本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雞球蟲病是幾種艾美耳球蟲寄生腸道所引起的一種危害極其嚴(yán)重的全球性寄生蟲病，嚴(yán)重危害雞的生長(zhǎng)發(fā)育，是集約化養(yǎng)雞業(yè)危害最大的疾病之一，每年給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)是致病性最為嚴(yán)重的雞球蟲之一，它主要寄生于盲腸及其附近區(qū)域，能引起出血性腸炎，對(duì)雛雞危害最大，嚴(yán)重時(shí)能引起較高的死亡率。目前控制雞球蟲病的方法主要以在飼料中添加抗球蟲藥物預(yù)防為主，但由于抗球蟲藥的長(zhǎng)期使用，雞球蟲耐藥性的產(chǎn)生已成為無法避免的問題，任何一種抗球蟲藥在使用一定時(shí)間后都會(huì)引起球蟲的耐藥性，使得許多抗球蟲藥的防治效果顯著降低，甚至完全失效，即使提高藥物濃度也無濟(jì)于事，仍然爆發(fā)球蟲病，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了無法彌補(bǔ)的損失。

鈣元素廣泛的存在于自然界和各種生物體內(nèi)，而游離態(tài)的Ca²⁺更是在生命活動(dòng)中扮演著極其重要的角色，它幾乎參與了生命體所有的生理生化活動(dòng)。在所有真核生物細(xì)胞中，鈣離子(Ca²⁺)是細(xì)胞內(nèi)一種重要的信號(hào)分子，作為第二信使在許多細(xì)胞和生理功能中發(fā)揮重要的作用。當(dāng)細(xì)胞受到激素或電刺激后，胞漿內(nèi)的Ca²⁺濃度升高，可引起細(xì)胞內(nèi)的一系列生理反應(yīng)。

頂復(fù)器原蟲是一種真核生物，需要入侵宿主細(xì)胞后在宿主細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)、發(fā)育繁殖等，而Ca²⁺在頂復(fù)器原蟲的整個(gè)生活史發(fā)育中起著不可缺少的作用，控制著許多重要生理過程，包括調(diào)控蟲體蛋白的分泌、運(yùn)動(dòng)、分化及入侵和逃逸宿主細(xì)胞等，同樣，Ca²⁺也控制著蟲體在宿主細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育。雖然Ca²⁺在真核生物細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路中發(fā)揮著重要功能，但細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺的濃度是瞬時(shí)變化的，聚集也是非常短暫的。Ca²⁺能否將信號(hào)快速準(zhǔn)確的傳遞給下游分子，取決于與Ca²⁺結(jié)合的蛋白。因此，與Ca²⁺結(jié)合的蛋白在Ca²⁺信號(hào)通路中非常關(guān)鍵。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和鈣離子/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶(calcium/calmodiulin dependent protein kinase，CaMK)是Ca²⁺信號(hào)通路中重要的效應(yīng)分子。但頂復(fù)器原蟲體內(nèi)缺少PKC，僅有少量的CaMK異構(gòu)體，而代替這兩類激酶的是另一類絲/蘇氨酸激酶——鈣依賴蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases，CDPKs),CDPKs是頂復(fù)器原蟲體內(nèi)最豐富的一類Ca²⁺依賴的激酶。CDPKs的全稱是鈣依賴而鈣調(diào)素不依賴的蛋白激酶或類似鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域的蛋白激酶(calmodulin-like domain protein kinases)，CDPKs是一個(gè) 由多基因編碼的大家族,它不同于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的PKC和CaMK。迄今為止，僅在植物、綠藻、纖毛蟲及頂復(fù)器原蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)CDPKs，而在細(xì)菌、真菌、酵母、線蟲和動(dòng)物中尚未發(fā)現(xiàn)。已有研究表明：CDPKs是瘧原蟲和弓形蟲Ca²⁺信號(hào)通路中重要的效應(yīng)分子，不同的CDPKs表達(dá)具有蟲體發(fā)育階段特異性，控制許多至關(guān)重要的Ca²⁺依賴的生理過程，包括微線的分泌、細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué)和運(yùn)動(dòng)復(fù)合體的調(diào)控等，從而影響蟲體的滑移運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞入侵和逃逸、發(fā)育階段的轉(zhuǎn)化、分化繁殖等。

目前對(duì)CDPKs在雞球蟲生活史中的功能還不是很清楚，有待作進(jìn)一步研究，為研發(fā)新治療藥物和研制新型疫苗提供新思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決針對(duì)藥物防治球蟲病極易產(chǎn)生耐藥性的問題急需開發(fā)新型疫苗和新藥的技術(shù)問題，提供一種柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4基因(Et CDPK4)，該Et CDPK4在柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵宿主細(xì)胞過程中起著重要作用，對(duì)開發(fā)防治雞球蟲病的新疫苗或新藥具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

此外，還需要提供一種柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4基因的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):

在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種柔嫩艾美耳球蟲基因，該基因?yàn)槿崮郯蓝蛳x鈣依賴蛋白激酶4基因(Et CDPK4)，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明利用5’RACE和3’RACE首次擴(kuò)增了完整的Et CDPK4基因序列，該序列全長(zhǎng)2499bp(SEQ ID NO.1)，包括5’端的UTR序列，長(zhǎng)185bp，3’端UTR序列，長(zhǎng)511bp，含Ploy(A)尾，ORF長(zhǎng)1803bp(186-1988bp)。其中5’-UTR和3’-UTR，可通過一些調(diào)控因子的結(jié)合來對(duì)該基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。mRNA分子的5’UTR通過其長(zhǎng)度和堿基順序以及二級(jí)結(jié)構(gòu)等來參與表達(dá)調(diào)控。其中5’-UTR主要參與翻譯調(diào)節(jié)，影響轉(zhuǎn)錄后的各個(gè)階段，包括mRNA的穩(wěn)定，折疊和核糖體的相互作用；3’-UTR影響RNA的水平，從而影響翻譯后蛋白的表達(dá)量，因此，5’-UTR和3’-UTR在真核生物基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種重組載體，包含編碼柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4開放閱讀框完整或部分氨基酸序列的核苷酸序列，所述開放閱讀框完整氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述重組載體包括重組克隆載體或重組表達(dá)載體。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種重組蛋白，該重組蛋白是由上述重組載體經(jīng)表達(dá)而制得。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種抗體，該抗體是用上述重組蛋白免疫動(dòng)物而制得。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述柔嫩艾美耳球蟲基因的應(yīng)用，用于制備預(yù)防或治療雞球蟲病的疫苗或藥物。

所述疫苗或藥物通過抑制柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵宿主細(xì)胞而阻斷球蟲生活史來發(fā)揮作用。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述柔嫩艾美耳球蟲基因的應(yīng)用，用于篩選預(yù)防或治療球蟲病的藥物。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述重組蛋白的疫苗。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種作用靶標(biāo)為柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4的抗球蟲藥物。

本發(fā)明柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4基因(Et CDPK4)，是柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)的一個(gè)新基因。免疫熒光定位實(shí)驗(yàn)和體外抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示Et CDPK4與子孢子的入侵相關(guān)，在球蟲子孢子入侵宿主細(xì)胞時(shí)發(fā)揮了重要作用。因此，本發(fā)明的Et CDPK4基因，為開發(fā)抑制子孢子入侵、阻斷球蟲生活史的新疫苗或新藥提供了新思路。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例2的EtCDPK4基因克隆及其原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建結(jié)果圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例3的pCold I-EtCDPK4原核表達(dá)蛋白形式確定以及純化結(jié)果圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例3抗EtCDPK4重組融合蛋白血清的Western Blotting檢測(cè)結(jié)果圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例4的EtCDPK4基因在柔嫩艾美耳球蟲四個(gè)發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄水平高低的比較柱狀圖；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例5的EtCDPK4酶活性的測(cè)定結(jié)果圖；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例6不同Ca²⁺濃度對(duì)EtCDPK4酶活性影響的定性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例6不同Ca²⁺濃度對(duì)EtCDPK4酶活性影響的定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖8是本發(fā)明實(shí)施例7的EtCDPK4的7種特異性抑制劑篩選的定性反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果圖；

圖9是本發(fā)明實(shí)施例7的EtCDPK4的7種特異性抑制劑篩選的定量反應(yīng)的顯著性差異分析圖；

圖10是本發(fā)明實(shí)施例8的Anti-rEtCDPK4兔血清在體外對(duì)柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵DF-1細(xì)胞的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖11是本發(fā)明實(shí)施例9不同時(shí)相、不同階段在子孢子入侵DF-1細(xì)胞時(shí)對(duì)EtCDPK4的免疫熒光定位圖；

圖12是本發(fā)明實(shí)施例10體外酶活篩選出的EtCDPK4特異性抑制劑的子孢子入侵DF-1 細(xì)胞的抑制試驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等譯.第3版，北京：科學(xué)出版社，2002)中所述的方法進(jìn)行。

本發(fā)明以柔嫩艾美耳球蟲為研究對(duì)象，篩選鑒定參與柔嫩艾美耳球蟲入侵宿主細(xì)胞的相關(guān)蛋白。在實(shí)驗(yàn)室前期利用抑制性消減雜交技術(shù)和cDNA微陣列技術(shù)大規(guī)模篩選了子孢子和孢子化卵囊差異表達(dá)基因，獲得了大量的差異表達(dá)基因ESTs的基礎(chǔ)上，選擇了1個(gè)在子孢子階段高表達(dá)基因的EST序列。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)合成5’RACE和3’RACE引物，利用RACE技術(shù)擴(kuò)增含5’UTR和3’UTR，以及ORF的全長(zhǎng)cDNA序列，該序列是柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4基因(Et CDPK4)的全長(zhǎng)cDNA序列。原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了該Et CDPK4蛋白，并通過實(shí)驗(yàn)表明Et CDPK4與子孢子的入侵相關(guān)。

實(shí)施例1 柔嫩艾美耳球蟲Et CDPK4基因全長(zhǎng)cDNA的克隆及分析

1.材料和方法

在實(shí)驗(yàn)室前期利用抑制性消減雜交技術(shù)和cDNA微陣列技術(shù)大規(guī)模篩選了子孢子和孢子化卵囊差異表達(dá)基因，獲得了大量的差異表達(dá)基因ESTs的基礎(chǔ)上，選擇了1個(gè)在子孢子階段高表達(dá)基因的EST序列，與柔嫩艾美耳球蟲基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.genedb.org/Homepage/Etenella)比較發(fā)現(xiàn)，該EST與球蟲基因組數(shù)據(jù)庫中推測(cè)的鈣依賴蛋白激酶家族的鈣調(diào)蛋白激酶(ETH_00010685)100％同源。因此根據(jù)該序列設(shè)計(jì)合成5’RACE和3’RACE引物，利用RACE技術(shù)擴(kuò)增含5’UTR和3’UTR，以及ORF的全長(zhǎng)cDNA序列。按照GeneRacer^TMKit(美國Invitrogen公司)說明書操作步驟將提取柔嫩艾美耳球蟲子孢子總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，制備擴(kuò)增5’RACE和3’RACE的cDNA模板，利用RACE技術(shù)擴(kuò)增基因的全長(zhǎng)cDNA序列。以下表1為5’RACE和3’RACE引物的序列。

表1 獲取EtCDPK4全長(zhǎng)的RACE引物序列

2.結(jié)果

利用RACE引物擴(kuò)增獲得了該基因的5’和3’cDNA末端，將5’和3’RACE PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，與pGEM-T-easy載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑選白色菌落進(jìn)行PCR鑒定，如果擴(kuò)增片段與預(yù)期一致，則送公司測(cè)序。對(duì)于陽性克隆測(cè)序結(jié)果，用DNAstar軟件查找5’和3’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物序列與原EST序列的重疊部分，拼接獲得全長(zhǎng)cDNA序列。該序列全長(zhǎng)2499bp(SEQ ID NO.1)，包括5’端的UTR序列，長(zhǎng)185bp，3’端UTR序列，長(zhǎng)511bp，含Ploy(A)尾，ORF長(zhǎng)1803bp(186-1988bp)，編碼600個(gè)氨基酸(SEQ ID NO.2)。預(yù)測(cè)分子量為68kDa，等電點(diǎn)為6.0。

對(duì)編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析顯示：在302-324位有一個(gè)明顯的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域；無信號(hào)肽；疏水性的分析發(fā)現(xiàn)多肽鏈最大的疏水性為+2.3，最小的疏水性為-2.7；功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)和保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)它既具有一般鈣依賴蛋白激酶家族(CDPKs)成員的共性，即可變區(qū)、催化區(qū)、連接區(qū)和調(diào)控區(qū)(也叫鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域)，同時(shí)又具有自己的獨(dú)特性，大部分鈣依賴蛋白激酶家族(CDPKs)的成員只有在氨基酸多肽鏈的C端才會(huì)有3-4個(gè)鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域即EF手性分子，但是對(duì)于EtCDPK4來說，其在N端也有2個(gè)EF手性分子，也就是說具有2個(gè)連接區(qū)結(jié)構(gòu)域。使用DNAstar對(duì)EtCDPK4的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原指數(shù)、柔性區(qū)域以及表面可及性和疏水性概況進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，EtCDPK4基因表達(dá)的多肽鏈中富含比較豐富的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲，也就是說EtCDPK4基因表達(dá)的這段多肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)非常的多樣化，同時(shí)結(jié)果也說明這段多肽鏈存在著大量的柔性區(qū)域，這些柔性區(qū)域的存在使蛋白質(zhì)多肽鏈能夠在形成三級(jí)結(jié)構(gòu)的時(shí)候更容易進(jìn)行折疊，進(jìn)而有效的發(fā)揮作用；這段多肽鏈的抗原指數(shù)分?jǐn)?shù)也比較高，最高的可以達(dá)到1.7，因此說明了這段多肽鏈的空間構(gòu)象中有較多的抗原位點(diǎn)，具有較豐富的免疫原性，通過這段多肽鏈表面可及性的分析，發(fā)現(xiàn)其分?jǐn)?shù)較高，可達(dá)到6左右，因此可以推斷出EtCDPK4基因表達(dá)的多肽要執(zhí)行相應(yīng)的功能需要運(yùn)動(dòng)到細(xì)胞(子孢子)的膜表面。

實(shí)施例2 EtCDPK4基因原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建

1.材料和方法

根據(jù)該基因ORF的全長(zhǎng)1803bp，選取它的一段編碼區(qū)序列進(jìn)行克隆和分析。其選取的編碼區(qū)大小為1660bp,編碼的氨基酸數(shù)目為550aa，大小為62.6KDa。

使用說明書利用Trizol試劑(TaKaRa)提取純凈子孢子的總RNA，經(jīng)過1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定合格后使用M-MLV Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen，USA)將其全部反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為PCR擴(kuò)增的模板，使用下列帶有限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：EtCDPK4UP：5’-CGGGATCCAGCAGGTGATGGGTGGGCGGGAGGT-3’(SEQ ID NO.7，含BamHI酶切位點(diǎn))，EtCDPK4LOW：5’-GCGTCGACAATTCGTCCCAGTCAATCTGCCCAT-3’(SEQ ID NO.8，含SalI酶切位點(diǎn))，將最后的目的基因EtCDPK4擴(kuò)增結(jié)果切膠以后進(jìn)行膠回收，然后將EtCDPK4的膠回收產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pCold-I分別進(jìn)行雙酶切后連接并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，待菌長(zhǎng)出以后進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的菌液提取pCold-I-EtCDPK4質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?/p>

2.結(jié)果

通過使用鑒定合格的柔嫩艾美耳球蟲子孢子總RNA(見圖1A)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板，使用特異性的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后在1000bp-2000bp之間有一個(gè)明顯的條帶，大小約為1660bp左右(見圖1B)，將其同原核表達(dá)載體pCold I使用BamHI和SalI雙酶切以后(見圖1C)，使用T4DNA Ligase過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，過夜后挑菌并且搖菌，將菌液送去測(cè)序后結(jié)果表明與原序列的相同性為100％，因此pCold I-EtCDPK4原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。圖1中，A.SpzRNA:柔嫩艾美耳球蟲子孢子總RNA的提??；B.EtCDPK4基因的PCR擴(kuò)增；C.EtCDPK4基因和pCold I空質(zhì)粒的雙酶切反應(yīng)；M：(DL2000)DNA分子量的大小。

實(shí)施例3 抗EtCDPK4重組融合蛋白血清的獲得和鑒定

1.材料和方法

將測(cè)序正確的pCold-I-EtCDPK4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21菌株中，利用16℃，1mM IPTG進(jìn)行24h誘導(dǎo)表達(dá)，將得到的可溶性重組蛋白利用能特異性結(jié)合His-Tag的親和樹脂進(jìn)行親和柱層析，然后對(duì)得到的蛋白進(jìn)行BCA定量后去免疫2只新西蘭大白兔和5只Balb/c小鼠，免疫劑量分別為200μg/只和50μg/只，初次免疫要與弗氏完全佐劑(FCA)進(jìn)行乳化(1:1)，間隔2周后進(jìn)行二次免疫，此時(shí)重組可溶性蛋白要與弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化(1:1)，此后每隔一周免疫一次，直到第五次免疫后對(duì)新西蘭大白兔和Balb/c小鼠分別采血進(jìn)行檢測(cè)(WB)和使用間接ELISA方法測(cè)定免疫兔血清的效價(jià)。

2.結(jié)果

通過對(duì)pCold I-EtCDPK4原核表達(dá)載體和pCold I空載體在0h和24h的菌液超聲處理后，進(jìn)行SDS-PAGE確定其重組蛋白的表達(dá)形式(見圖2)，最后發(fā)現(xiàn)pCold I-EtCDPK4重組蛋白以可溶性形式大量表達(dá)，在24h的時(shí)候產(chǎn)量較大。將其使用Ni-柱純化后，發(fā)現(xiàn)pCold I-EtCDPK4在大腸桿菌BL21中能夠大量的表達(dá)，通過摸索咪唑的最佳洗脫濃度，最后發(fā)現(xiàn)在150mM和250mM的咪唑洗脫緩沖液能夠有效的將該重組蛋白洗脫下來，其產(chǎn)量可以用于 后面的動(dòng)物免疫試驗(yàn)。圖2中，1:0h pCold-I-EtCDPK4重組大腸桿菌抽提蛋白；2:0h pCold-I空質(zhì)粒大腸桿菌抽提蛋白；3:24h pCold-I-EtCDPK4重組大腸桿菌抽提蛋白上清；4:24h pCold-I空質(zhì)粒大腸桿菌抽提蛋白上清；5:24h pCold-I-EtCDPK4重組大腸桿菌抽提蛋白沉淀；6:24h pCold-I空質(zhì)粒大腸桿菌抽提蛋白沉淀；7:250mM咪唑洗脫Buffer洗脫重組pCold-I-EtCDPK4可溶性蛋白；8:150mM咪唑洗脫Buffer洗脫重組pCold-I-EtCDPK4可溶性蛋白；黑色箭頭所指位置即為所表達(dá)的重組蛋白所在的位置(62.6KDa)。

待所設(shè)定的動(dòng)物免疫程序結(jié)束以后采取其所有的血液制備Anti-rEtCDPK4血清抗體，使用Western Blotting檢測(cè)所制備血清的反應(yīng)原性(見圖3A、B)；使用pCold I-EtCDPK4原核表達(dá)純化后的可溶性蛋白包被ELISA96孔板，然后使用間接ELISA測(cè)定Anti-EtCDPK4血清抗體的效價(jià)，最后結(jié)果為1:12800。圖3中，A.新西蘭大白兔血清的Western Blotting檢測(cè)結(jié)果；B.Balb/c小鼠血清的Western Blotting檢測(cè)結(jié)果。

實(shí)施例4 EtCDPK4基因在柔嫩艾美耳球蟲四個(gè)發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄水平高低的比較

1.材料和方法

為了測(cè)定EtCDPK4基因在柔嫩艾美耳球蟲四個(gè)不同發(fā)育階段中轉(zhuǎn)錄水平的高低，使用以SYBR染料標(biāo)記的熒光探針(TaKaRa)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)。提取柔嫩艾美耳球蟲未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子四個(gè)發(fā)育階段的總RNA，待驗(yàn)證所提取的RNA合格后進(jìn)行定量，去除DNA后利用M-MLV Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen，USA)將其全部進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板，以雞球蟲18srRNA基因作為內(nèi)參，使用下面的特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

(CTCAAAGACATCCACATCTCCCCCATCATTTGCGAAAACATGAAAAAATACATGCGACAGTCACATCTCAAGAACGCACTTGTGAATCTGATGGTC(SEQ ID NO.9)，保守結(jié)構(gòu)域序列大小是96bp，使用3步法，增設(shè)溶解曲線進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng))

EtCDPK4-RT(UP)：5’-GACCATCAGATTCACAAG-3’(SEQ ID NO.10)，

EtCDPK4-RT(LOW)：5’-CTCAAAGACATCCACATC-3’(SEQ ID NO.11)。

2.結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果表明在柔嫩艾美耳球蟲的四個(gè)不同的發(fā)育階段中，EtCDPK4基因在柔嫩艾美耳球蟲的子孢子階段的轉(zhuǎn)錄水平較其他的三個(gè)發(fā)育階段要高，孢子化卵囊中的量次之，未孢子化卵囊階段和裂殖子階段中的量較低，結(jié)果見圖4。

實(shí)施例5 重組EtCDPK4蛋白酶活性的測(cè)定

1.材料和方法

重組EtCDPK4(rEtCDPK4)蛋白的酶活性可以定義為每毫升rEtCDPK4酶蛋白每分鐘轉(zhuǎn)移到底物上的磷酸基團(tuán)的nmol數(shù)。對(duì)于rEtCDPK4酶活性的檢測(cè)使用一種非放射性的方法，即在體外構(gòu)建一個(gè)磷酸化的反應(yīng)體系，這個(gè)酶活性測(cè)定反應(yīng)包括定性檢測(cè)和定量檢測(cè)2個(gè)部分，這個(gè)體系的反應(yīng)組分為：100mM HEPES(pH 7.4)、6.5mM CaCl₂、5mM DTT、50mM MgCl₂、5mM ATP、1mg/ml Phosphatidylserine、0.05％X-100、10mM Mercaptoethanol、1μg/ml Leupeptin、1μg/ml Aprotinin、C1 Peptide(0.4μg/μl)(Promega)、Peptide保護(hù)液以及近期重新誘導(dǎo)表達(dá)且純化的可溶性的EtCDPK4重組蛋白，總體系設(shè)置為25μL，同時(shí)增設(shè)陰性對(duì)照和PKC陽性對(duì)照，將上述反應(yīng)體系置于30℃水浴鍋中磷酸化反應(yīng)30min后再將其置于95℃水浴鍋中5min用以終止磷酸化反應(yīng)，然后再分別加入1μL的甘油充分的吹打混勻后避光放置，同時(shí)配制Tris-HCl緩沖液(PH8.0)1L，用Tris-HCl緩沖液(pH8.0)配制0.8％的瓊脂糖凝膠，避光條件下使上述反應(yīng)產(chǎn)物在140V的電壓下電泳30min后在UV燈下迅速拍照，并且切割陰性對(duì)照中向負(fù)極泳動(dòng)的條帶，切割PKC陽性對(duì)照和EtCDPK4樣品中向正極泳動(dòng)的條帶，然后根據(jù)說明書測(cè)定A_570nm處的光吸收值進(jìn)行磷酸化產(chǎn)物的定量分析。酶活性測(cè)定和分析的原則是切下的樣品、陰性對(duì)照以及陽性對(duì)照的膠塊的光吸收值在一定的范圍內(nèi)微小的變動(dòng)，此時(shí)就可以計(jì)算出r EtCDPK4在自然狀態(tài)下的酶活性大小。

2.結(jié)果

利用體外磷酸化反應(yīng)測(cè)定rEtCDPK4酶活性。繼續(xù)通過純化低溫誘導(dǎo)表達(dá)的pColdI-rEtCDPK4原核可溶性蛋白(見圖5A，圖5A是EtCDPK4原核重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化即EtCDPK4酶蛋白的獲得結(jié)果圖)作為酶蛋白，rEtCDPK4酶活性測(cè)定的定性反應(yīng)結(jié)果見圖5B，酶活性的定量檢測(cè)計(jì)算結(jié)果見圖5D，重復(fù)5次后結(jié)果表明EtCDPK4的酶活性大小在0.87nmol·min^-1·ml^-1或者0.87Units/ml左右(結(jié)果見圖5C、D，圖5C是EtCDPK4酶活性定量檢測(cè)的5次重復(fù)光吸收值(A_570nm值))。與試劑盒中提供的PKC陽性對(duì)照相比，要低一些。

實(shí)施例6 不同Ca²⁺濃度對(duì)EtCDPK4酶活性的影響

1.材料和方法

在EtCDPK4自然酶活性測(cè)定反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上改進(jìn)了最初的反應(yīng)體系成分，這個(gè)酶活性測(cè)定反應(yīng)包括定性檢測(cè)和定量檢測(cè)2個(gè)部分，這個(gè)體系的反應(yīng)組分為：100mM HEPES(pH7.4)、5mM DTT、50mM MgCl₂、5mM ATP、1mg/ml Phosphatidylserine、0.05％X-100、10mM Mercaptoethanol、1μg/ml Leupeptin、1μg/ml Aprotinin、C1 Peptide(0.4μg/μl) (Promega)、Peptide保護(hù)液以及近期重新誘導(dǎo)表達(dá)且純化的可溶性的EtCDPK4重組蛋白和5個(gè)呈梯度且濃度不同的CaCl₂溶液，CaCl₂溶液的濃度設(shè)置為：0μM、10μM、50μM、100μM、1000μM，總體系設(shè)置為30μL，同時(shí)要增設(shè)陰性對(duì)照和EtCDPK4自然樣品對(duì)照，將上述反應(yīng)體系置于30℃水浴鍋中磷酸化反應(yīng)30min后再將其置于95℃水浴鍋中5min用以終止磷酸化反應(yīng)，然后再分別加入1μL的甘油充分的吹打混勻后避光放置，同時(shí)配制Tris-HCl緩沖液(PH8.0)1L，用Tris-HCl緩沖液(PH8.0)配制0.8％的瓊脂糖凝膠，避光條件下使上述反應(yīng)產(chǎn)物在140V的電壓下電泳30min后在UV燈下迅速拍照，并且切割陰性對(duì)照中向負(fù)極泳動(dòng)的條帶，切割EtCDPK4自然樣品對(duì)照和不同CaCl₂溶液的濃度樣品中向正極泳動(dòng)的條帶，然后根據(jù)說明書測(cè)定A_570nm處的光吸收值進(jìn)行磷酸化產(chǎn)物的定量分析。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，然后將得到的結(jié)果繪圖進(jìn)行分析。

2.結(jié)果

通過改變EtCDPK4酶活性測(cè)定反應(yīng)的反應(yīng)體系的組成，設(shè)置5個(gè)不同的Ca²⁺濃度，最后結(jié)果表明，當(dāng)Ca²⁺濃度為0時(shí)，EtCDPK4沒有任何的酶活性，這也說明了EtCDPK4發(fā)揮功能完全依賴于Ca²⁺濃度，隨著Ca²⁺濃度的不斷的升高，可以明顯的看到EtCDPK4的酶活性不斷增強(qiáng)(見圖6、7和表2)，但是條帶還是相對(duì)較弱。圖6是不同Ca²⁺濃度對(duì)EtCDPK4酶活性影響的定性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，其中，SC:EtCDPK4樣品正常酶活性反應(yīng)對(duì)照；NC：陰性對(duì)照；Ca²⁺濃度設(shè)置為5個(gè)梯度：0μM、10μM、50μM、100μM、1000μM。圖7是不同Ca²⁺濃度對(duì)EtCDPK4酶活性影響的定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，其中，A.不同鈣離子濃度下EtCDPK4磷酸化短肽的光吸收值；B.不同Ca²⁺濃度下EtCDPK4酶活性大小的定量計(jì)算。

表2 不同鈣離子濃度對(duì)EtCDPK4酶活性的影響

在正常的所建立該Ca²⁺依賴的體外磷酸化酶促反應(yīng)中，Ca²⁺的工作濃度是6.5mM。上述不同鈣離子濃度都是在正常酶活反應(yīng)水平以下，該酶活反應(yīng)充分證實(shí)了EtCDPK4是完全鈣依賴的一種蛋白激酶，并且在體外隨著鈣離子濃度的升高它的激酶反應(yīng)活性不斷升高。

實(shí)施例7 EtCDPK4特異性抑制劑的篩選和顯著性分析

1.材料和方法

通過對(duì)EtCDPK4功能結(jié)構(gòu)域的生物信息學(xué)分析，針對(duì)于它的不同的功能結(jié)構(gòu)域選擇7個(gè)抑制劑，它們分別是W-7、H-7、H-89、Staurosporine、D-Sphingosine、Ro-31-8220和 Myristoylated Peptide，其中這7個(gè)抑制劑分屬于三個(gè)不同的類別：ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、蛋白激酶底物抑制劑和Ca²⁺結(jié)合結(jié)構(gòu)域抑制劑。利用前期已經(jīng)構(gòu)建成功的體外磷酸化酶活性反應(yīng)體系以及結(jié)合這些抑制劑說明書上推薦的的最佳抑制濃度，將這些抑制劑在最終反應(yīng)體系中的濃度都調(diào)整為100μM(根據(jù)抑制劑說明書推薦的最佳抑制濃度)，其整個(gè)反應(yīng)體系的成分為：100mM HEPES(pH 7.4)、6.5mM CaCl₂、5mM DTT、50mM MgCl₂、5mM ATP、1mg/ml Phosphatidylserine、0.05％X-100、10mM Mercaptoethanol、1μg/ml Leupeptin、1μg/ml Aprotinin、C1 Peptide(0.4μg/μl)(Promega)、Peptide保護(hù)液以及近期重新誘導(dǎo)表達(dá)且純化的可溶性的EtCDPK4重組蛋白和上述已經(jīng)配置好的要加入反應(yīng)體系中的特異性抑制劑母液(15×)，總體系設(shè)置為30μL，同時(shí)增設(shè)陰性對(duì)照和無抑制劑參與下的EtCDPK4正常酶活性反應(yīng)的對(duì)照，將上述反應(yīng)體系置于30℃水浴鍋中磷酸化反應(yīng)30min后再將其置于95℃水浴鍋中5min用以終止磷酸化反應(yīng)，然后再分別加入1μL的甘油充分的吹打混勻后避光放置，同時(shí)配制Tris-HCl緩沖液(PH8.0)1L，用Tris-HCl緩沖液(PH8.0)配制0.8％的瓊脂糖凝膠，避光條件下使上述反應(yīng)產(chǎn)物在140V的電壓下電泳30min后在UV燈下迅速拍照，并且迅速的切割陰性對(duì)照中向負(fù)極泳動(dòng)的條帶(繼續(xù)帶正電荷，未被磷酸化的條帶)，切割無抑制劑參與下的EtCDPK4正常酶活性反應(yīng)的對(duì)照和有抑制劑參與下的EtCDPK4酶活性反應(yīng)的樣品中向正極泳動(dòng)的條帶，然后根據(jù)被顏色標(biāo)記的C1多肽底物使用說明書測(cè)定A_570nm處的光吸收值然后進(jìn)行磷酸化產(chǎn)物的定量分析。將最后的結(jié)果繪圖進(jìn)行分析，同時(shí)將所得到的所有相關(guān)的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。

2.結(jié)果

通過改變EtCDPK4自然酶活性的體外磷酸化反應(yīng)體系，將購買的7種抑制劑應(yīng)用于體外磷酸化反應(yīng)中，定性檢測(cè)見圖8；定量檢測(cè)見圖9、表3，從定性檢測(cè)和應(yīng)用推導(dǎo)的EtCDPK4酶活性定量計(jì)算的公式進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)表明除了D-Sphingosine外，其余的6種抑制劑：W-7、H-7、H-89、Staurosporine、Ro-31-8220和Myristoylated Peptide均能夠在一定程度上有效的抑制EtCDPK4酶活性。圖8中，NC：不加EtCDPK4和任何抑制劑的陰性對(duì)照；SC：只有EtCDPK4參與反應(yīng)但是沒有抑制劑參與的樣品對(duì)照。

EtCDPK4酶活性大小計(jì)算推導(dǎo)公式：

EtCDPK4酶活單位：nmol×min^-1×ml^-1

As:樣品在570nm波長(zhǎng)下的光吸收值，C_NP：C1的標(biāo)準(zhǔn)濃度

V_T:比色皿中樣品的總體積(500μl),1.43:測(cè)定光吸收值的修正系數(shù)(250/175)

A_NC：陰性對(duì)照中非磷酸化多肽在570nm波長(zhǎng)下的光吸收值

V_EtCDPK4：反應(yīng)體系中EtCDPK4所加的總體積(10μl)

t:磷酸化反應(yīng)所進(jìn)行的時(shí)間(30min)。

表3 EtCDPK4抑制劑抑制結(jié)果的ANOVA分析結(jié)果

注:跟對(duì)照組相比，差異顯著，P<0.05。

實(shí)施例8 Anti-EtCDPK4血清的體外入侵抑制試驗(yàn)

1.材料和方法

利用前期的EtCDPK4原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的可溶性蛋白免疫新西蘭大白兔后得到的血清經(jīng)過Protein A+G純化后，將其稀釋為50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml這6個(gè)不同的濃度。在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每一孔中接入15萬DF-1細(xì)胞，次日提取純凈的柔嫩艾美耳球蟲子孢子，將其使用CFDA(碧云天)熒光探針標(biāo)記以后，加入到之前稀釋好的純化血清中，每一個(gè)血清濃度下做3個(gè)平行重復(fù)，每一孔中接入15萬經(jīng)過CFDA熒光探針標(biāo)記和血清抗體處理過的柔嫩艾美耳球蟲子孢子，并且增設(shè)熒光標(biāo)記子孢子和正常DF-1細(xì)胞的陰性對(duì)照，然后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分選，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后可以計(jì)算出入侵率和抑制率(入侵抑制率＝[1-(抗體作用的子孢子入侵率/未經(jīng)抗體作用的子孢子入侵率)]×100％)。通過Beckman細(xì)胞流式分選系統(tǒng)進(jìn)行分析，結(jié)果進(jìn)行ANOVA分析。

2.結(jié)果

結(jié)果顯示Anti-EtCDPK抗血清在最高濃度400μg/ml下對(duì)子孢子入侵DF-1細(xì)胞的入侵率達(dá)到了52％左右(見圖10)，能明顯抑制子孢子入侵DF-1細(xì)胞，說明EtCDPK在柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要功能。此次流式設(shè)置的DF-1細(xì)胞計(jì)數(shù)上限為15000個(gè)。

實(shí)施例9 EtCDPK4表達(dá)蛋白在子孢子入侵DF-1細(xì)胞不同時(shí)相的免疫定位

1.材料和方法

將飼養(yǎng)的狀態(tài)良好并且已經(jīng)傳代次數(shù)超過3代的DF-1細(xì)胞使用0.25％的胰酶-EDTA在37℃、5％CO₂條件下消化2min以后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后在加入細(xì)胞級(jí)別的圓形的潔凈蓋玻片的6孔板中每一孔中接入20萬的DF-1細(xì)胞，讓其生長(zhǎng)20h左右，次日無菌手段提取柔嫩艾美耳球蟲的子孢子，經(jīng)過細(xì)胞計(jì)數(shù)后每一孔中也接入20萬的子孢子，在接子孢子前要將已經(jīng)計(jì)數(shù)好的子孢子用完全細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(5％雙抗、10％FBS)充分懸浮后在37℃、5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2h后再將其接于生長(zhǎng)有DF-1細(xì)胞的六孔板之中，然后分別于12h、24h、36h、48h、60h、72h時(shí)收取一塊6孔板以及將沒有入侵過細(xì)胞的使用PBS處理2h的子孢子和裂殖子、DMEM(含有10％FBS)處理2h的子孢子，使用2％多聚甲醛進(jìn)行固定15min，透明15min，再加入2％的BSA-PBS封閉過夜，次日使用滅菌的PBS充分的洗滌以除去2％的BSA-PBS，然后加入1:500稀釋的抗rEtCDPK4兔血清，在37℃條件下孵育2h后，再加入1:2000稀釋的FITC-羊抗兔IgG，在37℃避光條件下孵育2h后使用1:50稀釋的DAPI染核20min后加入50μl抗熒光猝滅劑(Sigma)于圓形蓋玻片上然后將其倒置于潔凈的載玻片上，并且進(jìn)行標(biāo)記，然后在熒光顯微鏡(OLYMPUS)下進(jìn)行觀察，拍照。

2.結(jié)果

結(jié)果如圖11所示，發(fā)現(xiàn)該蛋白除了折光體之外均勻分布于子孢子，當(dāng)子孢子進(jìn)入DF-1細(xì)胞后，蛋白表達(dá)量上升，且發(fā)現(xiàn)該蛋白位于帶蟲空泡膜上；當(dāng)蟲體發(fā)育至未成熟裂殖體和成熟裂殖體時(shí)，蛋白均勻的分布于整個(gè)蟲體，且熒光增強(qiáng)，表達(dá)量上升。另外，也發(fā)現(xiàn)該蛋白均勻分布于第二代裂殖子，且表達(dá)量上升。

實(shí)施例10 篩選出的特異性抑制劑抑制子孢子對(duì)DF-1細(xì)胞的入侵試驗(yàn)

1.材料和方法

將通過酶活性實(shí)驗(yàn)篩選出的六種特異性抑制劑：W-7、H-7、H-89、Staurosporine、Ro-31-8220和Myristoylated Peptide以及陰性對(duì)照DMSO(Sigma)按照100μM的濃度分別處理使用CFDA(碧云天)熒光探針標(biāo)記的子孢子，將其在37℃水浴鍋中孵育2h后不離心直接接入生長(zhǎng)有DF-1細(xì)胞的24孔板中，每一個(gè)抑制劑做3個(gè)平行重復(fù)，然后使用Beckman流式分選系統(tǒng)進(jìn)行分析，結(jié)果進(jìn)行ANOVA分析。

2.結(jié)果

分析結(jié)果表明通過體外酶活篩選出的特異性抑制劑中W-7、H-7、H-89以及Myristoylated Peptide對(duì)柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵DF-1細(xì)胞具有良好的抑制作用(見圖12)。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。