一株厚垣孢鐮刀菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及鐮刀菌株【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一株厚垣孢鐮刀菌株ZC201301，保藏編號為CGMCC No.9562。從田間天然發(fā)病的馬唐葉片上分離得到，對馬唐具有強(qiáng)烈、快速的致病力，室內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明菌株的孢子噴灑到馬唐葉片上，2天后，馬唐即出現(xiàn)斑點(diǎn)和枯死癥狀，14天后對馬唐的鮮重抑制率可達(dá)91%。本發(fā)明的真菌菌株厚垣孢鐮刀菌ZC201301同時(shí)對反枝莧、麥蒿、等雜草具有一定生物防效，對大豆、玉米、小麥等作物安全。CGMCC No. 95622014.08.15
【專利說明】一株厚垣孢鐮刀菌株及其應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明涉及鐮刀菌株【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一株厚垣孢鐮刀菌株，還涉及所述厚垣孢鐮 刀菌株的應(yīng)用。
[0002]

【背景技術(shù)】 馬唐（Diditaria sanguinaris)是世界上公認(rèn)的分布廣泛的惡性雜草之一，主要危害 小麥、大麥、玉米、水稻、高粱等禾本科作物，以及蔬菜園和草坪等。在中國，馬唐的危害面積 大約在6千萬公頃左右，由其引起的作物損失占秋熟旱作物田雜草總損失的一半以上，而 其在黃淮海免耕玉米田出現(xiàn)以及危害的頻率更高。目前，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)已申請了利用雙曲 孢霉OVahiaea你 ra)菌株QZ-2000(保藏號：CGMCC No. 0640)生物控制馬唐的專利，但其 單菌株防效并不理想，需由幾個(gè)單株的孢子按比例混合后噴施才能達(dá)到較好的防除效果。
[0003] 近些年來，化學(xué)除草劑的長期使用引起抗性雜草的產(chǎn)生和嚴(yán)重的環(huán)境污染，同時(shí) 伴隨人們環(huán)保意識逐漸增強(qiáng)，對農(nóng)藥殘留低的綠色食品的需求越來越高。因此，研制生物除 草劑進(jìn)行雜草的防除，不僅可以有效防除目標(biāo)雜草，而且對環(huán)境安全性高，已成為生產(chǎn)上的 迫切需求。目前，已經(jīng)一些生物除草劑已經(jīng)商業(yè)化推廣，例如80年代初研制出的DeVine和 Collego以及90年代末推出的Comperico和Biochon。這些除草劑在控制相對的目標(biāo)雜草 上起到了重要作用，如DeVine的持效性可以保證使用一次2-3年無須再除草。目前，有希 望商業(yè)化的生物除草劑項(xiàng)目有數(shù)十項(xiàng)，其中防除馬唐、稗草、婆婆納等雜草的生物除草劑品 種具有十分誘人的前景。
[0004]


【發(fā)明內(nèi)容】
為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中商業(yè)化的生物除草劑所存在的現(xiàn)狀及問題，本發(fā)明提供了一 株厚垣抱鎌刀菌株 ZC201301
[0005] 本發(fā)明還提供了所述厚垣孢鐮刀菌株ZC201301 應(yīng)）的 應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明是通過以下步驟得到的： 本發(fā)明所提供的厚垣孢鐮刀菌為厚垣孢鐮刀菌ZC201301，其保藏編號為CGMCC No. 9562。
[0007] 本發(fā)明還提供了厚垣孢鐮刀菌ZC201301的孢子。
[0008] -種制備厚垣孢鐮刀菌ZC201301 CGMCC No. 9562的孢子的方法： 用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)厚垣孢鐮刀菌ZC201301，培養(yǎng)的溫度為22°C -28°C，培養(yǎng)的光照條 件為光照（12小時(shí)）/黑暗（12小時(shí))，培養(yǎng)的時(shí)間為10-12天，得到厚垣孢鐮刀菌ZC201301 的孢子；所述培養(yǎng)的溫度具體為22°C，25°C或28°C，所述培養(yǎng)的時(shí)間具體為12天。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培養(yǎng)厚垣孢鐮刀菌ZC201301 CGMCC No. 9562的 方法： 用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)厚垣孢鐮刀菌ZC201301 CGMCC No. 9562,培養(yǎng)的溫度為 22°C -28°C，培養(yǎng)的光照條件為光照（12小時(shí)）/黑暗（12小時(shí))，培養(yǎng)的時(shí)間為10-12天，得 到厚垣孢鐮刀菌ZC201301 CGMCC No. 9562的孢子；所述培養(yǎng)的溫度具體為22°C，25°C或 28°C，所述培養(yǎng)的時(shí)間具體為10、11、12天。
[0010] 一種厚垣孢鐮刀菌ZC201301和/或其培養(yǎng)液和/或厚垣孢鐮刀菌ZC201301的孢 子在生物除草劑中的應(yīng)用。
[0011] 優(yōu)選所述生物除草劑的作用對象為馬唐、反枝莧、麥蒿、狗尾草、稗草等雜草。
[0012] 上述生物除草劑具體由厚垣孢鐮刀菌ZC201301的孢子、表面活性劑和無菌水組 成；優(yōu)選所述生物除草劑中含有孢子IX 107/mL和表面活性劑。
[0013] 優(yōu)選所述表面活性劑在所述生物制劑中的質(zhì)量濃度為0. 1%。
[0014] 優(yōu)選所述表面活性劑為吐溫80。
[0015] 本發(fā)明的生物除草劑對馬唐具有強(qiáng)烈、快速的致病力，將本發(fā)明菌株的孢子噴灑 到兩葉一心期的馬唐葉片上，2天后即出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)，7天后斑點(diǎn)逐漸擴(kuò)大，出現(xiàn)枯死癥 狀，兩周后馬唐的死亡率達(dá)到60%，感病率達(dá)到100%，4周后對馬唐的鮮重抑制率達(dá)到91%。 [0016] 本發(fā)明的有益效果： 1) 本發(fā)明的厚垣孢鐮刀菌ZC201301由發(fā)明人分離自田間自然發(fā)病的馬唐葉片，未經(jīng) 任何基因修飾，因此將它們釋放到自然界中不會在成任何生態(tài)的、環(huán)境的隱患，是絕對安全 的生物防治介體； 2) 本發(fā)明中厚垣孢鐮刀菌ZC201301對大豆、玉米、小麥等作物安全，同時(shí)對反枝莧、馬 唐、麥蒿等雜草具有一定的生物防治作用，顯示出該菌有較大的潛力開發(fā)成商品化生物除 草劑，具有極為顯著的經(jīng)濟(jì)和社會效益。
[0017] 菌種保藏信息 保藏時(shí)間：2014年8月15日， 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏編號：CGMCC No. 9562， 保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所， 分類命名：厚垣抱鎌刀菌

【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0019] 實(shí)施例1:厚垣孢鐮刀菌菌株ZC201301的分離與鑒定 1. 1菌株的分離 野外采集自然感病的馬唐葉片，剪下病葉的柄、健結(jié)合部位，用無菌水沖洗3次，用2% (v/v)次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒6分鐘，之后用70% (v/v)酒精表面消毒1分鐘，用無菌 水漂洗后將這些組織轉(zhuǎn)移到空的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，超凈臺內(nèi)吹干后置于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，經(jīng) 過單孢子分離、純化得到純培養(yǎng)菌菌株ZC201301。
[0020] 1. 2 ZC201301菌株對馬唐的致病性測定 ZC201301菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d后，收集孢子并配制成濃度為1 X 107個(gè)/mL 的孢子懸浮液噴施2葉1心期馬唐植株上，2天后，觀察菌株的致病特性，噴灑ZC201301菌 株孢子液的馬唐葉片在2天后出現(xiàn)水漬狀病斑，后病斑擴(kuò)大連接導(dǎo)致葉片枯黃死亡。將 ZC201301菌株以濾紙片法保存于-20°C冰箱內(nèi)。
[0021] 1.3菌株的鑒定 1. 3. 1形態(tài)鑒定 方法：將菌株ZC201301在PDA平板上培養(yǎng)10天，觀察其菌落形態(tài)。同時(shí)用無菌水將 培養(yǎng)基表面的分生孢子洗下，制成分生孢子懸浮液，調(diào)節(jié)濃度至1 X 1〇4個(gè)孢子/ml。顯微鏡 下觀察菌株ZC201301的分生孢子形態(tài)；對照真菌鑒定手冊，對菌株ZC201301進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒 定。
[0022] 1.3.2分子鑒定 提取菌株 ZC201301 的基因組 DNA，用引物 ITS4 (5，TCCTCCGCTTATTGATATGC 3，）和 ITS5 (5' GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物回收測序，測得序列。
[0023] 將測得序列提交到 NCBI (National Center forBiotechnology information，美 國生物信息中心，http://www. ncbi. nlm. nih. gov)的 GeneBank 進(jìn)行 BLAST 分析。
[0024] 1.4 結(jié)果 ZC201301菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天后，菌落質(zhì)地緊密、呈厚絮狀，淡粉紅色。產(chǎn)生 兩種孢子，一種產(chǎn)生量較少、呈鐮刀形；一種產(chǎn)生量較大、呈類橢圓形。結(jié)合BLAST分析結(jié)果 表明，ZC201301 菌株為厚垣抱鎌刀菌
[0025] 該菌株已于2014年8月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵 編 100101)，保藏號 CGMCC No. 9562,分類命名為厚垣抱鎌刀菌 菌株名稱為ZC201301。
[0026] 實(shí)施例2 :孢子液的制備 將厚垣孢鐮刀菌ZC201301接種于PDA平板培養(yǎng)基，在28°C，光、暗交替條件下，培養(yǎng)12 天，培養(yǎng)基表面即存在菌株產(chǎn)生的大量分生孢子。加入占總質(zhì)量量〇. 1%的吐溫80,用棉棒 輕輕刷下培養(yǎng)基表面生長的孢子，收集孢子液，顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整孢子液 濃度至1X 1〇7個(gè)/mL。制取的孢子懸浮液直接用于馬唐等雜草的生物防治。
[0027] 實(shí)施例3 :菌株ZC201301 CGMCC寄主范圍的測定 經(jīng)寄主范圍測定明確，菌株ZC201301對大豆、玉米、小麥等作物安全；對馬唐、反枝莧、 麥蒿具有生防效果，而馬唐生防效果最佳，兩周后的鮮重抑制率在91%左右。
[0028] 表1菌株ZC201301的寄主范圍測定 鮮重抑制率的計(jì)算公式：鮮重抑制率=(對照平均鮮重-處理平均鮮重）/對照平均 鮮重X 100%。
[0029] 本實(shí)驗(yàn)中的各植物均是非常常見和常用的植物。
[0030] 具體方法為：溫室中種植各植物，在各植株生長至2-3葉期，對每種植物的植株進(jìn) 行孢子液噴霧；接種后14天，進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)，并以未噴霧的作為對照。
[0031] 結(jié)果統(tǒng)計(jì)包括以下方面：在結(jié)果統(tǒng)計(jì)當(dāng)日，目測各植株在接種ZC201301之后的癥 狀，并記錄；剪取各處理植株的地上部分，立即稱取植株鮮重，計(jì)算鮮重抑制率。
[0032] 結(jié)果具體如下： 表1 ZC201301菌株孢子液對不同雜草生物防效和作物安全性比較

【權(quán)利要求】
1. 一株厚垣孢鐮刀菌ZC201301，其特征在于其保藏編號為CGMCCNo. 9562。
2. -種權(quán)利要求1所述的厚垣孢鐮刀菌ZC201301的孢子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的孢子，其特征在于是通過以下步驟得到的： 用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)厚垣孢鐮刀菌ZC201301，培養(yǎng)溫度為22°C _28°C，培養(yǎng)的光照條件為 光暗交替，光照12小時(shí)，黑暗12小時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為10-12天，即得。
4. 一種培養(yǎng)厚垣孢鐮刀菌ZC201301的方法，其特征是包括以下步驟： 用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)厚垣孢鐮刀菌ZC201301，培養(yǎng)溫度為22°C _28°C，培養(yǎng)的光照條件為 光暗交替，光照12小時(shí)，黑暗12小時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為10-12天。
5. -種權(quán)利要求1所述的厚垣孢鐮刀菌ZC201301和/或其培養(yǎng)液和/或權(quán)利要求2 或3所述的厚垣孢鐮刀菌ZC201301的孢子在生物除草劑中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述生物除草劑的作用對象為馬唐、反枝 莧、麥蒿、狗尾草、稗草。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于所述生物除草劑中含有孢子1 X 107/ mL和表面活性劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述表面活性劑在所述生物制劑中的質(zhì)量 濃度為〇. 1%。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述表面活性劑為吐溫80。
【文檔編號】C12R1/77GK104250620SQ201410492924
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】李健, 李美, 高興祥, 房鋒 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所