大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)合成s-腺苷甲硫氨酸的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)合成S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的制備方法，其基本過程為：首先將含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（SAMS）的大腸桿菌工程菌株BL21/pET-28a-SAMS與釀酒酵母分別在適宜的條件下培養(yǎng)后，按一定比例進(jìn)行混合偶聯(lián)生成SAM；然后使用有機(jī)溶劑作為通透劑使合成的SAM分泌到細(xì)胞外；最后采用高效液相色譜技術(shù)對(duì)SAM進(jìn)行分析檢測。本發(fā)明為SAM的廉價(jià)生產(chǎn)提供了一條新的途徑，是一種操作簡便，工藝簡單的整細(xì)胞催化ATP和L-Met合成SAM的方法。
【專利說明】大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)合成S-腺苷甲硫氨酸的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)合成S-腺苷甲硫氨酸的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosy 1-methionine, SAM)是廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)一種重要的中間代謝產(chǎn)物。在人體內(nèi)，SAM是一種重要的生理活性物質(zhì),參與多種生化反應(yīng)。SAM由于具有重要生理作用而引起人們的廣泛關(guān)注。經(jīng)過多年的臨床應(yīng)用研究表明，SAM是目前效果最好、功能最多、適用面最廣的一種既可作為疾病治療藥物，又可作為食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑的物質(zhì)。它可用于治療肝病、抑郁癥及關(guān)節(jié)炎等疾病，也是抗衰老的高級(jí)保健藥物。由于其具有起效快、副作用小、安全可靠等特點(diǎn)，目前美國FDA已正式批準(zhǔn)了 SAM的腸溶劑和膠囊作為非處方藥；同時(shí)美國FDA還批準(zhǔn)SAM作為保健品上市。在我國，SAM臨床應(yīng)用主要集中在肝病方面。我國是肝炎的流行大國，據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國還沒有一種能真正改善肝細(xì)胞代謝的生物藥物。因此，在國內(nèi)開發(fā)SAM藥物意義重大。
[0003]SAM的制備方法主要有化學(xué)合成法、酶促轉(zhuǎn)化法及微生物發(fā)酵法。其中，化學(xué)合成法是采用S-腺苷同型半胱氨酸和甲基供體合成，但其產(chǎn)率低、反應(yīng)底物價(jià)格昂貴，因此未能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。酶促轉(zhuǎn)化法是利用SAM合成酶(SAMS)來催化ATP和L-甲硫氨酸(L-Met)以合成SAM。但一方面SAM合成酶需要進(jìn)行分離純化后方可作為生物催化劑使用，從而增加了生產(chǎn)成本；另一方面SAM的合成還需要價(jià)格昂貴的ATP作為底物，因此，目前酶促轉(zhuǎn)化法一般只合成同 位素標(biāo)記的SAM用于科學(xué)研究，若用于工業(yè)化生產(chǎn)還有待于進(jìn)一步改進(jìn)和探索。微生物發(fā)酵法是現(xiàn)在應(yīng)用最廣泛，同時(shí)成本也最低廉的方法。某些微生物可以通過細(xì)胞代謝積累SAM,尤其是糖酵母屬(Saccharomyces)的一些菌株,在培養(yǎng)基中添加一定量外源L-甲硫氨酸(L-Met)便能夠在細(xì)胞內(nèi)催化ATP與L-Met反應(yīng)，合成較高濃度的SAM。盡管微生物發(fā)酵法克服了酶促轉(zhuǎn)化法利用昂貴ATP及需要對(duì)SAM合成酶進(jìn)行分離純化等缺點(diǎn)，但合成的SAM主要累積在酵母細(xì)胞內(nèi)，在分離純化SAM過程中，首先需破碎較厚的酵母細(xì)胞壁，然后再經(jīng)過復(fù)雜的分離純化步驟，最后才能獲得純度較高的SAM。而酵母細(xì)胞的破壁問題目前在工業(yè)化生產(chǎn)中仍是一個(gè)主要瓶頸，同時(shí)復(fù)雜的分離純化步驟也使SAM的最終產(chǎn)率較低。以L-Met計(jì)算，發(fā)酵法生產(chǎn)SAM的產(chǎn)率只有15%~30%，從而造成SAM的生產(chǎn)成本較高。因此，如何進(jìn)一步高效合成大量SAM及簡化SAM的分離純化工藝，以期大幅度提高SAM的產(chǎn)量，將有利于推進(jìn)我國SAM大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn)程。
[0004]SAM 是由 S-腺苷甲硫氨酸合成酶(EC2.5.1.6, S-Adenosyl-methionine-synthetase，SAMS)在ATP存在的條件下催化L-甲硫氨酸(L-Met)合成的。影響合成過程的重要因素包括:S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)的活性及ATP的供給。前者主要影響生物合成的效率，而后者則與過程的經(jīng)濟(jì)性緊密相關(guān)。由于在反應(yīng)過程中直接添加ATP是經(jīng)濟(jì)上所不合適的，因此，對(duì)于這類需要ATP的生物合成過程，能否引入一個(gè)有效的ATP合成系統(tǒng)，并與SAM合成系統(tǒng)相協(xié)調(diào)構(gòu)成一個(gè)耦合系統(tǒng)，即ATP再生系統(tǒng)，直接影響反應(yīng)過程的經(jīng)濟(jì)性和效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)合成S-腺苷甲硫氨酸的制備方法，以解決現(xiàn)階段生產(chǎn)SAM方法中存在的成本高、分離純化困難等問題。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:
一種大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)合成S-腺苷甲硫氨酸的制備方法，包括以下步驟:
(1)將含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMS)的大腸桿菌工程菌株BL21/pET-28a-SAMS與釀酒酵母分別在適宜的條件下發(fā)酵培養(yǎng)后收集菌體；
(2)按一定比例將上述大腸桿菌與釀酒酵母菌體進(jìn)行混合偶聯(lián)，并加入耦合系統(tǒng)反應(yīng)液；其中，大腸桿菌提供SAMS及合成SAM的場所，釀酒酵母提供足夠的ATP ；
(3)使用有機(jī)溶劑作為通透劑對(duì)偶聯(lián)細(xì)胞進(jìn)行通透化處理，使SAM在大腸桿菌中合成，并被分泌到細(xì)胞外；
(4)反應(yīng)結(jié)束后離心收集上清，得到S-腺苷甲硫氨酸。
[0007]所述步驟(1)中，大腸桿菌工程菌株BL21/pET-28a_SAMS的培養(yǎng)過程為:將含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMS)的大腸桿菌工程菌株BL21/pET-28a-SAMS培養(yǎng)到0D_為0.5~1.5時(shí)，加入2~8 mg/mL`乳糖或0.f 1.0 mmol/L異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)溫度為25~37°C，誘導(dǎo)時(shí)間為5~16 h，以誘導(dǎo)表達(dá)一定量的S-腺苷甲硫氨酸合成酶SAMS。
[0008]所述步驟(1)中，釀酒酵母的培養(yǎng)過程為:將釀酒酵母在搖床轉(zhuǎn)速17(T200 r/min、溫度28~30°C條件下，培養(yǎng)時(shí)間17~22 h。
[0009]所述步驟(2)中，所述大腸桿菌BL21/pET-28a_SAMS與釀酒酵母濕菌體質(zhì)量混合比例為0.5~5:1。
[0010]所述步驟(2)中，稱合系統(tǒng)反應(yīng)液包括:200 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L腺苷(Ado), I mmol/L 單磷酸腺苷(AMP),0.1 mmol/L 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD), 30 mmol/LMgCl2 ? 6H20, 30mmol/L L-蛋氨酸(L-Met), 200 mmol/L 憐酸鉀緩沖液，用 0.5 mol/L 氫氧化鉀調(diào)pH=7.0。
[0011]所述步驟(3)中，以0.5~6%甲苯或0.5%甲醇或0.5%丙酮作為所述的通透劑。
[0012]所述步驟(3)中，其反應(yīng)條件為:搖床轉(zhuǎn)速為15(T200r/min、溫度為25~37°C，偶聯(lián)反應(yīng)2~8 h。
[0013]采用上述方案后，由于本發(fā)明利用含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的重組大腸桿菌和酵解途徑酶活性較強(qiáng)的釀酒酵母，經(jīng)過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透性處理后，不進(jìn)行固定化操作而直接將兩種菌體混合，由其完整的酶系構(gòu)建一個(gè)ATP再生系統(tǒng)和SAM合成系統(tǒng)。即以大腸桿菌BL21 (DE3)為宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化帶有編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMS)的重組質(zhì)粒pET-28a-SAMS，獲得了一株具有SAM合成活性、質(zhì)粒穩(wěn)定性和傳代穩(wěn)定性俱佳，并且能夠重復(fù)使用的重組大腸桿菌菌株BL21/pET-28a-SAMS。在此基礎(chǔ)上，利用重組大腸桿菌BL21/pET-28a-SAMS中的S-腺苷甲硫氨酸合成酶系和釀酒酵母中的ATP生物合成酶系，構(gòu)建了一個(gè)以葡萄糖為能源的種間耦合ATP再生系統(tǒng)以合成SAM，并將合成產(chǎn)物SAM有效地分泌到細(xì)胞外。本發(fā)明一方面避免了額外添加昂貴的ATP ;另一方面由于SAM被分泌到細(xì)胞外，可大大簡化其分離純化工藝。因此，本發(fā)明提供了一種廉價(jià)生產(chǎn)S-腺苷甲硫氨酸的新方法，是一種操作簡便，工藝簡單的整細(xì)胞催化ATP和L-Met合成SAM的方法。目前國內(nèi)未見到利用大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)生成S-腺苷甲硫氨酸的報(bào)道。
[0014]更具體而言，本發(fā)明具有如下特點(diǎn):
1.本發(fā)明使用能大量表達(dá)S-腺苷甲硫氨酸合成酶的重組菌作為酶源催化合成SAM，為偶聯(lián)時(shí)催化合成SAM提供了大量廉價(jià)的酶源。
[0015]2.本發(fā)明使用酵解途徑酶活性較強(qiáng)的釀酒酵母產(chǎn)生ATP，為催化合成SAM提供了大量廉價(jià)的ATP。
[0016]3.本發(fā)明使用有機(jī)溶劑甲苯作為通透劑對(duì)用于催化偶聯(lián)合成SAM的細(xì)胞進(jìn)行通透性處理，以保證底物及產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)外的擴(kuò)散傳遞，尤其是確保酵母生成的ATP能夠順利轉(zhuǎn)移至工程菌進(jìn)行SAM的合成。經(jīng)通透處理的細(xì)胞催化SAM合成的產(chǎn)率得到大幅度的提高，大大提高了 SAM合成酶的利用率。
[0017]4.本發(fā)明利用大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)合成S-腺苷甲硫氨酸，由于產(chǎn)物是分泌到胞外，可大大簡化SAM的后續(xù)的分離純化工藝。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1A為HPLC檢測SAM標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；
圖1B為HPLC檢測大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)合成SAM樣品色譜圖； 圖2為SAM標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。
[0020]一、大腸桿菌工程菌株BL21/pET-28a_SAMS (本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)的培養(yǎng):
1.培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基(酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L, NaCl 10 g/L, pH 7.0)，固體LB培養(yǎng)基中含有2%的瓊脂。根據(jù)需要添加50呢/mL卡那霉素。
[0021]2.培養(yǎng)方法:從含有50呢/mL卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上挑取大腸桿菌工程菌株BL21/pET-28a-SAMS單菌落接種至裝有30 mL的含有50吒/mL卡那霉素LB (LK)培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng)，在搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min、溫度為37°C條件下，培養(yǎng)12 h左右。將培養(yǎng)液按1% (v/v)的接種量接種至裝有100 mL的LK培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，當(dāng)菌體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長中期(OD6tltl=L 5左右)時(shí),加入4 mg/mL乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)重組SAMS。其中，誘導(dǎo)溫度為30°C，誘導(dǎo)時(shí)間為8h。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后的培養(yǎng)液在4°C下、12000 Xg離心20 min，收集菌體，再用冰冷的20mmol/L磷酸鉀緩沖液洗滌菌體2次，以用于后續(xù)的偶聯(lián)系統(tǒng)。
[0022]二、釀酒酵母(本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)藏)的培養(yǎng):
1.培養(yǎng)基:斜面培養(yǎng)基的組成為8°P麥汁，瓊脂2%，pH 5.5 ;液體培養(yǎng)基(g/L)的組成為葡萄糖20，蛋白胨20， 酵母膏10，pH 5.5。
[0023]2.培養(yǎng)方法(I)斜面培養(yǎng):接種后的斜面置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，保藏于冰箱冷藏室，每月至少轉(zhuǎn)接一次。
[0024](2)液體培養(yǎng):將斜面種子30°C活化3-4 h，取一環(huán)菌體接種至裝有50mL的液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng)，在搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、溫度30°C條件下，培養(yǎng)時(shí)間19 h。然后將培養(yǎng)好的培養(yǎng)液按照10% (v/v)的接種量，接種至裝有50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵，在搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、溫度30°C條件下，培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)液在4°C下、6000 Xg離心20 min,收集菌體,再用冰冷的20 mmol/L磷酸鉀緩沖液洗漆菌體2次，以用于后續(xù)的偶聯(lián)系統(tǒng)。
[0025]三、大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)合成S-腺苷甲硫氨酸:
按4:1的比例稱取大腸桿菌BL21 (pET-28a-SAMS)與釀酒酵母濕菌體進(jìn)行混合，加入率禹合系統(tǒng)反應(yīng)液(包括:200 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L腺苷(Ado), I mmol/L單磷酸腺苷(AMP), 0.1 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，30 mmol/L MgCl2 *6H20,30 mmol/L L-蛋氨酸(L-Met), 200 mmol/L磷酸鉀緩沖液，用0.5 mol/L氫氧化鉀調(diào)pH=7.0)，加入5%(v/v)甲苯，在搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、溫度37°C條件下，振蕩反應(yīng)5 h后離心收集上清，測定上清中SAM含量。
[0026]四、S-腺苷甲硫氨酸含量的測定
樣品中SAM的含量可通過HPLC的反相C18柱進(jìn)行分析檢測，具體測定條件為:流動(dòng)相為0.01mol/L甲酸銨(甲酸調(diào)pH3.5，0.22Mm水膜過濾):甲醇=97:3，流速I mL/min，柱溫30°C，檢測波長254 nm。檢測結(jié)果見圖1A及圖1B。
[0027]采用外標(biāo)法 ，根據(jù)不同濃度的SAM標(biāo)準(zhǔn)品峰面積繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)對(duì)樣品中的SAM進(jìn)行定量。當(dāng)添加50 mg (菌體)/mL緩沖液時(shí)，SAM濃度可達(dá)55 mg/1,即每毫克菌體產(chǎn)生SAM量為1.2。
[0028]以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用來限定本發(fā)明實(shí)施的范圍。故但凡依本發(fā)明的權(quán)利要求和說明書所做的變化或修飾，皆應(yīng)屬于本發(fā)明專利涵蓋的范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)合成S-腺苷甲硫氨酸的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的大腸桿菌工程菌株BL21/pET-28a-SAMS與釀酒酵母分別在適宜的條件下發(fā)酵培養(yǎng)后收集菌體； (2)按一定比例將上述大腸桿菌與釀酒酵母菌體進(jìn)行混合偶聯(lián)，并加入耦合系統(tǒng)反應(yīng)液；其中，大腸桿菌提供SAMS及合成SAM的場所，釀酒酵母提供足夠的ATP ； (3)使用有機(jī)溶劑作為通透劑對(duì)偶聯(lián)細(xì)胞進(jìn)行通透化處理，使SAM在大腸桿菌中合成，并被分泌到細(xì)胞外； (4)反應(yīng)結(jié)束后離心收集上清，得到S-腺苷甲硫氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)合成S-腺苷甲硫氨酸的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中，大腸桿菌工程菌株BL21/pET-28a-SAMS的培養(yǎng)過程為:將含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的大腸桿菌工程菌株BL21/pET-28a-SAMS培養(yǎng)到OD6tltl為0.5~1.5時(shí),加入2~8 mg/mL乳糖或0.1^1.0 mmol/L異丙基-D-硫代半乳糖苷作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)溫度為25~37 °C，誘導(dǎo)時(shí)間為5~16 h，以誘導(dǎo)表達(dá)一定量的S-腺苷甲硫氨酸合成酶 SAMS。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)合成S-腺苷甲硫氨酸的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中，釀酒酵母的培養(yǎng)過程為:將釀酒酵母在搖床轉(zhuǎn)速17(T200 r/min、溫度28~30°C條件下，培養(yǎng)時(shí)間17~22 h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)合成S-腺苷甲硫氨酸的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中，所述大腸桿菌與釀酒酵母濕菌體質(zhì)量混合比例為0.5~5:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)合成S-腺苷甲硫氨酸的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中,稱合系統(tǒng)混合反應(yīng)液包括:200 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L腺苷，I mmol/L單磷酸腺苷，0.1 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，30 mmol/L MgCl2 *6H20,30mmol/L L-蛋氨酸,200 mmol/L磷酸鉀緩沖液，用0.5 mol/L氫氧化鉀調(diào)pH=7.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)合成S-腺苷甲硫氨酸的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中，以0.5飛％甲苯或0.5%甲醇或0.5%丙酮作為所述的通透劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的大腸桿菌與釀酒酵母偶聯(lián)合成S-腺苷甲硫氨酸的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中，其反應(yīng)條件為:搖床轉(zhuǎn)速為15(T200 r/min、溫度為25~37°C，偶聯(lián)反應(yīng)2~8 h。
【文檔編號(hào)】C12P19/40GK103757086SQ201410009868
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】杜翠紅, 魏曉楠 申請(qǐng)人:集美大學(xué)