專利名稱：利用大腸桿菌制備可用來檢驗c型肝炎之抗原蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于制備檢驗C型肝炎抗原蛋白的方法。
自從1970年代引進對捐贈的血液做B型肝炎病毒的篩檢之后，經由輸血途徑而感染的B型肝炎病例就已大幅減少。然而，還是有許多經由輸血而感染的肝炎病例是由病毒所引起。造成這類的肝炎，通常不是A型肝炎病毒(Hepatitis A virus HAV)也不是B型肝炎病毒(Hepatitis B virus;HBV)，故稱為非A非B型肝炎(NANBH)。這種病毒所引起的肝炎成為目前臨床上很嚴重的問題，因為它幾乎占所有輸血后感染的肝炎病例的90%以上。而且感染者多半會演變?yōu)槁愿窝?，進而發(fā)展成為肝硬化或肝癌。引起這種非A非B型肝炎的病毒，雖然長久以來許多人的努力研究，一度還是非常不清楚，直至美國Chiron公司，Choo等人(Science 244;359-362，1989)發(fā)現(xiàn)了一個單股RNA病毒可能是造成這個非A非B型肝炎的主要病原后，才對輸血感染的非A非B型肝炎有進一步的了解，現(xiàn)在這個RNA病毒被稱為C型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)其實HCV在感染個體的血液中，存在甚微，故到目前為止都無法直接分離出病毒或由顯微鏡觀察到這個病毒。這也是為什么長久以來都一直無法突破的原因。Choo等人則是利用由病人得來的血液直接拿去感染黑猩猩，再由黑猩猩血液中分離出的病毒RNA做成一個gt 11的基因庫，然后利用病人的血清進行篩選。經由此法，他們找出一段HCV的DNA片斷(5-1-1)，而這個片斷所表達出來的抗原，雖然可與肝炎病患的血清有特殊的結合反應。這才開始有了關于HCV的研究。他們進一步將陸續(xù)找到的其他小cDNA片斷連接在一起成為一段較長的cDNA，稱之為C100-3。再以酵母菌的表達載體表達C100-3片斷成為抗原蛋白以后，便以酶免疫分析法來檢驗大批由美國、意大利或日本得來的C型肝炎病患的血清樣品，結果發(fā)現(xiàn)70-80%以上的血清均與這個抗原反應。進一步證實大部分的非A非B型肝炎的確是由HCV所引起的。
經過多個實驗室的努力，HCV的基因組(genome)目前已全部被克隆出來。它是一個約10kb長，正股的RNA所組成。利用序列相似性質(sequence homology)來分析，HCV非常類似于黃病毒(屬)(flavivirus)及瘟病毒(屬)(pestivirus)，但并非完全相同。這個病毒全長基因組僅可合成一個約3011個氨基酸長的蛋白質。顯然這個長的蛋白質分子需再經過進一步的裂解(cleavage)而變?yōu)榇蟠笮⌒〔煌牟《镜鞍踪|。若以黃病毒(屬)的基因組來看的話，它所形成的病毒蛋白質主要包括(由N端數(shù)起)核心(nucleocapsid，C)，膜蛋白(membrane)，外套蛋白(envelope，E)及五個非結構蛋白(nonstructrural proteins，NS1-NS5);而若由瘟病毒的基因組來看，則除了核心蛋白(C)以外，就是兩個外套蛋白(E1及E2，均是醣蛋白(glycoprotein))，而非結構蛋白質則只有四個(NS2-NS5)。HCV則非常類似于后者的結構，即在核心蛋白之后，有兩個糖蛋白(E1，NS1/E2)，其后是四個非結構蛋白(NS2-NS5);其正確的結構及所合成的蛋白質大小及功能等仍有待確定。
檢驗血液中心的血液樣品，勢必是一個防止HCV所造成輸血后感染肝炎的主要策略。為此，Chiron公司已將其所得的HCV DNA片斷(C100-3)克隆在一個酵母菌表達載體內做成一個檢驗試劑。事實上這個載體上還有一段類超氧化歧化酶(superoxide dismutase)(SOD)的基因。HCV的片斷與SOD形成一融合蛋白(fusion protein)，由SOD的154個氨基酸與HCV的363個氨基酸所組合而成。這個C100-3是一個非結構蛋白區(qū)域(NS-4及部分之NS-3)所剪接下來的，其序列在不同國家所分離出的HCV基因組(genome)上均非常相似故用以檢驗不同HCV分型相當有效。但這個檢驗試劑也并非完美無缺，因為事實上，C100-3所測出的HCV發(fā)生率也只有70-80%左右的C型肝炎而已。為什么會如此呢？可能因為NS-4是一個非結構蛋白，當病毒感染個體之后，要引發(fā)抗體出現(xiàn)，來對抗這些非結構蛋白質，所需要的時間較長，或許要達半年以后才會出現(xiàn)，故而利用C100-3來測定時，有可能造成假陰性的結果。而且，當病人血液呈現(xiàn)較低反應數(shù)值時，同樣是利用Chiron抗原所做成的Abbott及Ortho兩家產品，常就出現(xiàn)互相矛盾的結果。另外，又有些有自體免疫(auto-immune)疾病的人，其血清可能已存有對SOD的抗體，故用此檢驗試劑來檢測時，必有假陽性的結果。
本發(fā)明的目的是要提供一種制備可用來檢驗C型肝炎病毒(HCV)的抗原蛋白質的方法，并以此抗原作為HCV檢驗試劑用以補償目前HCV檢驗試劑的缺點，提供更準確的檢驗結果。
本發(fā)明針對目前對HCV的了解，以及目前所用試劑的缺點，特別選擇了以結構蛋白為主要的基因(在此指核心蛋白，nucleocapsid)，利用大腸桿菌表達載體，以重組基因的技術，從而表達出大量的抗原蛋白。而且此抗原蛋白不具有任何其他額外的、不必要的序列。
本發(fā)明首先從選定的非A非B型肝炎病人的血液中，分離出病毒RNA，再利用日本文獻(Jpn.J.Exp.Med.60167-177，1990)所發(fā)表的部分HCV序列，以化學合成法合成一對引子，用RNA反轉錄及聚合酶連鎖反應(RT-PCR)的方法先行合成一段HCV的cDNA片斷，這個片斷包涵了5′未譯區(qū)(untranslated region)，及核心蛋白(core)區(qū)域。由PCR得來的cDNA片斷，并進行全長的DNA定序工作，而得到這部分屬于臺灣地區(qū)的HCV isolate的序列。經與美國發(fā)表的序列，或日本發(fā)表的序列相比較，大約有95%的同原性。然后再根據自己定序出來的序列，在推測的核心蛋白的區(qū)域內，合成另一對引子，并在其C端引子的序列后特意添加-TAA為轉譯終止子(termination codon)，再利用PCR技術，合成核心蛋白基因的片斷，然后直接將此段DNA殖入于大腸菌表達載體的λP轉錄起動子(promoter，P)。這個起動子在大腸桿菌內表達能力很強。為避免它表達太早而影響菌體的生長，我們將這個載體殖入一株含有cI 857抑制子基因的宿主內。這個cI 857基因會制造一種對溫度敏感的抑制子-cI。平常在30℃-32℃培養(yǎng)條件時，這個抑制子會抑制Promoter的表達，但若將溫度升至42℃時，抑制子即會變性而失去抑制的作用。P起動子故而可以表達其所攜帶的基因。利用這個表達系統(tǒng)，經過熱處理幾個小時后，而得到足量的核心抗原蛋白質。然后將細菌用機械方法打破，即可純化，分離出此蛋白質，以作為檢驗試劑之用。
由大腸桿菌所制備的核心蛋白質，利用聚乙酰胺凝膠電泳法分離之后，再以西方墨跡法(west blot)，用C型肝炎病患者的血清來進行結合反應，就可用作檢測C型肝炎之用。


圖1為由RT-PCR所制備HCV cDNA片斷的核甘酸及氨基酸序列圖中核甘酸的序列是根據DNA定序而得，全長共584bp，圖的右邊代表每行序列最后一個核甘酸的相對位置。RT-PCR反應時所用的引子序列(A1及A2)及第二步特別為了核心抗原部分時所做的PCR反應而用的引子序列(C1及C2)分別以方格框起或以箭號表示。作為第二步PCR反應的3′端引子則多含一個轉譯終止子序列(TAA)以使蛋白質轉譯能完成以及一個Sal I(GTCGAC)序列。核心抗原的轉譯起始點(ATG)由第212個核甘酸位置開始。
圖2為表達質體pG408N-C的結構圖中空格部分代表P起動子，為一段約380bp的DNA片斷。陰影部分則代表HCV的cDNA片斷(36 bp)。園圈的細線部分代表pGEM-4的質體部分。
圖3為HCV抗原蛋白質在大腸桿菌內的表達分析含有表達體質的大腸桿菌宿主分別經過30℃培養(yǎng)條件，或42℃熱處理15分鐘后再培養(yǎng)于37℃下3小時，然后把全部菌體離心回收以2X cracking緩沖液溶解，再用12.5%的SDS-聚乙酰胺膠將蛋白質分離(見實例2及3)。To代表未經熱處理誘導，Ta代表經過熱處理誘導。M代表已知蛋白質大小的標記。箭頭所指為的HCV核心抗原的位置。
圖4為利用慢性C型肝炎病患者血清進行西方墨跡法分析其中類似圖3中所述的方法，菌體蛋白質在經過電泳膠分離后，即以四位病人(1-4)及一位正常人(5)的血清進行西方墨跡法分析(見實例3)。箭頭所指則代表經過熱誘導而表達出來的蛋白質，其能夠為病人血清所認別，但在(N)正常人的血清中，這個新表達出來的蛋白質則不能被識別。
實例1HCV核心抗原蛋白質的cDNA片斷的克隆為篩選臺灣區(qū)HCV病毒的cDNA，根據最近發(fā)表的日本病毒株的部分序列(Jpn.J.Exp.Med.60167-177，1990)，分別作成兩個引子A1及A2(見圖1)。并利用這對引子，以醫(yī)院病患血液中的病毒為材料，進行RT-PCR。
首先將100μl的患者血清置于試管中，并加入500μl的變性溶液(4M硫氰酸鈉鹽;25mM檸檬酸鈉pH7.0;0.5% Sarcosyl;0.1M β-巰基乙醇)混合均勻，依次加入60μl 2M檸檬酸鈉(PH4.0)，600μl以水飽和的酚，以及120μl的氯仿∶異戊醇(49∶1)，劇烈混合30秒以后，在冰上靜置15分鐘。然后以10000rpm.4℃下離心10分鐘，取出上層液至另一新試管內，加入等體積的異丙醇及10μg的糖原后，混合均勻，于-20℃靜置過夜(或-70℃，1小時)以沉淀RNA。再以12000rpm.4℃，離心20分鐘，將上清液除去，以75%酒精洗去RNA沉淀中的鹽分后，以真空干燥器除去剩余的酒精。將RNA溶于適量(約5μl)的水中，并準備進行RT-PCR。
RT-PCR第一步先進行反轉錄反應。將前述RNA加水至6.5μl，以沸水煮5分鐘后，迅速置于冰水冷卻，稍許離心后，加入反應試劑10X PCR緩沖液2μl;10mM dATP 2μl;10mM dTTP 2μl;10mM dCTP 2μl;10mM dGTP 2μl;random hecamer(100ng/μl)2μl;RNasin(40u/μl)0.5μl 2μl;MuL V RT(200u/μl)1μl;[10X PCR緩沖液成分如下500mM KCl，100mM Tris-HCl pH8.3，15mM MgCl2，0.1%(W/V)明膠(可省略)]混合均勻，于37℃下反應1小時。而后將樣品加熱5分鐘，迅速置于冰上冷卻備用，然后PCR專用的試管中，加入下列試劑38μl H2O，4.5μl 10XPCR緩沖液，A1及A2引子各1μl(100ng/ul)，0.5μl Tag DNA聚合酶(5u/μl)，及5μl上述之反轉錄反應產物。當所有試劑混合均勻后，在液面加入50μl的礦物油隨即將試管置于the rmal cycler儀器(Perkin Elmer Cetus)內，設定反應條件為94℃，30秒;60℃，30秒;及74℃，90秒為一循環(huán)。
經過35個循環(huán)后而得大量的0.587kb的cDNA片斷。然后將此cDNA片斷克隆入pGem-4Z載體，得一pHCV C-4的質體然后再利用Sanger的方法進行DNA定序(見圖1)。由圖1中的序列我們知道HCV的蛋白質轉譯是由第212個核甘酸的位置(ATG)開始的。若與黃病毒(屬)的序列比較，核心蛋白在全長的蛋白質的N端。而由文獻推測，核心抗原大約含有190個左右的氨基酸(J.Gen，Virol，71;3027-3033，1990)，由此得之我們制得到的cDNA片斷僅含其N端的119氨基酸序列。
為了利用大腸桿菌來表達這段核心蛋白基因，再設計了另一對引子C1及C2(圖1)，以pHCV C-4為模板，將屬于核心蛋白范圍的DNA序列，以PCR的方法再行擴增出來。PCR反應中所用的模板DNA為1ng，C1及C2引子各為1μg，加入10μl的10X PCR反應溶液及200μM的四種核甘酸(dATP，dGTP，dCTp及dTTP)后，即加水至100μl的體積及2.5units的Tag聚合酶。反應條件為94℃，1分鐘;37℃，2分鐘;72℃，3分鐘為一循環(huán)，全部共進行25個循環(huán)而得大量的核心蛋白基因的片斷。因其C2引子的3′端設計有Sal I的序列，故將PCR所擴增產生的核心抗原cDNA片斷以Sal I限制酶切過后，即接入以PvuII及Sal I切過的表達載體pG408N，其上帶有λP起動子，而得到新的質體pG408N-C(見圖2)。
實利2HCV核心抗原蛋白的誘導表達由實例1中所得的pG408N-C質體首先我們采用Hanahan的方法(J.Mol.Biol.165557-580，1983)將大腸桿菌先在30℃條件下以5ml的M9-CA培養(yǎng)基(1升中含有Na2SO46g，KH2PO43g，NaCl 0.5g，MgCl21g，上述經配好，調pH至7.4，經滅菌之后，再加入下列無菌溶液(1M MgSO42ml，1M CaCl20.1ml，20%葡萄糖10ml，20%Casamino Acid 10ml)培養(yǎng)過夜，第二天再以1/20比例接種到10ml的新鮮M9-CA培養(yǎng)液內，繼續(xù)在30℃培養(yǎng)約3-4小時，直到菌體濃度達到OD值＝0.3-0.5左右，接著把菌體置于42℃恒溫水槽中15分鐘。經過熱處理后的菌體，再繼續(xù)培養(yǎng)在37℃，3小時，即可離心沉淀下菌體。以上經過3小時熱誘導的大腸桿菌內會有大量的核心抗原蛋白質的產生。反之，若僅在30℃培養(yǎng)的菌體內則無此蛋白質產生。利用聚乙酰胺膠電泳分析，此結果(圖3)。這表明這個蛋白質的確是由Promoter起動子帶動所表達出來的。
實例3HCV核心抗原蛋白質的分析由于HCV蛋白質尚無任何單元抗體的生產，故為了鑒定實例2中所制備的蛋白質是否是HCV有關的抗原蛋白，我們只能以經過亞培檢驗試劑檢定及臨床結果已確定為C型肝炎之病患血清進行西方墨跡法的分析。首先我們取1ml分別在30℃培養(yǎng)或經過42℃熱誘過的大腸桿菌液，經過離心，沉淀下菌體，再以2Xcracking，緩沖液(100mM Tris-HCl，pH6.8;2%SDS;20%丙三醇;20%β-巰基乙醇;4mM EDTA;0.01%溴酚藍)加以沖調，使菌體濃度達OD＝10。然后煮沸5分鐘，離心除去沉淀物，取出15μl加入準備好的含有0.1%SDS的12.5%聚乙酰胺膠，用電泳法，將大小不同的蛋白質分開，然后立即將膠上的蛋白質依其相對位置轉印至硝化纖維紙(nitrocellulose)上。
此硝化纖紙再用5%BSA/TBS(0.05M Tris pH7.6;0.9%NaCl)做封阻，防止抗體隨意吸附至纖維紙的其他空白處。然后把處理過的硝化纖維紙與病人血清(以3% BSA/TBS 1∶500稀釋)作結合反應。反應后的硝化纖維紙立刻用清洗液(0.25%Tween-20/TBS)清洗6次(輕輕振蕩，每次10分鐘)，以除去沒有與抗原蛋白質結合的抗體。清洗過的硝化纖維紙再以接有堿性磷酯酶的山羊抗人類Ig抗體(以3%BSA/TBS 1∶3000倍稀釋)作第二次結合反應。反應后，同樣以上述清洗液清洗6次，最后再用緩沖液A(100mM Tris-HCl，pH9.5，100mM NaC1.50mM MgCl2)清洗一次，然后把硝化纖維紙浸于10ml的受質溶液(10ml緩沖液A+40μl NBT溶液+35μl X-磷酸鹽溶液即成)，(NBT溶液以70%的二甲替用酰胺(V/V)配制成75mg/ml的硝基藍四唑鹽;X-磷酸鹽溶液以70%的二甲替用酰胺(V/V)配制成50mg/ml的5-溴-4-氯-3-茚基磷酸溶液)，做呈色反應。當硝化纖維紙呈色適當后，即可加入TE溶液(10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA)停止反應，最后再以水清洗，即可。
實例4經由上述實例中所敘述的方法，在本實例中利用pG408N-C表達質體以及含有cI857基因的大腸桿菌宿主制備一種檢測C型肝炎用的HCV核心抗原蛋白。經由此法所制備的核心抗原蛋白質產量約占菌體全部蛋白質之10%(圖3)。這種蛋白質確可與經臨床診斷為C型慢性肝炎的病人血清呈陽性反應，但不與正常人的血清反應(圖4)，我們更進一步由臺大醫(yī)院所提供的63個慢性肝炎病人血清(均已經過亞培試劑檢測其anti-C100-3的反應)來驗證核心蛋白的效果。結果發(fā)現(xiàn)其中有46個(35陽性，11個陰性)的結果(76%)與亞培試劑所檢測結果一致;而另有11個血清樣品在亞培試劑無法靈敏測到的情況下，卻能與我們所制備的核心抗原蛋白有很強的結合反應(見表1)。由于臨床上這些病人均已呈現(xiàn)慢性肝炎癥狀，故顯示僅用亞培試劑來檢測，確有漏網之魚，而本發(fā)明所制備的核心抗原卻可以彌補這個缺陷。當然也有2個樣品亞培試劑測出大于2，另有4個樣品，在亞培試劑檢測為低反應者(1.0＞OD＞0.4范圍之內)，而在核心抗原部份卻無明顯反應者;這可能是因為亞培試劑的一誤差范圍之內的結果或此六位病患者尚未有anti-core的抗體產生;但這些推斷仍有待以其他方法來證實之。最主要的是利用本抗原蛋白所診斷出來的結果，大體和由亞培試劑所診斷者相吻合(見表1)，而且本發(fā)明的核心抗原尚能明顯偵測出11個亞培試劑所無法檢測到的血清樣品。另外12位正常人的血清測試結果都呈陰性反應?？偠灾?，利用核心抗原作為檢驗C型肝炎的試劑，可以彌補一些C100-3檢驗試劑所測不到的部份，提供一個更不具假陰性的診斷結果。
表1以西方墨跡法分析NANB肝炎病患對抗HCV核心抗原的抗體反應

注a.以亞培試劑，anti-C100-3，所得的反應結果。
b.臨床診斷的肝炎情形。
c.指病患血清對抗HCV的核心抗原的西方墨漬反應分析結果。
權利要求
1.一種利用大腸桿菌制備可用來檢驗C型肝炎病毒(HCV)的抗原蛋白質的方法，其特征在于制備此種抗原蛋白質的方法包括(a)合成一段HCV的cDNA片斷；(b)從該HCV的cDNA片斷合成HCV的核心抗原cDNA片斷；(c)將該核心抗原cDNA片斷克隆到以PvuⅡ及SalⅠ切過的表達質體pG408N的P1轉錄入起動子，而得到的質體pG408N-C；(d)將所得到的pG408N-C質體轉入含有cI857基因的大腸桿菌；(e)將該菌在30℃下培養(yǎng)，菌濃度至0.D680=0.3-0.5，再升溫至40-43℃；(f)再于36-38℃下培養(yǎng)；(g)分離菌體而得到HCV的抗原蛋白質。
2.按照權利要求1所述利用大腸桿菌制備可用來檢驗C型肝炎(HCV)病毒的抗原蛋白的方法，其特征在于步驟(e)是再升溫度至42℃。
3.按照權利要求1所述利用大腸桿菌制備可用來檢驗C型肝炎(HCV)病毒的抗原蛋白的方法，其特征在于步驟(f)是在37℃下培養(yǎng)。
4.按照權利要求1所述利用大腸桿菌制備可用來檢驗C型肝炎(HCV)病毒的抗原蛋白的方法，其特征在于所制備的HCV抗原蛋白質具有以下的氨基酸序列Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys 10Thr Lys Arg Asn Thr Arg Arg Arg Pro Gln 20Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile 30Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg 40Gly Pro Arg Ieu Gly Val Arg Ala Thr Arg 50Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly 60Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gln 70Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly 80Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly 90Leu Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro 100Arg Gly Ser Arg Pro Asn Trp Gly Pro Thr 110Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly 120Ter.
全文摘要
本發(fā)明是利用大腸桿菌的表達系統(tǒng)，表達一段C型肝炎病毒(HCV)核心抗原部分的DNA片段。經過熱誘導表達出來的蛋白質，能專一性地被大部分感染有非A非B型肝炎病人的血清所識別，但不被健康人血清所識別。利用此抗原蛋白進行的C型肝炎的診斷結果，與利用亞培試劑的抗C100-3診斷結果相比，本發(fā)明所制備的抗原蛋白比亞培試劑的診斷結果靈敏，且能相輔相成，降低假陰性的結果。因而由本發(fā)明所制備的抗原蛋白質，可作為檢驗C型肝炎的一種良好檢驗試劑。
文檔編號G01N33/576GK1086264SQ9211118
公開日1994年5月4日 申請日期1992年9月29日 優(yōu)先權日1992年9月29日
發(fā)明者陳培哲, 陳定信 申請人:天津普生生物科技有限公司