一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：（1）尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株分生孢子懸浮液制備；（2）含有外源基因的農(nóng)桿菌菌液制備；（3）尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株的外源基因轉(zhuǎn)化；（4）尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株轉(zhuǎn)化子的鑒定。本發(fā)明利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將外源基因轉(zhuǎn)入尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株的基因組中，獲得了尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型轉(zhuǎn)基因菌株。該方法簡(jiǎn)單、快捷、重復(fù)性好、轉(zhuǎn)化效率高，可用于尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株突變體庫(kù)構(gòu)建、寄主抗性篩選、寄主對(duì)尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株侵染的防衛(wèi)反應(yīng)、以及尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株侵染及致病機(jī)理的研究。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]西瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型侵染引起的維管束系統(tǒng)病害。病菌通過(guò)土壤、種子傳播，在離開(kāi)寄主的情況下，能存活5-6年，厚垣孢子可存活10年以上。西瓜枯萎病在西瓜生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期都會(huì)發(fā)生，據(jù)調(diào)查，發(fā)病瓜田一般減產(chǎn)30%，嚴(yán)重地塊可達(dá)80%，甚至絕產(chǎn)，是國(guó)內(nèi)外西瓜生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害之一，已成為制約西瓜生產(chǎn)的主要障礙。培育優(yōu)質(zhì)抗病且適合設(shè)施栽培的西瓜新品種是有效控制西瓜枯萎病的主要方法，但由于西瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄，優(yōu)質(zhì)抗病種質(zhì)資源極少，再加上對(duì)于尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型的分子遺傳基礎(chǔ)和致病機(jī)制了解不夠透徹，迄今仍沒(méi)有徹底解決問(wèn)題。因此，要有效控制西瓜枯萎病的發(fā)生，首先需要深入研究尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型的侵染過(guò)程和致病機(jī)理，鑒定出控制致病性的關(guān)鍵基因。
[0003]目前，國(guó)內(nèi)外已有利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化真菌的報(bào)道，但已報(bào)道的方法或未涉及轉(zhuǎn)化相關(guān)細(xì)節(jié)，或轉(zhuǎn)化步驟繁瑣。因此，為了獲得帶有標(biāo)記基因的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株，構(gòu)建尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株突變體庫(kù)，急需一種高效、穩(wěn)定且簡(jiǎn)便易行的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法，為研究尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌的侵染過(guò)程和致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)，為深入研究病原菌致病相關(guān)基因、病原菌與寄主互作以及病原菌的功能基因組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]解決的技術(shù)問(wèn)題:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供一種簡(jiǎn)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法。
[0005]技術(shù)方案:一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于包括以下4個(gè)步驟:
(1)尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株分生孢子懸浮液制備；
(2)含有外源基因的農(nóng)桿菌菌液制備；
(3)尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株的外源基因轉(zhuǎn)化；
(4)尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株轉(zhuǎn)化子的鑒定。
[0006]上述所述步驟(1)方法如下:挑取枯萎病菌尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌絲，在馬鈴薯固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，用培養(yǎng)基A收集并稀釋孢子液，調(diào)節(jié)孢子液濃度至IxlO6個(gè)/mL，得到尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株孢子懸浮液，備用；
上述所述步驟(2) 的方法如下:將攜帶表達(dá)載體pGFP的農(nóng)桿菌AGL-1在新鮮的平板A上劃線(xiàn)，28°C培養(yǎng)48 h后，挑取單克隆，接種到5mL培養(yǎng)基B中，于25 °C，220rpm搖培48 h后用紫外分光光度計(jì)測(cè)0D_值，用培養(yǎng)基A稀釋?zhuān)咕?D_=0.15，然后將菌液稀釋液在28°C振蕩培養(yǎng)6 h，得到AGL-1農(nóng)桿菌菌液，備用。
[0007]上述所述步驟(3)的轉(zhuǎn)化方法如下:
1)將步驟(2)中制備的AGL-1農(nóng)桿菌菌液和步驟(1)中制備的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株孢子懸浮液等體積混合，取200 U L混合液均勻涂布于不含抗生素的頂共培養(yǎng)平板上的硝酸纖維素濾膜表面，25 °C避光共培養(yǎng)48 h；
2)共培養(yǎng)48h后，將濾膜揭下，反鋪到培養(yǎng)基C上，25 °C培養(yǎng)48 h ；
3)48h后棄掉硝酸纖維素濾膜，將PDA篩選平板在25 °C繼續(xù)培養(yǎng)至生長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子；
4)用無(wú)菌接種環(huán)挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化子接種到PDA篩選平板上進(jìn)行二次篩選，25°C培養(yǎng)，保存得到的轉(zhuǎn)化子，用于陽(yáng)性鑒定。
[0008]上述所述的步驟(1)、(2)和(3)中的培養(yǎng)基A是加入了 200 Mmol ? L—1乙酰丁香酮的頂液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，IM液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基出自(Bundock等，Eur.Mol.Biol.0rgan.1995,14:3206-3214);平板A是加入了 50 mg ? L—1卡那霉素和50 mg ? L—1利福平的YEB平板，YEB平板是根據(jù)書(shū)本《分子克隆試驗(yàn)指南第三版》制備的；培養(yǎng)基B是加入了 50 mg -L^1卡那霉素和50 mg ? L—1利福平的MM液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，MM液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基出自(Hooykaas等，J.Gen.M1-crobiol.1979，110:99-109);頂共培養(yǎng)平板出自(Bundock 等，Eur.Mol.Biol.0rgan.1995，14:3206-3214);培養(yǎng)基 C 是加入了 60 mg ? I71 鏈霉素和 50 mg ? I71 潮霉素的馬鈴薯固體培養(yǎng)基。
[0009]上述所述步驟(4)的方法如下:
1)采用PCR方法，用綠色熒光蛋白基因的基因特異性引物檢測(cè)轉(zhuǎn)化子中外源基因的整
合；
2)采用OLYMPUSDP72熒光顯微鏡觀(guān)察轉(zhuǎn)化子是否攜帶外源基因。
[0010]上述所述的步驟(4)中的外源基因?yàn)榫G色熒光蛋白基因，綠色熒光蛋白基因的基因特異性引物為:GFP-F:5’ -ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’，GFP-R:5’ -CTCGTCCATGCCGAGAGTGA-3’。
[0011]有益效果:本發(fā)明以尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株為轉(zhuǎn)化體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將外源基因轉(zhuǎn)入到尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株基因組中，獲得尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型轉(zhuǎn)基因菌株，該方法具有以下優(yōu)點(diǎn):
(1)簡(jiǎn)單、快捷:農(nóng)桿菌AGL-1菌液和尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株的孢子懸浮液等體積混勻后無(wú)需再培養(yǎng)，可直接涂布于硝酸纖維素膜表面，48h即可揭膜；
(2)重復(fù)性好:在不同的實(shí)驗(yàn)室由不同的研究人員操作均可獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子；
(3)轉(zhuǎn)化效率高:約為560個(gè)轉(zhuǎn)化子/IO6個(gè)分生孢子；
(4)可用于尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株突變體庫(kù)的構(gòu)建、寄主抗性篩選、寄主對(duì)尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株侵染的防衛(wèi)反應(yīng)、及尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株侵染和致病機(jī)制的研究。
[0012]【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
圖1:尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的熒光檢測(cè)結(jié)果，其中灰色的部分表示綠色熒光，A:菌絲體，B:分生孢子。
[0013]圖2:尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(cè)結(jié)果，其中M:DL2000 DNA Marker ；1:陽(yáng)性質(zhì)粒的GFP基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；2-5:陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的GFP基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0014]圖3:鋪有硝酸纖維素濾膜的IM共培養(yǎng)平板圖。
[0015]圖4:將硝酸纖維素濾膜反鋪于PDA篩選平板圖。
[0016]圖5 =PDA篩選平板上生長(zhǎng)的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型轉(zhuǎn)化子圖。
[0017]圖6:尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型轉(zhuǎn)化子的二次篩選圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本實(shí)施方式中的枯萎病菌尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株由國(guó)家蔬菜工程技術(shù)研究中心提供；攜帶表達(dá)載體PGFP的農(nóng)桿菌AGL-1由江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；硝酸纖維素濾膜購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0019]本實(shí)施方式中的馬鈴薯固體培養(yǎng)基和PDA篩選平板是根據(jù)書(shū)本《分子克隆試驗(yàn)指南第三版》制備的；培養(yǎng)基A是加入了 200 Mmol ? L-1乙酰丁香酮的頂液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，頂液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基出自(Bundock等，Eur.Mol.Biol.0rgan.1995，14:3206-3214);平板A是加入了 50 mg ? L—1卡那霉素和50 mg ? L—1利福平的YEB平板，YEB平板是根據(jù)書(shū)本《分子克隆試驗(yàn)指南第三版》制備的；培養(yǎng)基B是加入了 50 mg ? L-1卡那霉素和50 mg ? L-1利福平的MM液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，MM液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基出自(Hooykaas等，J.Gen.M1-crobiol.1979，110:99-109);頂共培養(yǎng)平板出自(Bundock 等，Eur.Mol.Biol.0rgan.1995，14:3206-3214);培養(yǎng)基C是加入了 60 mg ? L—1鏈霉素和50 mg ? L—1潮霉素的馬鈴薯固體培養(yǎng)基。
[0020]本實(shí)施方式中的CTAB 提取緩沖液由 0.7mol/L NaClUOO mmol/L Tris-HCl pH
8.0、20mmol/L EDTAUOg/L PVP、20g/L CTAB 和 0.1% ^ -巰基乙醇組成；TE 緩沖液由 10mmol/L Tris-HCl 和 I mmol/L EDTA 組成，其 pH 為 8.0。
[0021]實(shí)施例1
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法，其步驟如下:
1、尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株分生孢子懸浮液制備
用接種環(huán)挑取枯萎病菌尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌絲，接種到馬鈴薯固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)7 d，用6 mL培養(yǎng)基A和滅菌的小毛刷清洗病原菌孢子，將孢子液收集到滅菌的三角瓶中，用滅菌的雙層紗布過(guò)濾，然后用培養(yǎng)基A稀釋孢子液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算分生孢子濃度，調(diào)節(jié)孢子液濃度至IxlO6個(gè)/mL，得到AGL-1農(nóng)桿菌菌液，備用。
[0022]2、含有外源基因的農(nóng)桿菌菌液制備
將攜帶表達(dá)載體PGFP的農(nóng)桿菌AGL-1在新鮮的平板A上劃線(xiàn)，28°C培養(yǎng)48 h后，挑取單克隆，接種到5mL培養(yǎng)基B中，于25 °C，220rpm搖培48 h后用紫外分光光度計(jì)測(cè)0D_值，用培養(yǎng)基A稀釋?zhuān)咕?D_=0.15，然后將菌液稀釋液在28 0C振蕩培養(yǎng)6 h，得到AGL-1農(nóng)桿菌菌液，備用。
[0023]3、尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株的外源基因轉(zhuǎn)化
1)將步驟2中制備的AGL-1農(nóng)桿菌菌液和步驟I中制備的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株孢子懸浮液等體積混合，取200 U L混合液均勻涂布于不含抗生素的頂共培養(yǎng)平板上的硝酸纖維素濾膜表面(如圖3)，25 °C避光共培養(yǎng)48 h；
2)共培養(yǎng)48h后，將濾膜揭下，反鋪到培養(yǎng)基C上(如圖4)，25 °C培養(yǎng)48 h ；3)48h后棄掉硝酸纖維素濾膜，將PDA篩選平板在25 °C繼續(xù)培養(yǎng)至生長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子(如圖5)；
4)用無(wú)菌接種環(huán)挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化子接種到PDA篩選平板上進(jìn)行二次篩選(如圖6)，25V培養(yǎng)，保存得到的轉(zhuǎn)化子，用于陽(yáng)性鑒定。
[0024]4、尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定
I)轉(zhuǎn)化子基因組DNA的提取
采用CTAB法提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，步驟如下:
1:、取50 mg新鮮菌絲，加600ML 2 x CTAB提取緩沖液和少許滅菌石英砂，在研缽中將菌絲充分研磨；
%、將研磨后的溶液轉(zhuǎn)入1.5mL無(wú)菌Eppendorf管中，于65 "€水浴保溫30 min,加等體積的氯仿和異戊醇混合液，氯仿和異戊醇的體積比為24:1，充分搖勻，4 1:下8 000 X g離心5 min ；
I'、移取上清液至另一新的Eppendorf管中，加入3mol/L的NaAc溶液和冰凍乙醇，NaAc溶液的體積是上清液體積的10%，其pH為6.0，冰凍乙醇的體積是上清液體積的2.5倍，在-20 °C沉淀30 min ；
1、4 V 10000 X g離心5 min，棄上清液，用70%的無(wú)水乙醇清洗沉淀2_3次，通風(fēng)干燥沉淀20 min,加TE緩沖液充分溶解，即為轉(zhuǎn)化子基因組DNA溶液，-20 1:保存?zhèn)溆谩?br> [0025]2) PCR擴(kuò)增檢測(cè)
為了確定外源基因在尖孢鐮刀 菌西瓜專(zhuān)化型菌株基因組中的整合情況，采用PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行了外源基因的特異性分子鑒定。
[0026]根據(jù)表達(dá)載體中綠色熒光蛋白基因序列設(shè)計(jì)基因特異性引物用于PCR擴(kuò)增，引物序列分別為:
GFP-F:5，-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3，
GFP-R:5’ -CTCGTCCATGCCGAGAGTGA-3’
擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為708bp。
[0027]按表1依次在無(wú)菌的PCR反應(yīng)管中加入PCR反應(yīng)試劑，短暫渦旋混勻后將PCR反應(yīng)管置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 °C預(yù)變性5 min ；94 °C變性30 S，58 V退火40 s,72 °C延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸5 min ；12 °C保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(如圖2 )。
[0028]表1 PCR反應(yīng)體系 Table I PCR reaction system
【權(quán)利要求】
1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于包括以下4個(gè)步驟: (1)尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株分生孢子懸浮液制備:挑取枯萎病菌尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌絲，在馬鈴薯固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，用培養(yǎng)基A收集并稀釋孢子液，調(diào)節(jié)孢子液濃度至IxlO6個(gè)/mL，得到尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株孢子懸浮液，備用； (2)含有外源基因的農(nóng)桿菌菌液制備:將攜帶表達(dá)載體pGFP的農(nóng)桿菌AGL-1在新鮮的平板A上劃線(xiàn)，28°C培養(yǎng)48 h后，挑取單克隆，接種到5mL培養(yǎng)基B中，于25 °C，220rpm搖培48 h后用紫外分光光度計(jì)測(cè)OD_值，用培養(yǎng)基A稀釋?zhuān)咕?D_=0.15，然后將菌液稀釋液在28°C振蕩培養(yǎng)6 h，得到AGL-1農(nóng)桿菌菌液，備用； (3)尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株的外源基因轉(zhuǎn)化: 1)將步驟(2)中制備的AGL-1農(nóng)桿菌菌液和步驟(1)中制備的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株孢子懸浮液等體積混合，取200 U L混合液均勻涂布于不含抗生素的頂共培養(yǎng)平板上的硝酸纖維素濾膜表面，25 °C避光共培養(yǎng)48 h； 2)共培養(yǎng)48h后，將濾膜揭下，反鋪到培養(yǎng)基C上，25 °C培養(yǎng)48 h ； 3)48h后棄掉硝酸纖維素濾膜，將PDA篩選平板在25 °C繼續(xù)培養(yǎng)至生長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子； 4)用無(wú)菌接種環(huán)挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化子接種到PDA篩選平板上進(jìn)行二次篩選，25°C培養(yǎng)，保存得到的轉(zhuǎn)化子，用于陽(yáng)性鑒定； (4)尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株轉(zhuǎn)化子的鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述步驟(4)的方法如下:` 1)采用PCR方法，用綠色熒光蛋白基因的基因特異性引物檢測(cè)轉(zhuǎn)化子中外源基因的整合； 2)采用OLYMPUSDP72熒光顯微鏡觀(guān)察轉(zhuǎn)化子是否攜帶外源基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:培養(yǎng)基A是加入了 200 Mmol ? L-1乙酰丁香酮的IM液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基B是加入了 50 mg -T1卡那霉素和50 mg-T1利福平的麗液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基C是加入了 60 mg ? L—1鏈霉素和50 mg ? L—1潮霉素的馬鈴薯固體培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:平板A是加入了 50 mg ? L—1卡那霉素和50 mg ? L—1利福平的YEB平板。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述外源基因?yàn)榫G色熒光蛋白基因，綠色熒光蛋白基因的基因特異性引物為:GFP-F:5，-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3，，GFP-R:5，-CTCGTCCATGCCGAGAGTGA-3，。
【文檔編號(hào)】C12R1/77GK103757046SQ201410003576
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月6日
【發(fā)明者】張曼, 羊杏平, 徐錦華, 劉廣, 姚協(xié)豐, 李蘋(píng)芳 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院