一種尖孢鐮刀菌及其在鐵皮石斛抗葉斑病中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種尖孢鐮刀菌，其分類(lèi)命名為鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌(Fusarium?oxysporum)，菌株號(hào)為JSNL002，現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.9566，保藏日期為2014年8月15日。本發(fā)明尖孢鐮刀菌JSNL002在提高鐵皮石斛生長(zhǎng)抗葉斑病能力等方面作用效果顯著；且能夠人工培養(yǎng)，繁殖速度快，便于進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種尖孢鐮刀菌及其在鐵皮石斛抗葉斑病中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種尖孢鐮刀菌及其在鐵皮石斛抗病中的 應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 鐵皮石斛是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，研究表明，從其種子萌發(fā)到苗的健 康生長(zhǎng)，無(wú)不需要共生真菌的參與。由于野生鐵皮石斛資源瀕臨枯竭，目前，鐵皮石斛的 市場(chǎng)需求主要靠人工栽培，但人工種植鐵皮石斛生長(zhǎng)速度慢，平均產(chǎn)量低，病害發(fā)生較為嚴(yán) 重。目前，病害的防治仍然主要依靠農(nóng)藥。從保護(hù)生態(tài)環(huán)境和食品安全的角度出發(fā)，鐵皮石 斛作為名貴中藥，應(yīng)盡可能減少農(nóng)藥、化學(xué)肥料的施用量。菌根是土壤中菌根真菌與植物根 系形成的具有特定形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的共生體，是自然界中普遍存在的一種共生現(xiàn)象。蘭科 植物對(duì)菌根的依賴(lài)性較強(qiáng)，菌根真菌與植物根系互為條件形成共生體，在生理上是一個(gè)相 互協(xié)調(diào)的整體，并在共同進(jìn)化的過(guò)程中，形成特定的形態(tài)特征。菌根真菌與宿主植物的相互 關(guān)系多數(shù)情況下是互利的，菌根真菌從植物體內(nèi)獲取生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而植物通過(guò)與 共生真菌結(jié)合，也能更好的從土壤中得到所需的養(yǎng)分及水分等。合理利用菌根資源，提高鐵 皮石斛的抗病能力，在一定程度上減少化學(xué)農(nóng)藥的施用量，這也符合農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn) 略。因此，菌根菌劑相關(guān)研究已成為鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的一個(gè)重要方向。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種對(duì)鐵皮石斛抗病作用效果顯著地菌根真 菌-鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum)JSNL002。
[0004] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述真菌在提高鐵皮石斛抗病能力中的應(yīng)用。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0006] -種尖孢鐮刀菌，其分類(lèi)命名為鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum)，菌 株號(hào)為JSNL002,現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，保 藏編號(hào)為CGMCC No. 9566,保藏日期為2014年8月15日。保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
[0007] 上述菌株JSNL002是2010年10月在浙江省樂(lè)清市鐵皮石斛栽植區(qū)內(nèi)生長(zhǎng)狀況較 好的植株上分離獲得的，該菌株對(duì)鐵皮石斛促生作用不顯著。但能明顯改善鐵皮石斛的抗 病能力。
[0008] 矮小傘霉（Umbelopsis nana)JSNL002的菌落特征如下：
[0009] 尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum) JSNL002的菌落特征如下：
[0010] 形態(tài)學(xué)特征觀察表明：在PDA平叛上培養(yǎng)后，肉眼觀察菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)其菌絲體呈 絨毛狀，并稍帶有紫色色素（圖1A)。大型分生孢子鐮刀形，少許彎曲，兩端細(xì)胞稍尖，多數(shù) 為3隔（圖1B)。小型分生孢子單胞，卵形，著生于單生瓶梗上，常在瓶梗頂端聚成團(tuán)（圖 1C)。擴(kuò)增ITS區(qū)全序列并進(jìn)行測(cè)序，PCR擴(kuò)增得到的16sRNA全序列如SEQ ID No :1所示。 toon] 上述尖孢鐮刀菌在鐵皮石斛抗葉斑病中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0012] 具體的應(yīng)用方法是：將尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum) JSNL002制備成固體菌 齊U，置于鐵皮石斛幼苗栽培基質(zhì)表面，每叢鐵皮石斛幼苗的固體菌劑接種量為5g，施用菌劑 后，基質(zhì)相對(duì)含水量維持在60%以上10天，以確保菌絲在基質(zhì)內(nèi)成活。
[0013] 其中，所述的固體菌劑按如下方法制備得到：以棉籽殼菌渣為培養(yǎng)基質(zhì)、硝酸 銨為外源氮源、蔗糖為外源碳源，制備成固體培養(yǎng)基，滅菌，接種尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum) JSNL002,在28°C、12h光照+12h黑暗、pH6-8條件下培養(yǎng)25?35天，將培養(yǎng)好 的菌劑切割成lcm3大小的塊狀物，用于鐵皮石斛植株菌根菌劑的接種。
[0014] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：
[0015] (1)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum) JSNL002對(duì)鐵皮石斛抗病作用效果較為顯 著，對(duì)減少化學(xué)農(nóng)藥的使用有一定作用，也是保證食用安全的重要手段。
[0016] (2)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum) JSNL002培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、容易保存，易于工 業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為圖1鐵皮石斛菌根真菌JSNL002的形態(tài)特征。
[0018] 圖2為JSNL002菌菌根化鐵皮石斛的抗葉斑病能力分析。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0020] 實(shí)施例1 :
[0021] 尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum) JSNL002對(duì)鐵皮石斛的抗病能力作用效果分 析。
[0022] (1)以棉籽殼菌渣為培養(yǎng)基質(zhì)、硝酸銨為外源氮源、蔗糖為外源碳源，制備成固體 培養(yǎng)基質(zhì)裝入高壓滅菌袋內(nèi)，于121°C和101. 3千帕的高壓條件下滅菌20分鐘。待培養(yǎng)基 質(zhì)冷卻后在無(wú)菌條件下接種菌根真菌JSNL002,然后進(jìn)行人工培養(yǎng)。具體培養(yǎng)條件為28°C、 12h光照+12h黑暗、pH6-8,培養(yǎng)25?35天。將培養(yǎng)好的菌劑加工成lcm 3大小的塊狀物， 置于鐵皮石斛幼苗栽培基質(zhì)表面，每叢鐵皮石斛幼苗的固體菌劑接種量為5g，施用菌劑后， 基質(zhì)相對(duì)含水量維持在60%以上10天，以確保菌絲在基質(zhì)內(nèi)成活。
[0023] (2)通過(guò)紫外光和黑暗處理培養(yǎng)在PDA培養(yǎng)基上的葉斑病病原菌，制得病菌孢子 懸浮液，將其稀釋到2 X 105個(gè)/mL備用。
[0024] (3)將供試鐵皮石斛植株在同等條件下進(jìn)行管理，每株接種植株都選取上部第 五片葉，用針刺法人工制造傷口，表面噴灑病原菌孢子懸浮液2ml/每株，溫室內(nèi)溫度為 30-35°C，濕度95%，每種處理均為100株，并設(shè)3組重復(fù)。
[0025] (4)接種后每天監(jiān)控葉斑病的發(fā)病程度，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率、發(fā)病指數(shù)。
[0026] 病株分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：病情分級(jí)主要根據(jù)接種葉片正反兩面出現(xiàn)病斑數(shù)量及直徑，初定 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：
[0027] 0 :正常；
[0028] I :正反兩面有少量病斑；
[0029] II :正反兩面有病斑，發(fā)病面積占葉片總面積1/4以下；
[0030] III :正反兩面有病斑，發(fā)病面積占葉片總面積的1/4-1/2 ;
[0031] IV :正反兩面有病斑，發(fā)病面積占葉片總面積1/2-3/4 ;
[0032] IV :正反兩面有病斑，發(fā)病面積占葉片總面積3/4以上。
[0033] 感病指數(shù)=Σ (各級(jí)病株數(shù)X該級(jí)代表數(shù)值）X10(V(總株數(shù)X最高一級(jí)代表 數(shù)值）；
[0034] 感病率=(感病株樹(shù)/接種株樹(shù)）X 100%。
[0035] 結(jié)果見(jiàn)圖2。
【權(quán)利要求】
1. 一種尖孢鐮刀菌，其分類(lèi)命名為鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum)，菌株 號(hào)為JSNL002,現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 9566,保藏日期為2014年8月15日。
2. 權(quán)利要求1所述的尖孢鐮刀菌在鐵皮石斛抗葉斑病中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：將尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum) JSNL002制備成固體菌劑，置于鐵皮石斛幼苗栽培基質(zhì)表面，每叢鐵皮石斛幼苗的固體菌劑 接種量為5g，施用菌劑后，基質(zhì)相對(duì)含水量維持在60%以上10天，以確保菌絲在基質(zhì)內(nèi)成 活。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的固體菌劑按如下方法制備得到：以 棉籽殼菌渣為培養(yǎng)基質(zhì)、硝酸銨為外源氮源、蔗糖為外源碳源，制備成固體培養(yǎng)基，滅菌，接 種尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum) JSNL002,在 28°C、12h 光照 +12h 黑暗、pH6_8 條件下 培養(yǎng)25?35天，將培養(yǎng)好的菌劑切割成lcm3大小的塊狀物，用于鐵皮石斛植株菌根菌劑 的接種。
【文檔編號(hào)】C12R1/77GK104195055SQ201410457974
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月10日
【發(fā)明者】徐超, 陳露, 楊鶴同, 趙桂華, 鄭凱, 席剛俊, 史俊, 張紅巖, 何任紅 申請(qǐng)人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院