表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜專化型菌株fon-gfp及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒ON-GFP及其制備方法和應(yīng)用，提供帶有綠色熒光蛋白的真菌表達載體，該載體含有潮霉素B抗性基因hph和綠色熒光蛋白基因gfp，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該載體轉(zhuǎn)化尖孢鐮刀菌西瓜?；途阹ace1，轉(zhuǎn)化子能夠表達綠色熒光蛋白，將轉(zhuǎn)化菌株分別侵染嫁接砧木和西瓜的根，通過實時監(jiān)測熒光菌株來準確分析尖孢鐮刀菌西瓜?；途谥仓旮拖屡咻S組織中的侵染情況。本發(fā)明具有快速簡便且可以實時指示尖孢鐮刀菌西瓜專化型菌侵染途徑的特點，且本發(fā)明提供的方法適用于多種絲狀真菌，可廣泛應(yīng)用于科研領(lǐng)域。
【專利說明】表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜專化型菌株FON-GFP及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)中的基因工程領(lǐng)域，尤其涉及表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒ON-GFP及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]西瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌西瓜專化型oxyxporum f.sp.niveum,F0N)侵染導(dǎo)致的土傳真菌病害，是嚴重制約西瓜生產(chǎn)的病害之一。根據(jù)西瓜品種對病菌表現(xiàn)出的不同的抗感反應(yīng)，已報道有4種尖孢鐮刀菌西瓜?；偷纳硇》N，分別為O、1、2和
3。綠色突光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一種廣泛應(yīng)用的報告基因，具有穩(wěn)定、直觀、操作方便等的熒光特性，以其作為報告基因已被成功應(yīng)用于絲狀真菌分子生物學(xué)研究中。 [0003]西瓜Jaaate1S)是一類重要的瓜果類作物。我國是西瓜生產(chǎn)大國，約占世界蔬菜種植總面積的6%,居世界首位(http://faosta t.fa0.0rg/)。西瓜枯萎病是嚴重危害西瓜生產(chǎn)的土傳真菌病害，砧木嫁接是防治該病害的主要技術(shù)手段。枯萎病菌侵染寄主植株是一個復(fù)雜的過程，通過熒光電子顯微鏡觀察，將病菌侵染過程分為以下幾個步驟:根系識別并附著、菌絲通過不同的根部組織滲透、菌絲在木質(zhì)部擴散、侵染植株維管系統(tǒng)(Pietro et al.，2003)。目前，已有學(xué)者報道了通過實時監(jiān)測GFP-熒光標記的尖孢鐮刀菌西瓜?；途秩疚鞴系倪^程，如研究發(fā)現(xiàn)侵染后12h-l天，病菌主要在根表面生長萌發(fā)。接種后第3天，菌絲沿根縱向凹槽平行生長、擴散，然后在某一位點滲透表皮細胞，形成附著胞。接種后第5天，根表面已經(jīng)全部被菌絲體覆蓋，至接種后第7-8天，菌絲穿過皮質(zhì)層到達根的中央導(dǎo)管，在木質(zhì)部導(dǎo)管中生長(LU et al., 2011)。相比之下，關(guān)于砧木嫁接提高西瓜抗枯萎病的研究主要集中于嫁接植株的生理生化方面，而未見有關(guān)尖孢鐮刀菌西瓜專化型菌在嫁接砧木中的侵染特性，尤其是嫁接砧木對病原菌的定植拮抗方面的報道。因此，了解尖孢鐮刀菌西瓜?；途诩藿诱枘局械那秩咎匦?，并比較其在西瓜中的侵染差異，對于深入了解砧木嫁接抗病機理具有重要的理論意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]解決的技術(shù)問題:針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒ON-GFP及其制備方法和應(yīng)用。
[0005]技術(shù)方案:表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒0N-GFP，其特征在于由以下步驟制備而得:
(1)設(shè)計引物trpcp-f和trpcp-r,以pBARGPEl質(zhì)粒為模板,擴增啟動子trpC基因，獲得了 365bp的trpC條帶，即為trpC基因，引物trpcp-f、引物trpcp-r和trpC基因序列分別如 SEQ NOl、SEQ N02、SEQ N03 ；
(2)采用Gateway克隆技術(shù)，通過BP和LR兩步反應(yīng)，將trpC基因置換到pMDC83載體中，PCR擴增獲得一條1436bp的條帶，即由啟動子trpC啟動的綠色熒光蛋白表達盒“trpC+GFP+nos”(如圖2B)，將含有此表達盒的質(zhì)粒命名為pWM10，“trpC+GFP+nos”表達盒的序列如SEQ N04 ；
(3)再以pWMIO質(zhì)粒DNA為模板擴增“trpC+GFP+nos”基因，將擴增產(chǎn)物割膠回收后連接到pGEM-T easy載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，通過藍白斑篩選陽性克隆并提取大腸桿菌DH5 a質(zhì)粒；
(4)將大腸桿菌DH5a質(zhì)粒和pBC-hygro載體質(zhì)粒同時進行雙酶切，利用T4 DNA連接酶對酶切產(chǎn)物進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)，篩選陽性克隆，對陽性克隆分別進行PCR擴增和雙酶切驗證，然后測序鑒定，構(gòu)建了表達載體pBC-GFP ；
(5)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將表達載體pBC-GFP轉(zhuǎn)入尖孢鐮刀菌西瓜?；途昊蚪M中，獲得了表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒0N-GFP。
[0006]上述所述的表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒ON-GFP的制備方法包括以下步驟:
(1)設(shè)計引物trpcp-f和trpcp-r,以pBARGPEl質(zhì)粒為模板,擴增啟動子trpC基因，獲得了 365bp的trpC條帶，即為trpC基因，引物trpcp-f、引物trpcp-r和trpC基因序列分別如 SEQ NOl、SEQ N02、SEQ N03 ；
(2)采用Gateway克隆技術(shù)，通過BP和LR兩步反應(yīng)，將trpC基因置換到pMDC83載體中，PCR擴增獲得一條1436bp的條帶，即由啟動子trpC啟動的綠色熒光蛋白表達盒“trpC+GFP+nos”，將含有此表達盒的質(zhì)粒命名為pWMIO，“trpC+GFP+nos”表達盒的序列如SEQ N04 ；
(3)再以pWMIO質(zhì)粒DNA為模板擴增“t`rpC+GFP+nos”基因，將擴增產(chǎn)物割膠回收后連接到pGEM-T easy載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，通過藍白斑篩選陽性克隆并提取大腸桿菌DH5 a質(zhì)粒；
(4)將大腸桿菌DH5a質(zhì)粒和pBC-hygro載體質(zhì)粒同時進行雙酶切，利用T4 DNA連接酶對酶切產(chǎn)物進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)，篩選陽性克隆，對陽性克隆分別進行PCR擴增和雙酶切驗證，然后測序鑒定，構(gòu)建了表達載體pBC-GFP ；
(5)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將表達載體pBC-GFP轉(zhuǎn)入尖孢鐮刀菌西瓜專化型菌株基因組中，獲得了表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒0N-GFP。
[0007]上述所述的步驟(4)中雙酶切位點為XbaI和HindIII。
[0008]上述所述的步驟(4)構(gòu)建的表達載體pBC-GFP應(yīng)用于多種絲狀真菌的侵染機制研究。
[0009]上述所述的表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒ON-GFP應(yīng)用于嫁接砧木和西瓜根植株侵染過程。
[0010]上述所述的表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒ON-GFP在嫁接砧木和西瓜根植株侵染過程中的應(yīng)用，其步驟如下:
(O挑取尖孢鐮刀菌西瓜?；途昙尤腭R鈴薯培養(yǎng)基中，25°C，150rpm搖床上培養(yǎng)5^7天后，過濾，調(diào)整孢子液濃度為IxlO6個/mL;
(2)采用孢子浸根接種法接種，將植株從基質(zhì)中移出，沖洗植株根上附著的基質(zhì)，將主根根尖切去1cm，浸根15-30 min，中間搖動2_3次，浸根完成后，將植株再次定植到營養(yǎng)缽中，接種后在26~30°C條件下培養(yǎng)；
(3)于接菌后 0、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168、192、240、336h 分別取 5~8 株西瓜和嫁接砧木的根和莖，將根和莖用去離子水洗滌后放在載玻片上，采用德國Leica TCSSP2激光共聚焦掃描顯微鏡進行觀察，設(shè)置GFP和葉綠素的激發(fā)波長均為488 nm, GFP發(fā)射波長的選擇范圍為50(T515 nm，葉綠素發(fā)射波長的選擇范圍為63(T670 nm，記錄的圖形數(shù)據(jù)導(dǎo)入Adobe Photoshop7.0進行處理。
[0011]有益效果:本發(fā)明提供表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒ON-GFP及其制備方法和應(yīng)用，將轉(zhuǎn)化GFP的尖孢鐮刀菌西瓜?；途鶩ON-GFP分別侵染嫁接砧木和西瓜的根，通過實時監(jiān)測熒光菌株以準確的確定尖孢鐮刀菌西瓜專化型菌在植株根和下胚軸中的侵染情況，因此，具有以下優(yōu)點:
(O應(yīng)用領(lǐng)域廣:可應(yīng)用于多種絲狀真菌的侵染機制研究；
(2)操作簡單:僅需搖培孢子液即可進行侵染后觀察；
(3)現(xiàn)象直觀:在接種后，可采用熒光顯微鏡直接觀察孢子的萌發(fā)及侵染途徑，便于掌握尖孢鐮刀菌西瓜?；途谥仓曛械那秩緞討B(tài)，有利于明確嫁接砧木對尖孢鐮刀菌西瓜?；途共C制。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1:pBC-GFP表達載體的PCR檢測及酶切鑒定圖，其中M:DL 2000 DNA Marker ；I:trpC 基因的 PCR 擴增；2-4 trpC+GFP+nos”表達盒的 PCR 擴增；5 trpC+GFP+nos”表達盒的酶切鑒定。
[0013]圖2:表達綠色熒光`蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜專化型菌株FON-GFP的熒光觀察圖，其中灰色的部分表示綠色熒光。
[0014]圖3 =FON-GFP熒光菌株在西瓜自根和嫁接砧木根中的侵染途徑(接種后4_72h)； A, D:孢子在西瓜自根和嫁接站木根表皮附著(接種后4h);B, E:菌絲松散的附著在西
瓜自根和嫁接砧木根表皮(接種后12h) ；C, F:西瓜自根和嫁接砧木根表皮菌絲增加(接種后24h) ；G, J:西瓜自根和嫁接砧木根表皮大量菌絲附著并沿表皮生長(接種后48h) ；H, I:菌絲向西瓜根皮層入侵(接種后72h，H:縱切；1:橫切)；K，L:菌絲在嫁接砧木根表皮附著，未向嫁接砧木根皮層入侵(接種后72h，K:縱切；L:橫切)。
[0015]圖4 =FON-GFP熒光菌株在西瓜自根和嫁接砧木根中的侵染途徑(接種后96-360h)；
A，D:菌絲體遍布西瓜自根和嫁接砧木根表皮(接種后96h) ；B, C:菌絲沿細胞縫隙在西瓜根皮層中擴展(接種后120h，B:縱切；C:橫切);E，F(xiàn):菌絲在嫁接砧木根表皮附著，仍未向嫁接砧木根皮層入侵(接種后120h，E:縱切；F:橫切);G:菌絲侵入西瓜根木質(zhì)部導(dǎo)管(接種后144h) ；1:砧木根木質(zhì)部導(dǎo)管中未見菌絲(接種后144h) ；H:西瓜根木質(zhì)部導(dǎo)管中的少量菌絲(接種后168h) ；K:砧木根木質(zhì)部導(dǎo)管中未見菌絲(接種后168h) ；I, M:菌絲沿西瓜根導(dǎo)管生長(接種后192h，1:縱切；M:橫切)；L, P:砧木根導(dǎo)管中未見菌絲(接種后192h，L:縱切；P:橫切);N:西瓜根下胚軸導(dǎo)管中的菌絲(接種后240h) ；Q:砧木根下胚軸導(dǎo)管中未見菌絲(接種后240h);0:西瓜根上胚軸導(dǎo)管中的菌絲(接種后360h);R:砧木根上胚軸導(dǎo)管中未見菌絲(接種后360h)?！揪唧w實施方式】
[0016]本實施方式中的pBARGPEl質(zhì)粒和pBC-hygro質(zhì)粒購于長沙贏潤生物技術(shù)有限公司，Gateway載體構(gòu)建系統(tǒng)、Gateway克隆技術(shù)、pMDC83載體購于Invitrogen公司，pGEM_T easy載體購于Promega公司，T4 DNA連接酶購于Takara公司,尖孢鐮刀菌西瓜?；途陙碜杂趪沂卟斯こ碳夹g(shù)研究中心，OLYMPUS DP72熒光顯微鏡購于日本東京Olympus公司。
[0017]本實施例中的大腸桿菌DH5CI感受態(tài)制備方法參考《分子克隆實驗指南第三版》，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法參考(Mullins等，Phytopathology, 2001,91 (2): 173-180)，馬鈴薯培養(yǎng)基配制方法參考《分子克隆試驗指南第三版》。
[0018]實施例1 1、真菌表達載體pBC-GFP的構(gòu)建
(1)真菌啟動子trpC基因片段的獲得
根據(jù)pBARGPEl質(zhì)粒上trpC的基因序列，結(jié)合Gateway載體構(gòu)建系統(tǒng)的特點，設(shè)計含有attB位點的trpC基因特異性引物trpcp-f和trpcp-r,以pBARGPEl質(zhì)粒為模板,擴增啟動子trpC基因，獲得了 365bp的trpC條帶(如圖1:A),即為trpC基因，引物trpcp-f、引物trpcp-r 和 trpC 基因序列分別如 SEQ NOl、SEQ N02、SEQ N03 ；
(2)采用Gateway克隆技術(shù)，通過BP和LR兩步反應(yīng)，將trpC基因置換到pMDC83載體中，PCR擴增獲得一條1436bp的條帶，即由啟動子trpC啟動的綠色熒光蛋白表達盒“trpC+GFP+nos”(如圖1:B)，將含有此表達盒的質(zhì)粒命名為pWMIO，“trpC+GFP+nos”表達盒的序列如SEQ N04 ；
(3)再以pWMIO質(zhì)粒DNA為模板擴增“trpC+GFP+nos”基因，將擴增產(chǎn)物割膠回收后連接pGEM-T easy載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，通過藍白斑篩選陽性克隆并提取大腸桿菌DH5 a質(zhì)粒；
(4 )將大腸桿菌DH5 a質(zhì)粒和pBC-hygro質(zhì)粒同時進行Xba I和Hindi 11雙酶切，利用T4 DNA連接酶對酶切產(chǎn)物進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)，篩選陽性克隆，對陽性克隆分別進行PCR擴增和雙酶切驗證，然后送上海英駿生物科技有限公司完成測序鑒定，構(gòu)建了表達載體pBC-GFP。
[0019](2)和(4)中的PCR擴增條件相同，為:94 °C預(yù)變性5 min ；94 °C變性30 s，58 V退火40 s,72 °C延伸60 s，30個循環(huán)；最后72 °C延伸10 min ；12 °C保溫。
[0020](4)中的酶切體系和酶切條件如下:
酶切體系__
試劑I反應(yīng)體積/μι —

IOxReactionBuffer 2.0
XbIl1.0
HlndIII1.0
pBC-hygroDNA10
無菌去離子水I補足至總體積20μ1 ~
酶切條件:37°C條件下保溫lh。
[0021]結(jié)果表明，酶切產(chǎn)物大小與“trpC+GFP+nos”基因完全一致(如圖1:C)，證明重組基因在目標載體中結(jié)構(gòu)完整，片段大小沒有發(fā)生變化，因此，重組基因“trpC+GFP+nos”序列正確，并準確插入了目的載體pBC-hygro，成功構(gòu)建了表達載體pBC-GFP。[0022]2、表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒ON-GFP的制備
采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將表達載體pBC-GFP轉(zhuǎn)入尖孢鐮刀菌西瓜?；途昊蚪M中，獲得表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒0N-GFP。用無菌接種環(huán)挑取FON-GFP菌絲制成玻片，采用OLYMPUS DP72熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化菌株的熒光，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熒光顯微鏡下可清晰地看到綠色熒光表達的菌絲體(如圖2:A)和分生孢子(如圖2:B)。
[0023]3、表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒ON-GFP在嫁接砧木和西瓜根中的侵染途徑觀察
Cl)挑取2~3塊0.5cm2的尖孢鐮刀菌西瓜?；途昙尤腭R鈴薯培養(yǎng)基中，25 °C，150rpm搖床上培養(yǎng)5~7天后，用滅菌的4層紗布過濾，采用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子液濃度為 IxlO6 個 ；
(2)采用孢子浸根接種法接種，將植株從基質(zhì)中移出，用自來水沖洗根上附著的基質(zhì)，將主根根尖切去1cm，浸根接種15-30 min,中間搖動2_3次，防止孢子沉降，浸根完成后，將植株再次定植到營養(yǎng)缽中，接種后在26-30°C條件下培養(yǎng)；
(3)于接菌后0、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168、192、240、336h 分別取 5~8 株西瓜和嫁接砧木的根和莖樣品，將材料用去離子水洗滌后放在載玻片上，采用德國Leica TCSSP2激光共聚焦掃描顯微鏡進行觀察。設(shè)置GFP和葉綠素的激發(fā)波長均為488 nm, GFP發(fā)射波長的選擇范圍為50(T515 nm，葉綠素發(fā)射波長的選擇范圍為63(T670 nm，記錄的圖形數(shù)據(jù)導(dǎo)入Adobe Photoshop7.0進行處理。
[0024]結(jié)果表明:接種后4h，孢子松散的附著在根表皮(圖3:A)，12h時，個別孢子萌發(fā)產(chǎn)生菌絲(圖3:B)，24h時，根表皮菌絲量增加(圖3:C),到48h時，可見菌絲大量緊密附著于根毛，但沒有觀察到菌絲向根皮層入侵(圖3:G)，接種后第3天(72h)，可以清楚地看到有單個孢子在入侵點，即表皮細胞的連接處生長，有的孢子已經(jīng)穿過表皮細胞向皮層組織侵入，此外，也可以觀察到萌發(fā)的小分生孢`子和成熟菌絲向皮層滲透(圖3:H、I)。在枯萎病菌接菌4-48h之間，菌絲在嫁接砧木根和西瓜根表皮的附著及生長無差異，接菌72h時，菌絲開始向西瓜根皮層入侵，而在嫁接砧木根中，菌絲仍限于在表皮生長(圖3:K:L)。
[0025]接種后96h (第4天)，GFP觀察顯示其主根已經(jīng)被菌絲體完全包裹，且菌絲在表皮細胞的入侵點也清晰可見(圖4:A)。接種后120h(第4天)，可見根皮層組織已經(jīng)遍布菌絲，菌絲沿皮層細胞間隙生長(圖4:B、C)，此時，菌絲尚未入侵到木質(zhì)部導(dǎo)管，接種后144h (第5天)，個別菌絲已生長到木質(zhì)部導(dǎo)管，可以清楚的看到菌絲向木質(zhì)部導(dǎo)管入侵(圖4:G)。接種后168h (第7天)，植株表型仍然很健康，而此時整個植株的主根和根冠區(qū)已經(jīng)被完全侵染，菌絲已經(jīng)進入到木質(zhì)部導(dǎo)管(圖4:H)。接種后192h (第8天)，菌絲沿木質(zhì)部導(dǎo)管向上擴散(圖4:1、M)，有些植株開始顯癥。接種后240h (第10天)，植株出現(xiàn)明顯病害癥狀，如基部變褐縊縮、發(fā)病植株猝倒等。此時，可見根和下胚軸木質(zhì)部導(dǎo)管中遍布菌絲(圖4:N)。所有植株上胚軸均未被侵染。接種后360h (第15天)，侵染植株已全部死亡，此時，植株上胚軸均已被侵染(圖4:0)。
[0026]通過對受侵染組織橫切和縱切的大量觀察，可以發(fā)現(xiàn)菌絲進入根維管系統(tǒng)后，其以后的生長和擴散均在木質(zhì)部導(dǎo)管中進行，有時菌絲可以穿過木質(zhì)部導(dǎo)管向薄壁細胞侵染。而在莖中，菌絲的生長僅限于木質(zhì)部導(dǎo)管。同樣，我們觀察到菌絲僅在西瓜根中侵染，而在嫁接砧木根及下胚軸中無菌絲侵入(圖4:D、E、F、J、K、L、P、Q、R)。
【權(quán)利要求】
1.表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒ON-GFP，其特征在于由以下步驟制備而得: (1)設(shè)計引物trpcp-f和trpcp-r,以pBARGPEl質(zhì)粒為模板,擴增啟動子trpC基因，獲得了 365bp的trpC條帶，即為trpC基因，引物trpcp-f、引物trpcp-r和trpC基因序列分別如 SEQ NOUSEQ N02、SEQ N03 ； (2)采用Gateway克隆技術(shù)，通過BP和LR兩步反應(yīng)，將trpC基因置換到pMDC83載體中，PCR擴增獲得一條1436bp的條帶，即由啟動子trpC啟動的綠色熒光蛋白表達盒“trpC+GFP+nos”，將含有此表達盒的質(zhì)粒命名為pWMIO，“trpC+GFP+nos”表達盒的序列如SEQ N04 ； (3)再以pWMIO質(zhì)粒DNA為模板擴增“trpC+GFP+nos”基因，將擴增產(chǎn)物割膠回收后連接到pGEM-T easy載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，通過藍白斑篩選陽性克隆并提取大腸桿菌DH5 a質(zhì)粒； (4)將大腸桿菌DH5a質(zhì)粒和pBC-hygro載體質(zhì)粒同時進行雙酶切，利用T4 DNA連接酶對酶切產(chǎn)物進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)，篩選陽性克隆，對陽性克隆分別進行PCR擴增和雙酶切驗證，然后測序鑒定，構(gòu)建了表達載體pBC-GFP ； (5)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將表達載體pBC-GFP轉(zhuǎn)入尖孢鐮刀菌西瓜?；途昊蚪M中，獲得了表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒0N-GFP。
2.如權(quán)利要求1所述的表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒ON-GFP的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)設(shè)計引物trpcp-f和trpcp-r,以pBARGPEl質(zhì)粒為模板,擴增啟動子trpC基因，獲得了 365bp的trpC條帶，即為trpC基因，引物trpcp-f、引物trpcp-r和trpC基因序列分別如 SEQ NO 1、SEQ N02、SEQ N03 `； (2)采用Gateway克隆技術(shù)，通過BP和LR兩步反應(yīng)，將trpC基因置換到pMDC83載體中，PCR擴增獲得一條1436bp的條帶，獲得了由真菌啟動子trpC啟動的綠色熒光蛋白表達盒“trpC+ GFP+nos”，將含有此表達盒的質(zhì)粒命名為pWMIO，“trpC+GFP+nos”表達盒的序列如 SEQ N04 ； (3)再以pWMIO質(zhì)粒DNA為模板擴增trpC+GFP+nos基因，將擴增產(chǎn)物割膠回收后連接到pGEM-T easy載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，通過藍白斑篩選陽性克隆并提取大腸桿菌DH5 a質(zhì)粒； (4)將大腸桿菌DH5a質(zhì)粒和pBC-hygro載體質(zhì)粒同時進行雙酶切，利用T4 DNA連接酶對酶切產(chǎn)物進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)，篩選陽性克隆，對陽性克隆分別進行PCR擴增和雙酶切驗證，然后測序鑒定，構(gòu)建了表達載體pBC-GFP ； (5)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將表達載體pBC-GFP轉(zhuǎn)入尖孢鐮刀菌西瓜專化型菌株基因組中，獲得了表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒ON-GFP。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒ON-GFP的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中雙酶切位點為XbaI和HindIII。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜專化型菌株FON-GFP的制備方法，其特征在于所述步驟(4)構(gòu)建的表達載體pBC-GFP應(yīng)用于多種絲狀真菌的侵染機制研究。
5.表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒ON-GFP在嫁接砧木和西瓜根植株侵染過程中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達綠色熒光蛋白的尖孢鐮刀菌西瓜?；途闒ON-GFP在嫁接砧木和西瓜根植株侵染過程中的應(yīng)用，其特征在于步驟如下: (O挑取尖孢鐮刀菌西瓜?；途昙尤腭R鈴薯培養(yǎng)基中，25°C，150rpm搖床上培養(yǎng)5^7天后，過濾，調(diào)整孢子液濃度為IxlO6個/mL; (2)采用孢子浸根接種法接種，將植株從基質(zhì)中移出，沖洗植株根上附著的基質(zhì)，將主根根尖切去1cm，浸根15-30 min，中間搖動2_3次，浸根完成后，將植株再次定植到營養(yǎng)缽中，接種后在26~30°C條件下培養(yǎng)； (3)于接菌后0、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168、192、240、336h 分別取 5~8 株西瓜和嫁接砧木的根和莖，將根和莖用去離子水洗滌后放在載玻片上，采用德國Leica TCSSP2激光共聚焦掃描顯微鏡進行觀察，設(shè)置GFP和葉綠素的激發(fā)波長均為488 nm，GFP發(fā)射波長的選擇范圍為50(T515 nm，葉綠素發(fā)射波長的選擇范圍為63(T670 nm，記錄的圖形數(shù)據(jù)導(dǎo)入Adobe Photos hop7.0進行處理。
【文檔編號】C12R1/77GK103756920SQ201410009731
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】張曼, 羊杏平, 徐錦華, 劉廣, 姚協(xié)豐, 李蘋芳 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院