檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型1號生理小種的TaqMan探針實(shí)時熒光引物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本方法基于該病原的尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種的特異保守引物和TaqMan探針建立了一種實(shí)時熒光PCR定性檢測方法，能夠在1.5小時內(nèi)同時分別對尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種進(jìn)行準(zhǔn)確高效的定性和定量檢測，具有高特異性和高靈敏度，較之前的普通PCR檢測研究提高了檢測靈敏度達(dá)1－2個數(shù)量級，且能夠進(jìn)行定量檢測，突破了SYBRGREEN熒光染料法不能進(jìn)行兩重或多重檢測的限制。該實(shí)時熒光PCR定性檢測方法行準(zhǔn)確高效，能夠用于加強(qiáng)該病害防控檢測和檢疫工作。
【專利說明】檢測尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種的TaqMan探針實(shí)時熒光引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種快速鑒定與定量檢測尖孢鐮刀菌古巴?；虸號生理小種的TaqMan探針實(shí)時熒光引物及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由尖抱鍵刀菌I 號(Fusarium oxysporum f.sp.cubense racel, FOCl)和 4 號生理小種(F.0xysporum f.sp.cubense race4, F0C4)引起的香蕉鐮刀菌枯萎病,是世界上香蕉的毀滅性病害，給世界的香蕉產(chǎn)業(yè)帶來巨大的危害。香蕉主要集中于非洲、南美洲和亞洲，年產(chǎn)量近一億噸，是世界第二大水果作物，同時為近5億人口的主要糧食之一，是繼水稻、小麥和玉米之后的第四大糧食作物。日前共有120個國家和地區(qū)生產(chǎn)香蕉。近年來我國香蕉生產(chǎn)發(fā)展迅猛，居全球第二。香蕉業(yè)己成為我國熱帶地區(qū)農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)。但是，隨著香蕉種植面積逐年增加，香蕉病害的危害也日益嚴(yán)重，尤其是香蕉枯萎病給香蕉生產(chǎn)帶來極大的威脅。1876年,Joseph Bancroft在澳大利亞首次報道了香蕉枯萎病。1904年在美國夏威夷也發(fā)現(xiàn)此病，1910年，巴拿馬因香蕉枯萎病大發(fā)生，造成慘重?fù)p失，因而香蕉枯萎病又稱為香蕉巴拿馬病。同年，由Erwin F.Smith在古巴從香蕉病組織中分離到該病的病原菌，并將其命名為 Fusarium oxysporum f.cubense Ε.F.Smith。1913 年 Ashby 對該病害及其病原菌首次做了詳細(xì)的描述，Brandes于1919年首次確證了該病菌的致病性，1940年由 Snyder 和 Hansen 建議將該病菌正式命名為 F.0xysporum Schlecht.f.sp.cubense (E.F.Smith) Snyder et Hansen。目前,該病害已廣泛分布于亞洲、非洲、澳大利亞、南太平洋及熱帶美洲的香蕉產(chǎn)區(qū)。該病(I號小種)于1940—1950在中南美洲國家爆發(fā)感染，使風(fēng)糜世界的國際貿(mào)易香蕉品種大蜜哈(Gros Michel)退出歷史舞臺。1967年我國臺灣省發(fā)生香蕉枯萎病，20世紀(jì)70年代后流行，使臺灣的香蕉面積從最高峰時期的50000公頃降至近年的5000公頃，而且其中的一半仍受到枯萎病的影響。菲律賓、澳大利亞、馬來西亞、非洲等國家和地區(qū)的香蕉也相繼局部發(fā)生枯萎病。
[0003]在中國于十九世紀(jì)五六十年代在廣東、廣西、海南發(fā)現(xiàn)該病侵染為害粉蕉，1996年廣東番禹萬頃沙鎮(zhèn)的巴西及廣東2號香蕉出現(xiàn)枯萎病，現(xiàn)已通過種苗和流水等傳染途徑擴(kuò)散至中山、珠海、東莞、肇慶、信宜、高州和湛江(雷州半島)等地，該病每年以30— 50公里速度傳播，使許多蕉園不能種植香蕉，目前已有1000多公頃蕉園棄耕?，F(xiàn)廣東、廣西(如南寧、百色)、福建(如漳州)、海南(如文昌、萬寧、儋州、安定、澄邁)、云南(如河口、景洪)和臺灣均有分布，對我國香蕉種植業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。
[0004]該菌因生理小種不同而危害不同品種的香蕉，世界上已報道有3個生理小種，其中I號小種世界性分布，感染粉蕉、香蕉的栽培品種大蜜哈(AAA)和Apple(AAB)、Silk(AAB)、Taiwan Latundan (AAB)和IC2 (AAAA)等香蕉品系；2號小種在中美洲洪都拉斯、薩爾瓦多、波多黎哥、多米尼加和維爾京群島分布，僅感染雜種三倍體Bluggoe(ABB)及其近緣品種和某些Jamaica四倍體(AAAA)蕉；4號小種主要分布在澳大利亞、非洲以及菲律賓(卡拉雷群島)等部分亞洲國家，可感染大蜜哈(AAA)、Taiwan Latundan (AAB)、PisangLilin(AA)、野蕉(BB)等所有香蕉和大蕉品種及對其他小種有抗性的香牙蕉(AAA)，故危險性和毀滅性最大，引起世界各香蕉種植國家的高度關(guān)注。目前中國以小種4號和I號危害
最為嚴(yán)重。
[0005]目前該病害沒有好的防治措施，而且危害的區(qū)域在不斷擴(kuò)大，且對于粉蕉更存在FOCl侵染的現(xiàn)象。粉蕉經(jīng)濟(jì)價值高，且隨著種植面積的增大，病害發(fā)生也日趨嚴(yán)重，對于粉蕉苗的檢測和發(fā)病初期的早期檢測而言，需要更為靈敏和準(zhǔn)確有效的檢測方法。對香蕉枯萎病及其病原的檢測鑒定和監(jiān)控防疫工作是解決香蕉枯萎病問題的前提和基礎(chǔ)，檢測方法的建立和應(yīng)用對于阻止病害蔓延和發(fā)生具有重要的意義。
[0006]國內(nèi)的檢測鑒定研究，如王國芬等根據(jù)香蕉枯萎病菌ITS序列設(shè)計合成的三條引物:FusFl(5' AACCCCTGTGAACATACCACTTG3' )、FusRl(5' GAGGAACGCGAATTAACGCGAC3')和 FusR2(5' GACGATTACCAGTAGCGAGGGT3')構(gòu)成引物對 A (FusFl/Rl)和 B (FusFl/R2)，對尖孢鐮刀菌古巴?；筒【M(jìn)行了有效的PCR特異擴(kuò)增試驗(yàn)。
[0007]對于生理小種檢測鑒定方面主要集中在4號生理小種，如臺灣Lin Yinghong等建立了針對F0C4特異性404bp序列的普通PCR檢測引物，并應(yīng)用SYBR GREEN熒光染料進(jìn)行了實(shí)時熒光PCR檢測。福建Li等建立了針對F0C4特異性404bp序列的LAMP方法檢測4號生理小種。
[0008]近年來，有研究報道解決了兩個生理小種的普通PCR鑒定問題。如劉景梅等嘗試用RAPD技術(shù)區(qū)分生理小種，經(jīng)過隨機(jī)引物篩選出4個RAPD標(biāo)記成功地轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，其中Racel — SCAR標(biāo)記I個、Race4 — SCAR標(biāo)記2個、同時能鑒定出2個小種的SCAR標(biāo)記I個。應(yīng)用這4個SCAR標(biāo)記同時對采自田間的9個病菌分離物進(jìn)行檢測，能夠準(zhǔn)確地鑒定出廣東蕉區(qū)的尖孢鐮刀菌古巴?；蚏acel和Race4。2012年李敏慧等已建立了能夠區(qū)分兩個生理小種的普通PCR分子檢測體系。但田間樣品病菌含量低，干擾物質(zhì)多，內(nèi)生真菌、細(xì)菌和土壤中放線菌等分布廣泛，對檢測的靈敏度和特異性均構(gòu)成了極大的干擾，造成現(xiàn)有檢測方法往往因?yàn)殪`敏度和特異性的限制而呈現(xiàn)檢測結(jié)果不穩(wěn)定的現(xiàn)象，對病害的早期檢測帶來了一個巨大的障礙。
[0009]實(shí)時熒光PCR技術(shù)是使用實(shí)時熒光擴(kuò)增裝置實(shí)時監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行分析的方法。該方法較普通PCR方法更為靈敏可靠，較環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法更穩(wěn)定，不易污染，且可以實(shí)現(xiàn)多重檢測，是現(xiàn)在通行靈敏并且可靠的檢測方法，應(yīng)用廣泛。尤其是探針法實(shí)時熒光PCR技術(shù)因其特異性高、可多重檢測，故常用于SNP解析，病毒、病原菌檢測。但目前尚未有探針法實(shí)時熒光PCR檢測尖孢鐮刀菌的報道，更缺乏專門針對尖孢鐮刀菌古巴?；虸號生理小種的實(shí)時熒光PCR檢測方法。
[0010]本方法建立了能夠準(zhǔn)確高效區(qū)分尖孢鐮刀菌古巴?；虸號生理小種的TaqMan探針實(shí)時熒光PCR檢測方法。希望能夠通過該方法的建立，解決含量低、干擾多的難題；同時，建立了一種能夠定量檢測尖孢鐮刀菌古巴?；虸號生理小種的方法以應(yīng)用于菌含量的對比研究。
[0011]本方法能用于同時實(shí)時熒光PCR法檢測兩個生理小種，且更穩(wěn)定，靈敏度較高，符合“快、準(zhǔn)、穩(wěn)、省”的檢測一般要求。相對于其他更靈敏的方法如LAMP方法更為穩(wěn)定，不易污染，相對傳統(tǒng)PCR方法和接種鑒定生理小種方法更為靈敏和快速，可以在幼苗期進(jìn)行檢測，對于香蕉生產(chǎn)上意義重大。因?yàn)橄憬秾儆谌扼w作物，不能通過傳統(tǒng)的雜交育種來繁殖，生產(chǎn)上采用組培苗來做田間種植，所以對于田間香蕉枯萎病的控制主要在種苗的監(jiān)測上，而種苗中的含菌量是很低的，需要靈敏度較高的檢測方法，而本研究建立的方法能夠較好地解決這一問題，應(yīng)用前途廣泛。而且，由于F0C4在中國境內(nèi)危害日益嚴(yán)重，主栽品種巴西蕉也日益減少，粉蕉和大蕉的種植越來越廣泛，而兩者都是FOCl的寄主，因此，田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)FOCl的危害有進(jìn)一步擴(kuò)大的趨勢。本方法首次針對FOCl建立了實(shí)時熒光檢測方法，對于監(jiān)控和防止該生理小種的進(jìn)一步蔓延有重大意義。
[0012]本方法基于該病原的尖孢鐮刀菌古巴?；虸號生理小種的特異保守引物和TaqMan探針建立了一種實(shí)時熒光PCR定性檢測方法，能夠在1.5小時內(nèi)同時分別對尖孢鐮刀菌古巴專化型I號生理小種進(jìn)行準(zhǔn)確高效的定性和定量檢測，具有高特異性和高靈敏度，較之前的普通PCR檢測研究提高了檢測靈敏度達(dá)I 一 2個數(shù)量級，且能夠進(jìn)行定量檢測，突破了 SYBR GREEN熒光染料法不能進(jìn)行兩重或多重檢測的限制。該實(shí)時熒光PCR定性檢測方法行準(zhǔn)確高效，能夠用于加強(qiáng)該病害防控檢測和檢疫工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的首要目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足之處，提供一種快速準(zhǔn)確靈敏的檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型I號生理小種的TaqMan探針引物及其定量檢測方法。
[0014]本發(fā)明的另一目的在于提供所述檢測方法的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明是采用以下方案實(shí)現(xiàn)的:一種快速檢測尖孢鐮刀菌古巴?；虸號生理小種的TaqMan探針檢測方法，包含以下步驟:
[0016]1.引物和探針
[0017]引物采用Primer Express3.0軟件設(shè)計，由華大基因公司合成。
[0018]FOCl所用引物和探針如下:
[0019]Focl-0422F15’AGGTGAGAAATCTGTTGAGTCTCGAT3’ ；
[0020]Focl-0422R15，AACTCCTTCACCAGCCTTTCG3，；
[0021]Focl-0422P15，Cy5-AGCATGGCAGGTCGT_BHQ33’ ；
[0022]2.DNA提取和濃度測量
[0023]樣品DNA提取采用CTAB兩步法，提取前用液氮充分研磨，提取后用Nano DroplOOO型核酸微量測定儀測定核酸濃度。具體提取步驟如下:
[0024]稱取Ig樣品(根據(jù)樣品的DNA含量，可以調(diào)整樣品量)，加入到50mL的離心管中；加入5mLCTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻。65°C孵育30min，不時振蕩；65°C過夜后，8000r/min室溫離心IOmin,取Iml上清液入2ml離心管中；加入700 μ L氯仿后用力振蕩，13000 X g離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清液600 μ L到新的2ml離心管中；加入2倍體積的CTAB沉淀溶液顛倒數(shù)次后室溫靜置60min，13000 Xg離心lOmin，棄去上清，加入350 μ LNaCl溶液將沉淀進(jìn)行懸浮，再加入350 μ L氯仿，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13000 Xg離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清后加入0.8倍體積的異丙醇用來沉淀核酸,室溫放置20min, 13000 X g離心IOmin,棄去上清，加入500 μ L70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于50 μ LTE溶液中。
[0025]3.實(shí)時熒光PCR檢測方法特異性驗(yàn)證 [0026]使用熒光探針Focl-0422Pl及引物Focl-0422F1/Focl-0422R1進(jìn)行實(shí)時熒光PCR，共同檢測香蕉串珠鐮刀菌、冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌和甜瓜枯萎病菌、火龍果枯萎病菌等鐮刀菌屬內(nèi)近似種及鐮刀菌屬外青霉屬。擴(kuò)增試劑盒采用ABI試劑盒2XTaqManUniversal PCR Master MixI10
[0027]實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系如下:
[0028]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測尖抱鍵刀菌古巴?；虸號生理小種oxysporum f.sp.cubenserace I)的TaqMan引物和探針，其中，所述的引物序列為:上游引物Focl_0422Fl 5’-AGGTGAGMATCTGTTGAGTCTCGAT-3，，下游引物 Focl_0422Rl 5’ -MCTCCTTCACCAGCCTTTCG-3 ’，探針為5’熒光標(biāo)記，3’淬滅劑標(biāo)記的DNA序列，所述的序列為:Focl-0422Pl5’ -Dye-AGCATGGCAGGTCGT-Quen -3'
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其中所述的突光劑選自Biotin、Cy3、Cy5、Digoxin、FAM、HEX、JOE、ROX、TAMRA, Amino、Phosphorylation、ROX、SHC6、SIMA (HEX)、TET。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其中所述的淬滅劑選自JOE、BHQUBHQ2、ROX、BHQ3、TAMRA> Biotin、BiotinTEG、Dabcyl> Dabsyl> TET、Digoxin、Amino、diThiol、Eclipse、FAM、HEX、Phosphorylation, SHC6、SHC3。
4.如權(quán)利要求1所述的引物和探針，其中所述的探針的為Focl-0422Pl5’ FAM-ATAATCGAACAGTTTGCG-BHQ3 3’。
5.一種檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種{Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4)的試劑盒，其特征在于包括引物和探針，所述的引物和探針的序列為:上游引物 Focl-0422F1 5’ -AGGTGAGAAATCTGTTGAGTCTCGAT-3’，下游引物 Focl-0422R1 5’ -AACTCCTTCACCAGCCTTTCG-3’，探針序列為:Focl_0422Pl5’ -Cy5-AGCATGGCAGGTCGT-BHQ3-3’。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測尖孢鐮刀菌古巴?；虸號生理小種的試劑盒，其特征在于還包括實(shí)施熒光定量PCR所需要的其他試劑，具體為TaqMan Universal PCR MasterMix，包含尖孢鐮刀菌古巴?；虸號生理小種DNA片段的質(zhì)粒模板，TE緩沖液。
7.—種檢測尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1所述的探針和引物進(jìn)行TaqMan熒光定量檢測，具體方法包括: 1)樣品DNA提取采用CTAB兩步法，提取前用液氮充分研磨，提取后用NanoDroplOOO型核酸微量測定儀測定核酸濃度。具體提取步驟如下: 稱取Ig樣品(根據(jù)樣品的DNA含量，可以調(diào)整樣品量)，加入到50mL的離心管中；加入5mLCTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻，65 V孵育30min，不時振蕩；65 V過夜后，8000r/min室溫離心IOmin,取Iml上清液入2ml離心管中；加入700 μ L氯仿后用力振蕩，13000Xg離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清液600 μ L到新的2ml離心管中；加入2倍體積的CTAB沉淀溶液顛倒數(shù)次后室溫靜置60min，13000 Xg離心lOmin，棄去上清，加入350 μ LNaCl溶液將沉淀進(jìn)行懸浮，再加入350 μ L氯仿，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13000 Xg離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清后加入0.8倍體積的異丙醇用來沉淀核酸,室溫放置20min, 13000 Xg離心IOmin,棄去上清，加入500 μ L70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于50 μ LTE溶液中； 2)實(shí)時熒光PCR檢測方法特異性驗(yàn)證 使用熒光探針Foc 1-0422Ρ1及引物Foc 1_0422F1/Foc 1-0422R1進(jìn)行實(shí)時熒光PCR，共同檢測香蕉串珠鐮刀菌、冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌和甜瓜枯萎病菌、火龍果枯萎病菌等鐮刀菌屬內(nèi)近似種及鐮刀菌屬外青霉屬。擴(kuò)增試劑盒采用ABI試劑盒2XTaqMan UniversalPCR Master Mix II， 實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系如下:
【文檔編號】C12Q1/04GK103789418SQ201410011304
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】楊雷亮, 孫麗霞, 邱德義, 陳定虎, 李華平, 管維, 王章根 申請人:中華人民共和國中山出入境檢驗(yàn)檢疫局