專利名稱：微生物檢測(cè)和計(jì)數(shù)的制作方法
微生物檢測(cè)和計(jì)數(shù)本發(fā)明涉及檢測(cè)和計(jì)數(shù)樣品中物種嗜肺軍團(tuán)桿菌(Legionellapneumophila)存 活微生物的方法。本發(fā)明也包括適用于此方法的試劑盒。此方法和試劑盒使存活微生物的 定量更快速。軍團(tuán)桿菌(Legionella)細(xì)菌在潮濕或濕潤(rùn)環(huán)境例如土壤和非海水生生境中普遍 存在。也可以在溫水和冷水設(shè)施、空調(diào)系統(tǒng)的冷卻塔和加濕器中找到它們。軍團(tuán)桿菌特別是嗜肺軍團(tuán)桿菌是病原體，可引起急性細(xì)菌性肺炎，通常稱為“軍團(tuán) 病”，在感染的個(gè)體中經(jīng)常是致命的。嗜肺軍團(tuán)桿菌的傳統(tǒng)檢測(cè)和計(jì)數(shù)是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行。此方法可使用平板計(jì)數(shù)通 過(guò)測(cè)量可培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行，或應(yīng)用濾過(guò)膜方法測(cè)量微菌落進(jìn)行。這些技術(shù)通過(guò)存活細(xì)菌形 成菌落或微菌落的能力評(píng)估存活細(xì)菌。不幸的是，這些方法通常需要3至10天以形成菌落 或微菌落。當(dāng)用水裝置仍然在運(yùn)行時(shí)，在這期間存在感染人的不可接受的風(fēng)險(xiǎn)。檢測(cè)總軍團(tuán)桿菌微生物的其他方法包括PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)。PCR應(yīng)用 DNA聚合酶通過(guò)體外酶促?gòu)?fù)制擴(kuò)增一段DNA。在技術(shù)進(jìn)行中，生成的DNA作為復(fù)制的模板使 用從而導(dǎo)致DNA模板指數(shù)擴(kuò)增的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。PCR通過(guò)生成百萬(wàn)或更多拷貝的DNA段使單個(gè) 或較少拷貝的一段DNA擴(kuò)增。一般的這些方法在Diederen等人，J Med Microbiol. 2007 Jan ；56 (Ptl) :94_101 中描述。然而PCR的一個(gè)缺點(diǎn)是樣品容易包含聚合反應(yīng)抑制劑，因此不能一致的提供量化 結(jié)果。此外，該技術(shù)依賴于之前的DNA純化步驟，所述步驟可導(dǎo)致DNA的損失從而導(dǎo)致低估 存在的軍團(tuán)桿菌。在一定程度上定量實(shí)時(shí)PCR克服了這些缺點(diǎn)。然而，該技術(shù)不能區(qū)分存 活細(xì)胞和非存活細(xì)胞。另一個(gè)技術(shù)是熒光原位雜交(FISH)，其中熒光物質(zhì)標(biāo)記的寡核苷酸探針滲入細(xì) 菌細(xì)胞。其中核糖體核酸(rRNA)具有針對(duì)探針的正確序列即靶標(biāo)，探針將與其靶標(biāo)吸 附，并且在任意后續(xù)清洗步驟中不被去除。固定了探針的細(xì)菌之后將發(fā)射熒光信號(hào)。此 熒光信號(hào)可通過(guò)例如流式細(xì)胞術(shù)、固相細(xì)胞術(shù)或表面熒光顯微鏡技術(shù)(epifluorescent microscopy)定量。一般的 FISH 技術(shù)在 Dutil S et al J Appl Microbiol. 2006May ； 100(5) :955-63中描述。然而，單獨(dú)使用FISH技術(shù)可檢測(cè)存活的嗜肺軍團(tuán)桿菌總數(shù)，但不 幸的是該方法無(wú)法專門(mén)鑒定能夠分裂并從而形成菌落的嗜肺軍團(tuán)桿菌細(xì)菌。計(jì)數(shù)存活嗜肺軍團(tuán)桿菌的另一個(gè)方法涉及ChemChrome V6,在 Delgado-Viscogliosi 等，Appl Environ Microbiol. 2005Jul ；71 (7) :4086_96 中描述。此 方法允許量化嗜肺軍團(tuán)桿菌，并能夠區(qū)分存活和非存活細(xì)菌。此方法結(jié)合了用抗體和細(xì)菌 存活標(biāo)記(ChemChrome V6)特異性檢測(cè)軍團(tuán)桿菌細(xì)胞和應(yīng)用表面熒光顯微鏡術(shù)計(jì)數(shù)。然而， 盡管此技術(shù)可區(qū)分存活和非存活細(xì)胞，但不能單獨(dú)鑒定那些形成菌落的細(xì)菌。US 20070218522描述了檢測(cè)和定量存活軍團(tuán)桿菌和其他異養(yǎng)需氧細(xì)菌的方法和 組合物，所述方法包括使用包括吸收性培養(yǎng)基、生長(zhǎng)促進(jìn)和生長(zhǎng)選擇性物質(zhì)的蘸片快速檢 測(cè)和定量軍團(tuán)桿菌微菌落。此技術(shù)不能計(jì)數(shù)損傷的細(xì)菌。EP 1329515涉及檢測(cè)包含過(guò)氧化氫的氣態(tài)環(huán)境中微生物存在的方法，通過(guò)將氣態(tài)環(huán)境與包含丙酮酸鹽的瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸，允許微生物菌落的發(fā)展。一般認(rèn)為涉及在生長(zhǎng)培養(yǎng)基例如營(yíng)養(yǎng)瓊脂板上生長(zhǎng)菌落的技術(shù)更準(zhǔn)確。因此平板 計(jì)數(shù)方法仍然是獲得總活菌數(shù)的優(yōu)選方法。這一般表示將疑為包含微生物的樣品應(yīng)用于包 含固體營(yíng)養(yǎng)來(lái)源或生長(zhǎng)培養(yǎng)基的平板上。這一技術(shù)一般稱為平板接種。提及總活菌數(shù)，我 們的意思是能夠產(chǎn)生觀察者可識(shí)別群體的細(xì)菌總數(shù)。一般的這表示在生長(zhǎng)培養(yǎng)基例如營(yíng)養(yǎng) 瓊脂板表面的可見(jiàn)菌落。然而，環(huán)境中的微生物例如嗜肺軍團(tuán)桿菌可能經(jīng)受一種或多種阻礙微生物在其環(huán) 境條件下生長(zhǎng)和繁殖的脅迫。這些受脅迫的微生物在常規(guī)培養(yǎng)條件下完全不會(huì)分裂或不形 成可見(jiàn)菌落。在環(huán)境中一部分微生物細(xì)胞一般會(huì)承受由于環(huán)境條件例如饑餓、殺生物劑的 存在、熱休克和干燥的壓力。此外，這些細(xì)胞可能處于脆弱的生理狀態(tài)，平板接種微生物技 術(shù)可能加重已經(jīng)受脅迫的微生物的脅迫，原因是大氣中氧氣的存在。此外這可能導(dǎo)致受脅 迫細(xì)菌的人為死亡，從而導(dǎo)致總活菌數(shù)的低估。此外，由于其致病性，平板接種方法導(dǎo)致的存活嗜肺軍團(tuán)桿菌的低估可能是危險(xiǎn) 的。由于在20世紀(jì)70年代已有報(bào)導(dǎo)，應(yīng)當(dāng)使用活性氧族(ROS)的清除劑限制在平 板接種過(guò)程中的氧化應(yīng)激效應(yīng)。這在Speck等人，impair andenumeration of injured coliforms by a plating procedure, ApplMicrobiol 29,549-50 (1975) ；Martin 等 人 Catalase :its effect onmicrobial enumeration. Appl Environ Microbiol 32, 731-4(1976) ；Brewer 等 人 Beneficial effects of catalase or pyruvate in amost-probable-number technique for the detection of Staphylococcusaureus. Appl Environ Microbiol 34,797-800 (1977) ；McDonald 等 人’ Enhanced recovery of injured Escherichia coli by compounds thatdegrade hydrogen peroxide or block its formation. Appl EnvironMicrobiol 45,360-5 (1983) ；Marthi 等 人 Resuscitation effects ofcatalase on airborne bacteria. Appl Environ Microbiol 57,2775-6 (1991) ；Busch 禾口 Donnelly Development of a repair-enrichment brothfor resuscitation of heat-injured Listeria monocytogenes andListeria innocua. Appl Environ Microbiol 58,14-20(1992)；禾口 Dukan 等人，Oxidative stress defense and deterioration of growth-arrestedEscherichia coli cells. J Biol Chem 274, 26027-32(1999)中報(bào)導(dǎo)。然而，在所有上述情況下本發(fā)明的發(fā)明者相信ROS可通過(guò)直接途徑降低，其中化 合物與ROS發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。Berube 等 人， ” Rapid detection and identification ofLegionella pneumophila by membrane immunoassay“ ， Applied andEnvironmental Microbiology, 1989，55，1640-1641描述了嗜肺軍團(tuán)桿菌的檢測(cè)和鑒定，通過(guò)使用單克隆抗體的免疫印跡 方法。(文中)沒(méi)有提供處理?yè)p傷細(xì)菌問(wèn)題的方法。Pine 等人(Role of keto acids and reduced-oxygen-scavengingenzymes in the growth of Legionella species. J Clin Microbiol 23,33-42(1986))的文章描述了 添加酮酸和還原氧(reduced oxygen)清除酶的必要性以優(yōu)化嗜肺軍團(tuán)桿菌的生長(zhǎng)，并建議 在用于此微生物標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)的培養(yǎng)基中使用這些物質(zhì)。
然而單獨(dú)使用酮酸和還原氧清除酶不足以修復(fù)待修復(fù)的受脅迫嗜肺軍團(tuán)桿菌和 使計(jì)數(shù)準(zhǔn)確。當(dāng)使用嗜肺軍團(tuán)桿菌的特異性生長(zhǎng)培養(yǎng)基例如緩沖炭酵母提取物(BCYE)瓊 脂培養(yǎng)基時(shí)尤其如此。事實(shí)上，沒(méi)有關(guān)于用于嗜肺軍團(tuán)桿菌準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基優(yōu)化的 數(shù)據(jù)。因此本發(fā)明的一個(gè)目的是尋找準(zhǔn)確計(jì)數(shù)嗜肺軍團(tuán)桿菌的方法。特別是關(guān)于使用平 板接種技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法。因此根據(jù)本發(fā)明我們提供了在疑為包含所述微生物的樣品中檢測(cè)和計(jì)數(shù)存活微 生物的方法(1)將所述樣品的所述微生物與至少一種修復(fù)化合物和生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸，和(2)培養(yǎng)步驟(1)的產(chǎn)物，和(3)檢測(cè)和定量所述存活微生物，其中微生物物種為嗜肺軍團(tuán)桿菌，其中修復(fù)化合物直接或間接影響代謝以降低微 生物的氧化應(yīng)激。提及氧化應(yīng)激，我們的意思是ROS (內(nèi)源(endogene)產(chǎn)生或外源(exogene)內(nèi)收 (adduction))濃度和微生物易于清除活性中間體或有效修復(fù)所產(chǎn)生損傷能力之間的不平 衡。這些微生物正常代謝途徑的損壞由于自由基和氧化劑例如過(guò)氧化物的形成可引起毒效 應(yīng)，這可導(dǎo)致微生物細(xì)胞組分(例如DNA、蛋白質(zhì)或脂)的損傷。影響微生物的代謝表示在微生物細(xì)胞內(nèi)的天然化學(xué)途徑中引起改變。提及內(nèi)源表示改變是在微生物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的以降低氧化應(yīng)激。這可能是例如在微 生物內(nèi)代謝途徑的改變。這也可包括在微生物細(xì)胞內(nèi)去除R0S。理想的修復(fù)化合物可為或包括至少一種抑制ROS形成或降解ROS的化合物。大體 上這可通過(guò)代謝修飾得到。然而，修復(fù)化合物可為或包括至少一種間接抑制ROS形成或降解ROS的化合物。對(duì) ROS間接施加作用的這樣的化合物可通過(guò)干擾微生物代謝起作用。這樣的化合物可視為間 接內(nèi)源降低R0S，例如在需氧呼吸中。我們已發(fā)現(xiàn)本方法誘導(dǎo)受脅迫嗜肺軍團(tuán)桿菌細(xì)胞的修復(fù)，因此更精確的提供了總 活菌數(shù)。出乎意料的我們還發(fā)現(xiàn)所述方法縮短了需要的培養(yǎng)時(shí)間。大體上我們發(fā)現(xiàn)所述方 法可將培養(yǎng)時(shí)間縮短幾小時(shí)，在有些情況下至少1天。在一些情況下本發(fā)明的方法和傳統(tǒng) 方法相比可減少培養(yǎng)時(shí)間達(dá)幾天，例如達(dá)5天。出乎意料的我們還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法可導(dǎo)致干擾微生物的降低，即那些嗜肺軍團(tuán)桿 菌以外的微生物。本發(fā)明方法理想的包含將受脅迫嗜肺軍團(tuán)桿菌微生物細(xì)胞與至少一種抑制ROS 形成和/或降低ROS和/或去除ROS的化合物接觸，這將誘導(dǎo)受脅迫細(xì)胞的修復(fù)。在收集樣品后，嗜肺軍團(tuán)桿菌微生物可與修復(fù)化合物直接接觸。因此用來(lái)收集認(rèn) 為包含微生物的水樣品的容器可已經(jīng)包含修復(fù)化合物。可選的，當(dāng)已收集包含嗜肺軍團(tuán)桿 菌的水樣品后，可使用包含修復(fù)化合物的稀釋水稀釋以用于分析。另外可選的，任選已被稀 釋樣品，可與包含修復(fù)化合物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸或修復(fù)化合物可在微生物和生長(zhǎng)培養(yǎng)基接 觸后應(yīng)用。本發(fā)明的一種形式理想的包含將所述樣品和包含所述修復(fù)化合物的修復(fù)培養(yǎng)基，優(yōu)選非選擇性修復(fù)培養(yǎng)基接觸，之后再與生長(zhǎng)培養(yǎng)基，優(yōu)選選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸。優(yōu)選的 修復(fù)培養(yǎng)基為液體，更優(yōu)選的為肉湯(broth)。當(dāng)修復(fù)培養(yǎng)基為液體時(shí)這被合適的稱為液體 修復(fù)法。一般的在液體修復(fù)法中首先將樣品引入包含修復(fù)化合物的液體培養(yǎng)基。理想的液 體修復(fù)法允許受脅迫細(xì)菌在非選擇性液體培養(yǎng)基中修復(fù)。優(yōu)選的液體修復(fù)法可應(yīng)用肉湯作 為液體培養(yǎng)基。大體上包含微生物的液體培養(yǎng)基之后轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)培養(yǎng)基。受脅迫的微生物 或者在轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)培養(yǎng)基之前已修復(fù)，或者在與生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸時(shí)修復(fù)。更優(yōu)選的生長(zhǎng)培 養(yǎng)基為選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基。一般的將包含微生物的液體培養(yǎng)基鋪板在選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基平 板上，例如選擇性瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基平板。在一個(gè)可選的優(yōu)選形式中，步驟(1)包含將所述樣品與包含所述修復(fù)化合物的生 長(zhǎng)培養(yǎng)基，優(yōu)選的非選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸，之后再與也包含所述修復(fù)化合物的修復(fù)培養(yǎng) 基接觸。優(yōu)選的修復(fù)培養(yǎng)基為非選擇性修復(fù)培養(yǎng)基，更優(yōu)選的為固體，特別優(yōu)選的為選擇性 瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基。當(dāng)修復(fù)培養(yǎng)基為固體時(shí)這被稱為固體修復(fù)法。一般的固體修復(fù)法包括將 樣品與包含修復(fù)化合物的非選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸。之后可再與包含修復(fù)化合物的選擇性 生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸。在此形式中阻止ROS形成、降低或去除ROS的選擇性成分和單一化合物 或多種化合物將擴(kuò)散進(jìn)入非選擇性培養(yǎng)基中。理想的非選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基可為非選擇性瓊 脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基。合適的在此形式中樣品可涂在任意非選擇性瓊脂培養(yǎng)基上，之后將包含阻 止ROS形成、降低或去除ROS的單一化合物或多種化合物的選擇性瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基覆蓋在 非選擇性瓊脂培養(yǎng)基上。在另一個(gè)可選的形式中樣品可應(yīng)用于已經(jīng)包含修復(fù)化合物的選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基 中。這樣的選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基可為選擇性瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基。樣品的平板接種可如前述進(jìn)行。在另一個(gè)可選的形式中樣品可從水中以氣霧(aerosol)的形式收集。一般的氣霧 位于冷卻塔或空調(diào)中。理想的在根據(jù)本發(fā)明方法檢測(cè)前，水從氣霧中冷凝。在可選的優(yōu)選形 式中步驟(1)包含將所述氣霧中樣品與包含修復(fù)培養(yǎng)基(優(yōu)選的包含所述修復(fù)化合物的非 選擇性修復(fù)培養(yǎng)基)的稀釋水接觸，之后再與也包含所述修復(fù)化合物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸。在本發(fā)明的所有前述形式中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)適于嗜肺軍團(tuán)桿菌的生長(zhǎng)。合適的 生長(zhǎng)培養(yǎng)基類型在文獻(xiàn)中有記載，是技術(shù)人員所熟知的。通常的生長(zhǎng)培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)包括活性 碳和半胱氨酸。優(yōu)選的，選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基為選擇性瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基，更優(yōu)選的為緩沖炭酵母提 取物(BCYE)瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基。BCYE生長(zhǎng)培養(yǎng)基在加入抗生素添加物后變?yōu)檫x擇性的。十 分理想的包含抗生素的BCYE生長(zhǎng)培養(yǎng)基被稱為GVPC(甘氨酸、萬(wàn)古霉素、多粘菌素B和放 線酮)。平板接種方法在文獻(xiàn)中有記載，是技術(shù)人員所熟知的。一般的方法包括應(yīng)用一定 量的這些水樣品于培養(yǎng)皿中的瓊脂凝膠上。這可稱為培養(yǎng)皿法或瓊脂板接種法。瓊脂板接 種的目的是將疑為包含微生物的等分試劑，一般是100μ 1水(稱為細(xì)菌懸液)涂在培養(yǎng)皿 中的固體培養(yǎng)基上?？墒褂貌Ａе榛蚣?xì)胞刮刀將細(xì)菌懸液涂在瓊脂板上。在涂板后，大部 分液體被瓊脂吸收，一薄層細(xì)菌保留在瓊脂表面。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，細(xì)菌以菌落形式在瓊脂表面生 長(zhǎng)。培養(yǎng)在最適合微生物的溫度下進(jìn)行，這在文獻(xiàn)中有記載，是技術(shù)人員所熟知的。一般的 溫度在30°C和50°C之間，例如約37°C。修復(fù)化合物應(yīng)當(dāng)以降低微生物氧化應(yīng)激的有效量加入。優(yōu)選的為降低或基本上去
6除微生物細(xì)胞中ROS的有效量。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選形式中修復(fù)化合物至少包括巰基乙酸或其鹽。理想的巰基乙 酸為巰基乙酸鹽的形式，通常為巰基乙酸鈉鹽的形式。巰基乙酸或鹽外源清除R0S。優(yōu)選的 培養(yǎng)基中存在的巰基乙酸或鹽的量為0. 01和重量濃度之間(以巰基乙酸鹽計(jì)算)。在另一個(gè)本發(fā)明的優(yōu)選形式中修復(fù)化合物包括至少一種選自過(guò)氧化氫酶、抗壞血 酸(或其鹽)、偏亞硫酸(metabisulphurous acid)(或其鹽)、二甲亞砜(DMSO)、3，3'-硫 代二丙酸(TDPA)(或其鹽)和丙酮酸(或其鹽)的化合物。已發(fā)現(xiàn)這些化合物均可降低或 去除R0S。當(dāng)使用抗壞血酸和丙酮酸時(shí)，優(yōu)選的培養(yǎng)基中存在的抗壞血酸和丙酮酸為0. 01 和重量濃度之間，以鈉鹽計(jì)算。DMSO優(yōu)選的以0. 01和0. 間的重量濃度使用，過(guò)氧化 氫酶理想的為0. 001至0. 重量濃度范圍內(nèi)。丙酮酸，特別是丙酮酸鈉，是特別優(yōu)選的。在本發(fā)明的更優(yōu)選的形式中修復(fù)培養(yǎng)基或生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含巰基乙酸(或鹽)和至 少一種選自過(guò)氧化氫酶、抗壞血酸(或其鹽)、偏亞硫酸(metabisulphurous acid)(或其 鹽)、二甲亞砜(DMS0)、3，3'-硫代二丙酸(TDPA)(或其鹽)和丙酮酸(或其鹽)的化合 物這二者。巰基乙酸鹽和丙酮酸鈉組合是特別優(yōu)選的。在修復(fù)化合物可能為或包括至少一種間接抑制ROS形成和/或降解ROS的化合物 的情況下，所述化合物可通過(guò)干擾微生物代謝導(dǎo)致降低的ROS水平。一般的這些化合物包 括氨基酸或其鹽。特別優(yōu)選的化合物為谷氨酸或谷氨酸鹽。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的形式中修復(fù)化合物可包括谷氨酸或谷氨酸鹽，特別是鈉 鹽。大體上谷氨酸或谷氨酸鹽的量在0. 01和5%重量濃度之間，以鈉鹽計(jì)算。特別優(yōu)選的，修復(fù)化合物可包括丙酮酸或丙酮酸鹽(特別是鈉鹽)和谷氨酸或谷 氨酸鹽(特別是鈉鹽)二者。丙酮酸或丙酮酸鹽和谷氨酸或谷氨酸鹽組合似乎可誘導(dǎo)協(xié)同 效應(yīng)，因?yàn)楹蛦为?dú)使用其中任意一種化合物相比，上述組合可得到可培養(yǎng)軍團(tuán)桿菌的更高 估計(jì)(和因此更準(zhǔn)確的估計(jì))。此外我們發(fā)現(xiàn)此組合在嗜肺軍團(tuán)桿菌生長(zhǎng)中可導(dǎo)致遲滯期 的縮短，特別是在液體培養(yǎng)基中。液體培養(yǎng)基中的這一遲滯期的縮短導(dǎo)致在瓊脂板上獲得 可見(jiàn)菌落需要的時(shí)間縮短。理想的丙酮酸鹽和谷氨酸鹽的量如前述。特別優(yōu)選的谷氨酸鹽比丙酮酸鹽的比率 在1 1和50 1范圍之間，特別的在5 1和20 1之間，更特別的在7 1和15 1 之間。已知谷氨酸鹽不是抗氧化劑。然而，似乎間接地谷氨酸鹽可降低在生長(zhǎng)中自然形 成的ROS的內(nèi)源產(chǎn)生，或其對(duì)大分子的影響(氧化)。沒(méi)有理論局限，推測(cè)谷氨酸改變了軍團(tuán)桿菌的代謝以提高丙酮酸鹽的作用，此對(duì) 軍團(tuán)桿菌的代謝干擾間接抑制了 ROS的形成和/或降解細(xì)胞內(nèi)R0S。在修復(fù)培養(yǎng)基和/或生長(zhǎng)培養(yǎng)基中包括酮酸和/或還原氧清除酶也是理想的。根 據(jù)本發(fā)明，不認(rèn)為酮酸和/或還原氧清除酶是修復(fù)化合物。然而，包括一種或兩種這些化合 物與任意上述修復(fù)化合物或其組合共同使用是有益的。檢測(cè)和定量存活微生物可通過(guò)文獻(xiàn)記載的任意已知技術(shù)進(jìn)行。一般的這表示計(jì)數(shù) 生長(zhǎng)培養(yǎng)基例如營(yíng)養(yǎng)瓊脂板表面的可見(jiàn)菌落。根據(jù)本發(fā)明的方法使準(zhǔn)確定量測(cè)定嗜肺軍團(tuán)桿菌的存在更容易。此外培養(yǎng)時(shí)間可 顯著縮短。所述方法適用于檢測(cè)任意來(lái)自工業(yè)冷卻水、飲用水和天然水樣品中的嗜肺軍團(tuán)桿菌。本發(fā)明還包含試劑盒，用于更準(zhǔn)確檢測(cè)和計(jì)數(shù)疑為包含所述微生物的樣品中的嗜 肺軍團(tuán)桿菌存活微生物，所述試劑盒包含(1)至少一種修復(fù)化合物，(2)生長(zhǎng)培養(yǎng)基，(3)培養(yǎng)方法(4)檢測(cè)和定量微生物的方法，其中修復(fù)化合物直接或間接影響代謝以降低微生物的氧化應(yīng)激。其中微生物物種為嗜肺軍團(tuán)桿菌，其中修復(fù)化合物直接或間接影響代謝以降低微 生物的氧化應(yīng)激。試劑盒還包含任意有關(guān)本發(fā)明第一個(gè)方面描述的實(shí)施方案。試劑盒適用于以本發(fā)明的方法使用，使嗜肺軍團(tuán)桿菌的計(jì)數(shù)更準(zhǔn)確。以下實(shí)施例舉例說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1 將嗜肺軍團(tuán)桿菌懸液以IO8細(xì)菌/ml終濃度加入5個(gè)包含50ml無(wú)菌磷酸緩沖液 (PBS)的燒瓶中。加入殺生物劑溶液至終濃度在10至30mg/L范圍內(nèi)。一個(gè)燒瓶平行操作 作為無(wú)殺生物劑的對(duì)照。使用的殺生物劑為T(mén)HPS(四羥甲基硫酸磷)。在均勻化后，所有懸液在37士 1°C，黑暗和搖晃下培養(yǎng)60min。在細(xì)菌計(jì)數(shù)前，用 PBS清洗2次(5，OOOxg，IOmin)去除殺生物劑。連續(xù)稀釋后，將相同稀釋液的100 μ 1的2 等分試樣涂在BCYE和添加0. 丙酮酸鹽的BCYE瓊脂板上。結(jié)果顯示于

圖1。圖1顯示了用殺生物劑處理后在BCYE培養(yǎng)基(正方形)和添加 0. 丙酮酸鹽的BCYE培養(yǎng)基(菱形)上的可培養(yǎng)嗜肺軍團(tuán)桿菌的計(jì)數(shù)。殺生物劑的存在 是為了引入微生物脅迫。結(jié)果顯示在丙酮酸鹽存在下，受脅迫的微生物得到高得多的微生 物計(jì)數(shù)。在不存在殺生物劑時(shí)微生物是不受脅迫的。在這種情況下可以看到丙酮酸鹽的存 在與否給出相同的結(jié)果。這證明了在丙酮酸鹽的存在下，受脅迫微生物嗜肺軍團(tuán)桿菌被修 復(fù)，因此提供了更準(zhǔn)確的讀數(shù)。實(shí)施例2 將嗜肺軍團(tuán)桿菌懸液以IO8細(xì)菌/ml終濃度加入1個(gè)包含50ml無(wú)菌磷酸緩沖液 (PBS)的燒瓶中。加入殺生物劑溶液至終濃度15mg/L。使用的殺生物劑為T(mén)HPS(四羥甲基 硫酸磷)。在均勻化后，所有懸液在37士 1°C，黑暗和搖晃下培養(yǎng)60min。在細(xì)菌計(jì)數(shù)前，用 PBS清洗2次(5，OOOxg, IOmin)去除殺生物劑。連續(xù)稀釋后，將相同稀釋液的100 μ 1 2等 分試樣涂在BCYEj^WO. 丙酮酸鹽的BCYEj^WO. 1 %丙酮酸鹽和1 %谷氨酸的BCYE及 添加谷氨酸的BCYE瓊脂板上。結(jié)果顯示于圖2。圖2顯示了標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(BCYE)上得 到的可培養(yǎng)軍團(tuán)桿菌數(shù)和添加本專利描述的2種化合物(丙酮酸鹽和谷氨酸)的培養(yǎng)基上 得到的可培養(yǎng)軍團(tuán)桿菌數(shù)的比率。在用殺生物劑處理后，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(BCYE)中加入丙酮酸鹽導(dǎo)致檢測(cè)的可培養(yǎng) 軍團(tuán)桿菌的增加(在“BCYE+丙酮酸鹽”板上的可培養(yǎng)軍團(tuán)桿菌數(shù)比標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上的可培養(yǎng) 軍團(tuán)桿菌數(shù)高45倍)。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(BCYE)中單獨(dú)加入谷氨酸導(dǎo)致在用殺生物劑處理后檢測(cè)的可培養(yǎng)軍團(tuán)桿菌減少(χθ.2)。令人驚訝的，加入丙酮酸鹽和谷氨酸導(dǎo)致可培養(yǎng)軍團(tuán) 桿菌的增加，比在加入單獨(dú)化合物中觀察到的菌數(shù)更多。這證明在丙酮酸鹽的存在下，谷氨 酸的加入使受脅迫微生物嗜肺軍團(tuán)桿菌進(jìn)一步修復(fù)，因此提供了更準(zhǔn)確的讀數(shù)。實(shí)施例3 將嗜肺軍團(tuán)桿菌懸液以3X IO2細(xì)菌/L終濃度加入1個(gè)包含IL無(wú)菌磷酸緩沖液 (PBS)的燒瓶中。經(jīng)過(guò)濾濃縮后，將相同懸液的100 μ 1 2等分試樣涂于GVPC (GVPC)和添加 0. 丙酮酸鹽和谷氨酸的GVPC(GVPC+X)瓊脂板上。在37°C培養(yǎng)0、3、5和10天后計(jì) 數(shù)菌落數(shù)。結(jié)果顯示于圖3。在培養(yǎng)3天后，當(dāng)GVPC添加培養(yǎng)基上已經(jīng)能夠計(jì)數(shù)300個(gè)菌 落時(shí)，GVPC培養(yǎng)基上沒(méi)有可見(jiàn)菌落。在培養(yǎng)5和10天后，GVPC培養(yǎng)基上能夠計(jì)數(shù)100個(gè)菌 落，而GVPC添加培養(yǎng)基上能夠計(jì)數(shù)300個(gè)菌落。通過(guò)使用添加培養(yǎng)基，在標(biāo)準(zhǔn)GVPC可計(jì)數(shù) 前至少2天可檢測(cè)到菌落。實(shí)施例4 包含可培養(yǎng)軍團(tuán)桿菌的環(huán)境樣品經(jīng)過(guò)濾濃縮。濃縮后，將相同懸液的100μ 1 2等 分試樣涂于GVPC (GVPC)和添加0. 丙酮酸鹽和谷氨酸的GVPC(GVPC+X)瓊脂板上。在 37°C培養(yǎng)5天后計(jì)數(shù)菌落數(shù)。在此情況下，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(GVPC)上沒(méi)有可計(jì)數(shù)的軍團(tuán)桿菌 菌落，而可計(jì)數(shù)17個(gè)非軍團(tuán)桿菌菌落。相對(duì)的，在添加培養(yǎng)基(GVPC+X)上至少可計(jì)數(shù)10 個(gè)軍團(tuán)桿菌菌落，而僅有2個(gè)非軍團(tuán)桿菌菌落。結(jié)果顯示于圖4。實(shí)施例5 將嗜肺軍團(tuán)桿菌懸液以IO8細(xì)菌/ml終濃度加入1個(gè)包含50ml無(wú)菌磷酸緩沖液 (PBS)的燒瓶中。加入殺生物劑溶液至終濃度15mg/L。使用的殺生物劑為T(mén)HPS(四羥甲基 硫酸磷)。在均勻化后，所有懸液在37士 1°C，黑暗和搖晃下培養(yǎng)60min。在細(xì)菌計(jì)數(shù)前，用 PBS清洗2次(5，OOOxg, IOmin)去除殺生物劑。連續(xù)稀釋在PBS或添加0. 5%丙酮酸鹽的 PBS中進(jìn)行。從各個(gè)稀釋液(添加或不添加丙酮酸鹽)中，將ΙΟΟμΙ 2等分試樣涂于BCYE 和添加0. 丙酮酸鹽的BCYE瓊脂板。結(jié)果顯示于圖5。圖5顯示了在PBS(刮痕條)或 PBS+丙酮酸鹽(深色條)中稀釋后，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(BCYE)上得到的可培養(yǎng)嗜肺軍團(tuán)桿菌數(shù)和 添加丙酮酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上得到的可培養(yǎng)嗜肺軍團(tuán)桿菌數(shù)。如已經(jīng)觀察到的，當(dāng)僅用PBS作為稀釋液時(shí)，在用殺生物劑處理后，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基 (BCYE)中加入丙酮酸鹽導(dǎo)致檢測(cè)的可培養(yǎng)嗜肺軍團(tuán)桿菌的增加。令人驚訝的，在稀釋液中 加入丙酮酸鹽不僅導(dǎo)致在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(BCYE)上檢測(cè)的可培養(yǎng)嗜肺軍團(tuán)桿菌的增加，而且 導(dǎo)致在添加丙酮酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上檢測(cè)的可培養(yǎng)嗜肺軍團(tuán)桿菌的增加。這證明稀釋液中 的丙酮酸鹽使受脅迫的嗜肺軍團(tuán)桿菌進(jìn)一步修復(fù)。
權(quán)利要求
1.在疑為包含存活微生物的樣品中檢測(cè)和計(jì)數(shù)所述微生物的方法(1)將所述樣品的所述微生物與至少一種修復(fù)化合物和生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸，和(2)培養(yǎng)步驟⑴的產(chǎn)物，和(3)檢測(cè)和定量所述存活微生物，其中微生物物種為嗜肺軍團(tuán)桿菌，其中修復(fù)化合物直接或間接影響代謝以降低微生物 的氧化應(yīng)激。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中修復(fù)化合物為抑制ROS形成和/或降解ROS的化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中步驟(1)包含將所述樣品與包含修復(fù)化 合物的修復(fù)培養(yǎng)基，優(yōu)選的非選擇性修復(fù)培養(yǎng)基接觸，之后再與生長(zhǎng)培養(yǎng)基，優(yōu)選選擇性生 長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中修復(fù)培養(yǎng)基為液體，優(yōu)選的為肉湯。
5.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(1)包含將所述樣品與生長(zhǎng)培養(yǎng)基，優(yōu) 選非選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸，之后再與包含所述修復(fù)化合物的修復(fù)培養(yǎng)基接觸。
6.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中修復(fù)培養(yǎng)基為選擇性修復(fù)培養(yǎng)基，優(yōu)選的為 固體，更優(yōu)選的為選擇性瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
7.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(1)包含將所述樣品與包含所述修復(fù)化 合物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸。
8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中生長(zhǎng)培養(yǎng)基為緩沖炭酵母提取物(BCYE)或 GVPC瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中修復(fù)化合物包含巰基乙酸(或其鹽)。
10.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中修復(fù)化合物包含至少一種選自過(guò)氧化氫酶、 抗壞血酸(或其鹽)、偏亞硫酸(或其鹽)、二甲亞砜(DMS0)、3，3'-硫代二丙酸(TDPA) (或其鹽)和丙酮酸(或其鹽)的化合物。
11.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中修復(fù)化合物包含巰基乙酸(或其鹽)和丙酮 酸(或其鹽)。
12.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中修復(fù)化合物包含谷氨酸(或其鹽)。
13.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中修復(fù)化合物包含谷氨酸(或其鹽)和丙酮酸 (或其鹽)。
14.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中修復(fù)培養(yǎng)基和/或生長(zhǎng)培養(yǎng)基包括酮酸和/ 或還原氧清除酶。
15.試劑盒，用于更準(zhǔn)確檢測(cè)和計(jì)數(shù)疑為包含嗜肺軍團(tuán)桿菌存活微生物的樣品中的所 述微生物，包含(1)至少一種修復(fù)化合物，(2)生長(zhǎng)培養(yǎng)基，(3)培養(yǎng)方法(4)檢測(cè)和定量微生物的方法，其中微生物物種為嗜肺軍團(tuán)桿菌，其中修復(fù)化合物直接或間接影響代謝以降低微生物 的氧化應(yīng)激。
全文摘要
在疑為包含存活微生物的樣品中檢測(cè)和計(jì)數(shù)所述微生物的方法(1)將所述樣品的所述微生物與至少一種修復(fù)化合物和生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸，和(2)培養(yǎng)步驟(1)的產(chǎn)物，和(3)檢測(cè)和定量所述存活微生物，其中微生物物種為嗜肺軍團(tuán)桿菌，其中修復(fù)化合物直接或間接影響代謝以降低微生物的氧化應(yīng)激。本發(fā)明還包含試劑盒，用于更準(zhǔn)確檢測(cè)和計(jì)數(shù)疑為包含所述微生物的樣品中的嗜肺軍團(tuán)桿菌存活微生物。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101998999SQ200980112246
公開(kāi)日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2009年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月4日
發(fā)明者A·杜克雷, S·迪康, Y·弗維 申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司;科學(xué)研究國(guó)家中心