用于艾美爾屬球蟲病毒的簡并引物rt-pcr檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種用于艾美爾屬球蟲病毒的簡并引物RT-PCR檢測方法，提供了一對全新的簡并引物，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄和降落PCR技術(shù)對艾美爾屬球蟲病毒進(jìn)行特異性的簡并引物RT-PCR擴(kuò)增。本發(fā)明簡并引物RT-PCR方法可有效檢測柔嫩艾美爾球蟲病毒和斯氏艾美爾球蟲病毒存在，并且專一性好(電泳條帶單一)。為首次用于艾美爾屬球蟲病毒檢測的方法，可以快速準(zhǔn)確的識別待檢球蟲樣本中是否含有攜病毒的蟲株。
【專利說明】用于艾美爾屬球蟲病毒的簡并引物RT-PCR檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開一種用于艾美爾屬球蟲病毒的簡并引物RT-PCR檢測方法，提供了一對全新的簡并引物，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄和降落PCR技術(shù)對艾美爾屬球蟲病毒進(jìn)行特異性的簡并引物RT-PCR擴(kuò)增。所應(yīng)用的技術(shù)為簡并引物設(shè)計、反轉(zhuǎn)錄、降落PCR(TD-PCR)，屬于分子生物學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]雞球蟲病(Coccidiosis)是由一種或多種艾美爾屬球蟲引起，且危害十分嚴(yán)重的寄生蟲病。作為一種細(xì)胞內(nèi)寄生蟲,艾美爾球蟲導(dǎo)致全球養(yǎng)禽業(yè)的巨大損失,每年大約80億美元的損失。雙鏈RNA病毒首先在真菌中于1948年發(fā)現(xiàn)，此后又在原蟲中發(fā)現(xiàn)了 dsRNA病毒。原蟲病毒是一類存在于原蟲體內(nèi)的病毒粒子，大多為雙鏈RNA (dsRNA)病毒,球形20面體，直徑30-50nm，具有RNA依賴RNA聚合酶活性。在球蟲病毒研究方面，已報道在柔嫩艾美爾球蟲、斯氏艾美爾球蟲、尼氏艾美爾球蟲、布氏艾美爾球蟲、巨型艾美爾球蟲、毒害艾美爾球蟲以及堆型艾美爾球蟲內(nèi)存在病毒樣粒子或病毒樣核酸。但目前關(guān)于球蟲病毒的許多特性尚不十分清楚。
[0003]在艾美爾球蟲的研究中，發(fā)現(xiàn)球蟲的致病力與其是否攜帶病毒存在相關(guān)性。目前對于艾美爾球蟲病毒研究剛剛起步，大量的研究還集中在對病毒樣粒子的電鏡觀察。目前對球蟲病毒的檢測方法尚無標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)的方法是電鏡觀察病毒樣粒子的存在，然而此方法成本高，而且檢出率低。另一種方法是檢測病毒核酸，但由于自然感染病例往往是混合感染，攜帶病毒的蟲株比例低，特別是在有其他生物材料污染的情況下其檢測的靈敏度非常低，而且誤檢率高，對結(jié)果的判斷沒有具體標(biāo)準(zhǔn)。因此開發(fā)一種靈敏的、準(zhǔn)確的、成本低以及對所有艾美爾屬球蟲病毒進(jìn)行通用性檢測的方法，是非常有必要的。
[0004]簡并引物PCR是因為遺傳密碼具有簡并性，大部分的氨基酸都有不止一個密碼子來編碼，而且同源同工蛋白往往在一些重要區(qū)段具有較高的氨基酸序列保守性，所以對未知目的基因可以通過已知的多個同源同工基因的保守區(qū)大概推測，并以此設(shè)計具有簡并位點的簡并引物來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。簡并引物PCR因此具有同源同工基因擴(kuò)增的一定的通用性。簡并引物的設(shè)計是簡并引物PCR成功與否的關(guān)鍵步驟。要獲得可供檢測的目的核酸片段，必須使用RT-PCR的方法將RNA擴(kuò)增為DNA。傳統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)針對ssRNA采用單一的下游引物進(jìn)行。目前尚無用于檢測艾美爾屬球蟲病毒的簡并引物RT -PCR檢測方法的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是公開一種用于艾美爾屬球蟲病毒的簡并引物RT-PCR檢測方法，為簡并引物RT-PCR檢測方法，解決了目前尚無檢測艾美爾球蟲屬病毒方法的難題，該方法應(yīng)用高保守區(qū)域的低變異特性，使用簡并引物對艾美爾屬球蟲病毒進(jìn)行檢測，達(dá)到特異性與通用性相結(jié)合，為檢測艾美耳屬球蟲病毒提供了新的可行的辦法。
[0006] 包括以下步驟:1)在STE緩沖液的條件下，使用苯酚氯仿對經(jīng)過液氮研磨的球蟲材料進(jìn)行抽提，獲取總核酸，總核酸中的DNA經(jīng)由DNaseI消化處理，獲取RNA的粗提產(chǎn)物；
2)該粗提產(chǎn)物直接作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)，因為球蟲病毒基因組為dsRNA，所以反轉(zhuǎn)錄使用CF和CR兩條簡并引物同時進(jìn)行；
上游引物:CF:5’ -CBGCIGCTBYIGTVGCH-3’
下游引物:CR:5’ -GTVGRCTCDATCCARAASHAD-3’
以上CF引物使用了 I (次黃嘌呤)，代替N (N=A/T/C/G)；
其中兼并堿基代碼:
R=A/G、S=G/C、Y=C/T、V=A/G/C、H=A/C/T、D=A/G/T、B=G/C/T、N=A/G/C/T ；
3)經(jīng)由反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA使用PCR方法擴(kuò)增為dsDNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。
[0007]由于dsRNA的反轉(zhuǎn)錄較為困難，通過對比使用多個公司的多種反轉(zhuǎn)錄酶，最后確定了 PrimeScript ? Reverse Transcriptase (2680Q)反轉(zhuǎn)錄酶，PCR 使用 TaKaRa LA Taq(RR02MQ)核酸聚合酶。本發(fā)明所使用的各種試劑價格低廉，同時可有效擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物專一性好，電泳結(jié)果容易判斷。
[0008]本發(fā)明的積極效果在于:簡并引物RT-PCR方法可有效檢測柔嫩艾美爾球蟲病毒和斯氏艾美爾球蟲病毒存在，并且專一性好，電泳條帶單一；通用性好，可對艾美爾屬球蟲病毒進(jìn)行通用檢測；靈敏 度高，少量目的核酸:0.05ng/yl即能獲得檢測結(jié)果。為首次用于艾美爾屬球蟲病毒檢測的方法，可以快速準(zhǔn)確的識別待檢球蟲樣本中是否含有攜病毒的蟲株。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]附圖1為上游引物CF、下游引物CR設(shè)計圖。
[0010]附圖2為模板RNA濃度梯度優(yōu)選。
[0011]附圖3為引物濃度梯度優(yōu)選。
[0012]附圖4為TaKaRa La Taq酶濃度梯度優(yōu)選。
[0013]附圖5為dNTP濃度梯度優(yōu)選。
[0014]附圖6為簡并引物RT-PCR的方法檢測柔嫩艾美爾球蟲病毒。
[0015]附圖7為簡并引物RT-PCR的方法檢測斯氏艾美爾球蟲病毒。
【具體實施方式】
[0016]為進(jìn)一步說明本發(fā)明在艾美耳屬球蟲病毒檢測中的應(yīng)用，以下列實施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明的應(yīng)用并不限于實施例。
[0017]實施例1 引物的設(shè)計和合成
一、材料:分子生物學(xué)軟件MEGA4、DNAMAN及NCBI網(wǎng)絡(luò)資源。
[0018]二、方法與結(jié)果:
序列獲得:通過對布氏艾美爾球蟲病毒(疋brunetti RNA virus I)基因組分析，選取coat基因作為靶序列，并從GenBank公共數(shù)據(jù)庫中獲得此基因序列，登錄號為:NC_002701。使用coat蛋白序列為質(zhì)詢序列，在NCBI上進(jìn)行BlustP比對，獲得330至346位(IALGTAAAVAHCDPLVP )，435至446位(PFFffIEPTTVLP )兩個高度保守的蛋白區(qū)域，將其余參考序列的相應(yīng)位置的核酸序列單獨下載，獲得了 Gremmeniella abietina RNA virusL2、Gremmeniella abietina RNA virus L1、Helicobasidium mompa totivirus 1—17、Helminthosporium victoriae virus、Beauveria bassiana RNA virus 1、Tolypocladiumcylindrosporum virus 1、Aspergillus foetidus slow virus I 七個真菌病毒，以及Leishmania RNA virus 1- 4一個利什曼原蟲病毒的序列。
[0019]引物設(shè)計:所獲的序列經(jīng)cluster比對后，選取合適區(qū)域設(shè)計出引物。(見附圖1)。簡并位點使用簡并堿基，簡并位點為N時，使用I (次黃嘌呤)。
[0020]引物合成:由生物公司合成引物CF、CR。
[0021]上游引物:CF:5’ -CBGCIGCTBYIGTVGCH-3’
下游引物:CR:5’ -GTVGRCTCDATCCARAASHAD-3’
實施例2
核酸樣品的制備
一、材料:柔嫩艾美爾球蟲、2XSTE緩沖液(Ph8.0)、水飽和酚、三氯甲烷、β-巰基乙醇、10%SDS、70%乙醇、異丙醇、高速離心機(jī)。
[0022]二、方法與結(jié)果:
I)柔嫩艾美爾球蟲卵囊破碎:將約IO7待檢球蟲進(jìn)行液氮研磨，研磨后溶于lml2XSTE(PH8.0)緩沖液。
[0023]2)蛋白質(zhì)抽提:在上述球蟲溶液中加入30μ1β-巰基乙醇，0.6ml水飽和酚，
0.4ml三氯甲烷，140 μ 110%SDS。充分勻漿5分鐘。4°C條件下，12000r/min離心5分鐘，取上清。
[0024]3)總核酸獲取:上清與等體積的冷異丙醇混勻，-80°C靜置10分鐘，4°C條件下，15000r/min離心15分鐘，沉淀用70%冷乙醇溶液清洗，4°C條件下，15000r/min離心15分鐘。沉淀干燥后溶于200 μ IddH2O0
[0025]4) DNA 消化:取上述總核酸溶液 172 μ 1，加入 DNaseI (TaKaRa, 2270Α)8 μ I, 10*DNase I Buffer 20 μ I。37°C消化 30 分鐘，80°C 5 分鐘使酶失活。
[0026]5) RNA獲取:取上述溶液，加等體積冷異丙醇，-80°C靜置10分鐘，4°C條件下，15000r/min離心15分鐘，沉淀用70%冷乙醇溶液清洗，4°C條件下，15000r/min離心15分鐘。沉淀干燥后溶于100 μ IddH2Oo再15000r/min離心15分鐘,取上清,棄沉淀。
[0027]實施例3
簡并引物RT-PCR檢測柔嫩艾美爾球蟲病毒
一、材料:柔嫩艾美爾球蟲RNA粗提物、PrimeScript ? ReverseTranscriptase (2680Q)反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、TaKaRa LA Taq (RR02MQ)核酸聚合酶試劑盒、瓊脂糖、溴化乙錠溶液、Biorad PCR儀。
[0028]二、方法與結(jié)果:
I) Ist-Stand cDNA合成:在Microtube中配制下列混合液:
【權(quán)利要求】
1.用于艾美爾屬球蟲病毒的簡并引物RT-PCR檢測方法，包括以下步驟: 1)在STE緩沖液的條件下，使用苯酚氯仿對經(jīng)過液氮研磨的球蟲材料進(jìn)行抽提，獲取總核酸，總核酸中的DNA經(jīng)由DNaseI消化處理，獲取RNA的粗提產(chǎn)物，即為待檢核酸樣品； 2)該待檢核酸樣品直接作為模板，使用PrimeScript? ReverseTranscriptase (2680Q)反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT);因為球蟲病毒基因組為dsRNA，所以反轉(zhuǎn)錄使用CF和CR兩條簡并引物同時進(jìn)行(傳統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)只使用單一的下游引物)； 上游引物:CF:5’ -CBGCIGCTBYIGTVGCH-3’ 下游引物:CR:5’ -GTVGRCTCDATCCARAASHAD-3’ 以上CF引物使用了 I (次黃嘌呤)，代替N (N=A/T/C/G)； 其中兼并堿基代碼:R=A/G、S=G/C、Y=C/T、V=A/G/C、H=A/C/T、D=A/G/T、B=G/C/T、N=A/G/C/T ； 3)經(jīng)由反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA使用TaKaRaLA Taq (RR02MQ)核酸聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增為dsDNA,瓊脂糖凝 膠電泳檢測結(jié)果(約400bp大小的單一條帶)。
【文檔編號】C12Q1/68GK103898237SQ201410009964
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】李建華, 武斌, 張西臣, 宮鵬濤, 信彩巖, 張國才, 楊舉, 李 赫, 楊正濤 申請人:吉林大學(xué)