 組比較，前者增加了 3. 8倍并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0. 01)。圖90為大鼠活髓切斷后加入MMP3 7天后，膠原蛋白基質(zhì)增加情況的圖片。如 圖90所示，NNGH添加組與PBS對照組比較，象牙質(zhì)基質(zhì)形成受到抑制且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P < 0. 01)。所述現(xiàn)象可能是由于MMP3可促進(jìn)修復(fù)性象牙質(zhì)的形成，后者又會(huì)促進(jìn)新生血管 的形成，而不能直接促進(jìn)成齒質(zhì)細(xì)胞的分化。2.在狗活髓切斷模型中加入MMP3的情況將狗上顎臼齒活髓切斷后，用5%的亞氯酸鈉和3%過氧化氫交替清洗斷面后再 用生理鹽水清洗斷面，把加有IOOng MMP3的明膠涂于牙髓斷面上。接著填充磷酸粘固粉， 再將粘合劑涂布于表面，最后用光聚合型composite resin暫封。14天后拔牙，在4%多聚 甲醛固定液中4°C浸泡、過夜固定后，4°C下在10%蟻酸中脫鈣1周。制作標(biāo)本縱斷面5μπι 厚的石蠟切片，經(jīng)HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察象牙質(zhì)的形成情況，結(jié)果如圖IOA-圖IOE 所示。圖IOA為狗上顎臼齒活髓切斷后添加ΜΜΡ3，第14天時(shí)，顯示修復(fù)性象牙質(zhì)(tertiary dentin)形成的顯微照片。OD代表骨樣象牙質(zhì)。圖IOB為狗上顎臼齒活髓切斷后添加MMP3， 第14天時(shí)修復(fù)性象牙質(zhì)形成的高倍顯微照片。圖IOC為狗上顎臼齒活髓切斷后添加MMP3， 第14天時(shí)修復(fù)性象牙質(zhì)形成的超高倍顯微照片。圖IOD為狗上顎白齒活髓切斷后PBS控 制時(shí)第14天時(shí)的顯微照片。圖IOE為狗上顎臼齒活髓切斷后加入PBS控制時(shí)第14天時(shí)的 高倍顯微照片。如圖IOA-圖IOC所示，在MMP3添加組中，牙髓斷面附近可見大量增殖細(xì)胞，其上 部可見大量修復(fù)性象牙質(zhì)的形成。可是在PBS對照組中，如圖IOD和圖IOE所示，未見修復(fù) 性象牙質(zhì)的形成。(應(yīng)用實(shí)例4在狗牙髓炎模型中，象牙質(zhì)·牙髓的再生)將發(fā)生牙髓炎的狗上顎白齒活髓切斷后，把棉球置于牙髓斷面上，在開放狀態(tài)下 放置M小時(shí)。接著用5%亞鹽酸納溶液和3%的過氧化氫溶液交替清洗牙髓斷面，然后用 生理鹽水清洗，洗凈后，把加有100ngMMP3的明膠涂于牙髓斷面上。接著填充磷酸粘固粉， 再將粘合劑涂布于表面，最后用光聚合型composite resin暫封。14天后拔牙，4°C浸泡固 定過夜，4°C下在10%蟻酸中脫鈣1周。脫鈣完成后，制作5μπι厚的石蠟切片、進(jìn)行HE染 色，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察修復(fù)性象牙質(zhì)的形成情況，結(jié)果如圖IlA-圖IlD所示。圖IlA 為在患有牙髓炎的狗上顎臼齒中加入ΜΜΡ3，14天后，顯示炎癥治愈情況的顯微照片。圖IlB 為患有牙髓炎的狗上顎臼齒中加入ΜΜΡ3，14天后，顯示炎癥治愈情況的高倍顯微照片。圖 IlC為患有牙髓炎的狗上顎臼齒中PBS控制時(shí)14天后的顯微照片。圖IlD為患有牙髓炎的 狗上顎臼齒中PBS控制時(shí)14天后的高倍顯微照片。
如圖IlA和圖IlB所示，在MMP3添加組中，牙髓的炎癥程度非常輕，在牙髓斷面附 近可見細(xì)胞增殖，同時(shí)MMP3還促進(jìn)了新生血管的形成。另外，還可觀察到一些修復(fù)性象牙 質(zhì)的形成。而在PBS對照組中，如圖IlC和圖IlD所示，炎癥情況未見好轉(zhuǎn)。因此，本發(fā)明提 供的藥劑和牙科材料不僅具有促進(jìn)損傷牙髓再生的功效，同時(shí)對牙髓炎還具有抗消炎、鎮(zhèn) 靜作用，促進(jìn)新生血管的形成以及牙髓再生的作用。牙髓出現(xiàn)創(chuàng)傷與牙髓炎出現(xiàn)炎癥是兩 種不同的狀態(tài)。在創(chuàng)傷(機(jī)械性創(chuàng)傷)治療時(shí)不會(huì)發(fā)生感染，局部炎癥細(xì)胞浸潤一旦開始， 創(chuàng)傷組織則趨向治愈。另一方面，由牙髓炎引起的炎癥具有感染癥狀，為排除機(jī)體異物，機(jī) 體的免疫防御系統(tǒng)被啟動(dòng)，根據(jù)感染物質(zhì)的質(zhì)和量，引發(fā)了以嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞為首 的炎癥性細(xì)胞浸潤。牙髓組織的血管處于擴(kuò)張狀態(tài)，毛細(xì)血管的通透性增加。毛細(xì)血管通 透性的增加，血液成分會(huì)滲出(炎癥性滲出)，結(jié)果引起間質(zhì)壓力增高。進(jìn)而，免疫細(xì)胞產(chǎn)生 的炎癥介質(zhì)、蛋白酶組成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，引起進(jìn)一步的炎癥惡化及組織壞死。在牙髓因創(chuàng) 傷產(chǎn)生的炎癥和牙髓炎引起的炎癥二種情況下，二者炎癥性介質(zhì)的表達(dá)情況是不同的。(應(yīng) 用實(shí)例5 穴加工硅酮膜的成齒質(zhì)細(xì)胞的分化)將機(jī)體親和性高、具有氧透過性的硅酮(silicone)膜的表面進(jìn)行等離子化 (plasma)處理，在其表面制成寬7 μ m、深7 μ m、節(jié)距(pitch) 20 μ m的小孔(參照圖IA 圖1C)，然后進(jìn)行膠原蛋白涂層(Collagen Coat)處理。將源于豬牙髓的⑶31_ ;OT146_SP 細(xì)胞高密度地吸附于硅酮膜上，然后在含有10%小牛血清、50yg/ml的抗壞血酸的 Dy lbecco' s Modified Eagle Medium(DMEM)培養(yǎng)基培養(yǎng)12小時(shí)。培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)如 圖12A所示。圖12A為附著在凹面硅酮膜載體上的源于豬的⑶31_;⑶146_SP細(xì)胞，培養(yǎng)12 小時(shí)后，相差顯微鏡觀察的照片。培養(yǎng)完成后，在Container中注滿培養(yǎng)基，使用氟樹脂封 閉，然后從外部對膜表面進(jìn)行單方向垂直加壓，加壓時(shí)，弱加壓操作(引起弱壓力刺激)與 強(qiáng)加壓操作(引起強(qiáng)壓刺激)分別進(jìn)行6小時(shí)，弱加壓操作和強(qiáng)加壓操作的頻率分別為每 分鐘加壓6次和每分鐘加壓10次以上。另外，牙髓⑶3Γ ；⑶146—SP細(xì)胞的采集方法如下將豬牙髓組織摘除后利用膠 原酶解法(Nakashima M. Archs oral Biol. 36 (9)，655-663，1991)酶解、分離細(xì)胞。細(xì)胞 分離后，用流式細(xì)胞儀，通過⑶31和⑶146抗體從強(qiáng)烈排出Hoechst 33342的組分(Side Population(SP))中分選出CD31_ ;CD146_SP細(xì)胞。分選后的細(xì)胞接種至coated collagen dish 上，在添加 10 % 小牛血清、insulin-likegrowth factor-1 (IGF-I)和 Epidermal Growth factor (EGF)的 EBM2 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。圖12B為培養(yǎng)2天后，顯示β -actin、Dspp、Enamelysin的mRNA表達(dá)情況 的圖片。如圖12B所示，培養(yǎng)2天時(shí)，膜上的細(xì)胞排列緊密，Enamelysin和Dentin sialophosphoprotein (Dspp)等的mRNA已表達(dá)，已分化誘導(dǎo)為成齒質(zhì)細(xì)胞。尤其是經(jīng)弱加 壓刺激處理過的細(xì)胞，能有效地對其進(jìn)行分化誘導(dǎo)。產(chǎn)業(yè)利用價(jià)值本發(fā)明具有很好的消炎鎮(zhèn)靜作用，對于發(fā)生炎癥齲齒的牙髓炎也具有能適當(dāng)恢復(fù) 牙髓功能的作用。另外，因本發(fā)明具有很好的促進(jìn)血管新生、牙髓再生及象牙質(zhì)形成作用， 所以，完全可以用于創(chuàng)傷性象牙質(zhì)的治療、修復(fù)領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種用于治療牙髓炎和/或促進(jìn)象牙質(zhì)形成的藥劑，其特征在于，含有有效成分，其 中，該有效成分至少含有具有基質(zhì)金屬蛋白酶-3活性的蛋白質(zhì)以及基質(zhì)金屬蛋白酶-3前 體蛋白中的任意一種。
2.如權(quán)利要求1所述的藥劑，其特征在于，有效成分的含量比例為12ng/ml IOOOng/ ml，其中，該有效成分至少含有具有基質(zhì)金屬蛋白酶-3活性的蛋白質(zhì)以及基質(zhì)金屬蛋白 酶-3前體蛋白中的任意一種。
3.一種牙科材料，其特征在于，含有有效成分，其中，該有效成分至少包括具有基質(zhì)金 屬蛋白酶-3活性的蛋白質(zhì)以及基質(zhì)金屬蛋白酶-3前體蛋白中的任意一種。
4.如權(quán)利要求3所述的牙科材料，其特征在于，含有機(jī)體親和性載體。
5.如權(quán)利要求4所述的牙科材料，其特征在于，上述載體的一側(cè)縱向排列多個(gè)同一指 向的凹形結(jié)構(gòu)，此載體系由氧透過性及/或物質(zhì)透過性的材料制成的膜狀載體。
6.如權(quán)利要求4所述的牙科材料，其特征在于，所述載體至少含有下列中的任意一種 膠原蛋白、人造蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖、明膠、水凝膠、纖維素、磷酸膽堿、透明質(zhì)酸、幾丁 質(zhì)、氨基葡萄糖、纖連蛋白、海藻酸、硫酸乙酰肝素、肝素、層粘連蛋白、磷酸鈣、羥基磷灰石、 β-TCP、多聚乳酸、聚乙醇酸、DL-聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚乙二醇、多晶硅、聚已酸 內(nèi)酯、碳酸鈣、鈦、金、陶瓷、硅樹脂、以及硅水凝膠。
7.如權(quán)利要求3所述的牙科材料，其特征在于，至少還含有牙髓細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、牙 髓前體細(xì)胞、可分化為牙髓細(xì)胞的細(xì)胞、成齒質(zhì)細(xì)胞以及可分化為成齒質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞中的 任意一種。
8.如權(quán)利要求7所述的牙科材料，其特征在于，細(xì)胞含量在1X IO3個(gè)/ μ 1 1 X IO6個(gè) /μ ι之間，其中，該細(xì)胞至少含有所述牙髓細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、牙髓前體細(xì)胞、可分化為牙髓 細(xì)胞的細(xì)胞、成齒質(zhì)細(xì)胞以及可分化為成齒質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞中的任意一種。
9.如權(quán)利要求3所述的牙科材料，其特征在于，還含有血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮前體 細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求3所述的牙科材料，其特征在于，還含有上皮細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求3所述的牙科材料，其特征在于，還含有象牙質(zhì)基質(zhì)。
12.如權(quán)利要求3所述的牙科材料，其特征在于，有效成分的含量比例為12ng/ml lOOOng/ml，其中，該有效成分至少含有具有基質(zhì)金屬蛋白酶-3活性的蛋白質(zhì)以及基質(zhì)金 屬蛋白酶-3前體蛋白中的任意一種。
13.如權(quán)利要求7所述的牙科材料，其特征在于，所述牙髓干細(xì)胞至少包含牙髓SP細(xì) 胞、⑶3Γ ；⑶146-SP細(xì)胞、⑶M+細(xì)胞、⑶105+細(xì)胞、⑶150+細(xì)胞中的任意一種。
14.一種用于治療牙髓炎以及/或促進(jìn)象牙質(zhì)形成的藥劑的有效成分的篩選方法，在 牙髓干細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞中添加被檢驗(yàn)化合物，然后測定牙髓干細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞中 的基質(zhì)金屬蛋白酶-3編碼基因的表達(dá)量；牙髓干細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞中沒有添加被檢驗(yàn) 化合物時(shí)，測定基質(zhì)金屬蛋白酶-3編碼基因的表達(dá)量；將兩者基質(zhì)金屬蛋白酶-3編碼基因 的表達(dá)量進(jìn)行比較，以將基質(zhì)金屬蛋白酶-3編碼基因表現(xiàn)量所增加的被檢驗(yàn)化合物作為 所述藥劑的有效成分進(jìn)行選擇。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于治療牙髓炎和/或促進(jìn)象牙質(zhì)形成的牙科材料。根據(jù)本發(fā)明的牙科材料至少含有具有基質(zhì)金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase，MMP-3)活性的蛋白質(zhì)以及基質(zhì)金屬蛋白酶-3前體蛋白(即酶原)的任意一種；另外，根據(jù)本發(fā)明的牙科材料含有機(jī)體親和性載體；根據(jù)本發(fā)明的牙科材料中至少含有牙髓細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、牙髓前體細(xì)胞、能分化為牙髓細(xì)胞的細(xì)胞、成齒質(zhì)細(xì)胞(odontoblast)以及能分化為成齒質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞的任意一種。
文檔編號G01N33/50GK102046194SQ20098011224
公開日2011年5月4日 申請日期2009年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月7日
發(fā)明者中島美砂子, 中村洋 申請人:獨(dú)立行政法人國立長壽醫(yī)療研究中心