一種棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑及其制備方法與它的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑及其制備方法與它的用途。棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑制備方法包括耐砷活性保持培養(yǎng)、純化培養(yǎng)、搖瓶種子培養(yǎng)、發(fā)酵種子培養(yǎng)、控制發(fā)酵與后處理等步驟。本發(fā)明棘孢木霉菌厚垣孢子具有高的抗逆境能力，其粉劑受環(huán)境溫度、酸堿度等影響小，環(huán)境中不同砷濃度水平對(duì)厚垣孢子萌發(fā)無(wú)明顯影響。因此，棘孢木霉菌厚垣孢子具有很強(qiáng)的生命力，在土壤中存活時(shí)間很長(zhǎng)，明顯促進(jìn)土壤中砷的揮發(fā)，減少土壤中砷的總量，從而可以有效地修復(fù)受砷污染的土壤。本發(fā)明的方法能夠縮短大量生產(chǎn)棘孢木霉菌厚垣孢子所需的時(shí)間，顯著地降低了棘孢木霉菌厚垣孢子生產(chǎn)成本，有利于該技術(shù)推廣應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑及其制備方法與它的用途
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，本發(fā)明涉及一種棘孢木霉菌厚垣孢子粉齊?，還涉及所述棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑的制備方法，還涉及所述棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑的用途。
【【背景技術(shù)】】
[0002]木霉菌(Trichoderma spp.)是一類土壤中普遍存在的腐生真菌,其生長(zhǎng)快、生物量大。木霉菌在其生長(zhǎng)周期內(nèi)可以產(chǎn)生三種繁殖體，包括菌絲體、厚垣孢子和分生孢子，目前生產(chǎn)實(shí)際中常用的木霉菌劑多為它的活分生孢子制劑，如以色列開發(fā)的哈茨木霉T39可濕性粉劑Trichodex,美國(guó)的Topshield(哈茨木霉T22)等。一些木霉菌常?？尚纬蓤A形或橢圓形的厚垣孢子，在基內(nèi)菌絲上間生，或者在營(yíng)養(yǎng)菌絲側(cè)枝的尖端端生，其大小在7~12X 10_13 μ m,表面光滑，細(xì)胞壁有加厚現(xiàn)象，無(wú)性生殖產(chǎn)生，通常有耐不良環(huán)境條件的能力。厚垣孢子是木霉菌重要的繁殖體形式。木霉屬厚垣孢子在土壤中存活能力要優(yōu)于分生孢子，至少能存活20月。
[0003]在木霉菌的眾多種類中，棘孢木霉(Trichoderma asperellum)具有富集與轉(zhuǎn)化砷功能、能忍耐高砷環(huán)境且生長(zhǎng)良好。如Zeng等(Capability of Pentavalent ArsenicBioaccumulation and Biovolatilization of Three Fungal Strains under LaboratoryConditions, Clean-Soil Air Water, 2010, 38 (3), 238-241)報(bào)道的結(jié)果表明，棘孢木霉菌對(duì)環(huán)境中砷具有很高的耐受性，并且可將環(huán)境中砷累積于細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)將砷轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)的形態(tài)從而釋放到大氣中，進(jìn)而減少環(huán) 境中砷的含量。因此，棘孢木霉菌可被用于砷污染環(huán)境的修復(fù)中。此外，木霉菌的生防能力也被大家廣泛認(rèn)同。
[0004]目前，許多研究者就對(duì)木霉的產(chǎn)孢條件進(jìn)行了大量的摸索，以期高效地將該類木霉菌應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中。從木霉菌分生孢子的產(chǎn)生條件來(lái)看，其在多種固體或液體培養(yǎng)基中都能夠產(chǎn)生分生孢子，而且城市垃圾、腐敗的咖啡果皮、禽類的糞便以及混以牛糞的咖啡果皮、香蕉葉、甘蔗渣和麥麩等廉價(jià)物質(zhì)均可作為木霉菌的固體培養(yǎng)基來(lái)生產(chǎn)分生孢子，且孢子產(chǎn)量都可達(dá)IO9CFU/克左右。由此來(lái)看，木霉菌產(chǎn)生分生孢子的生產(chǎn)條件相對(duì)要求較低。
[0005]近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)T.harzianum, T.viride等木霉菌株在糖蜜一玉米衆(zhòng)等液體培養(yǎng)基中進(jìn)行深層發(fā)酵15天左右可產(chǎn)生IO7數(shù)量級(jí)的厚垣孢子；在麥麩等、滅菌土壤、土壤浸出液及植物碎片等固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天左右也可產(chǎn)生厚垣孢子達(dá)IO6數(shù)量級(jí)?？傮w來(lái)看，目前報(bào)道的各木霉菌厚垣孢子的發(fā)酵時(shí)間均較長(zhǎng)(>15天)，且成本較高，發(fā)酵的產(chǎn)率較低，并且發(fā)酵后生成的部分厚垣孢子的活性或作用能力可能會(huì)降低或喪失。目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到具有富集與轉(zhuǎn)化砷功能棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑制備的相關(guān)報(bào)道。所生產(chǎn)出的厚垣孢子如果以液態(tài)形式施用，不僅運(yùn)輸不方便、而且也易使菌劑受到污染；而厚垣孢子經(jīng)制備成固態(tài)粉劑后，不僅運(yùn)輸方便、菌劑受污染的幾率大大減少，而且還利于儲(chǔ)存、方便應(yīng)用等，同時(shí)對(duì)提高菌株的活性和應(yīng)用效果等具有良好作用?！?br/>【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006][要解決的技術(shù)問(wèn)題]
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑的制備方法。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑的用途。
[0010][技術(shù)方案]
[0011]本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0012]本發(fā)明涉及一種棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑的制備方法。
[0013]本發(fā)明使用的棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，保存編號(hào)為CGMCC N0.3186，保存日期為2009年7月09日，具體參見(jiàn)申請(qǐng)日2012年09月26日、申請(qǐng)?zhí)?01210361866.6、發(fā)明名稱“一種棘孢木霉菌的篩選方法及其應(yīng)用”的發(fā)明專利申請(qǐng)。
[0014]該制備方法的步驟如下:
[0015]A、耐砷活性保持培養(yǎng)
[0016]按照棘孢木霉菌菌懸液與菌種培養(yǎng)基的體積比1:45~55，將含菌量為1.0~9.9X104cfu/ml的棘孢木霉菌菌懸液接入在培養(yǎng)瓶中的砷濃度為43~50mg/l的菌種培養(yǎng)基里，在溫度26~30°C與搖床轉(zhuǎn)速120~140rpm的條件下連續(xù)培養(yǎng)4~6天，待其瓶中棘孢木霉菌絲體體積為所述菌種培養(yǎng)基體積的1/2~2/3時(shí)，再?gòu)脑撈恐腥〕黾吣久咕鷳乙涸谏鲜龊榈腜GP培養(yǎng)基中在上述條件下進(jìn)行培養(yǎng)，按照這種方式重復(fù)培養(yǎng)3~4次，得到含菌量為1.0~9.9X 104cfu/ml的、具有耐砷活性的棘孢木霉菌的菌懸液。然后，按照含有具有耐砷活性的棘孢木霉菌菌懸液與菌種培養(yǎng)基的體積比1:45~55，將該棘孢木霉菌菌懸液接入在培養(yǎng)瓶中的無(wú)砷菌種培養(yǎng)基里，在溫度26~30°C與搖床轉(zhuǎn)速120~140rpm的條件下連續(xù)培養(yǎng)3~5天,待其瓶中棘孢木霉菌絲體體積為所述菌種培養(yǎng)基體積的1/2~2/3時(shí)結(jié)束純化培養(yǎng)，得到含菌量為1.0~9.9X104cfu/ml的不含砷的，具有高耐砷活性的棘孢木霉菌的菌懸液。
[0017]所述的菌種培養(yǎng)基(PGP)是按照下述方法制備得到的:
[0018]取20g削皮馬鈴薯在水中煮沸20分鐘，榨汁，將得到的汁與1.0g葡萄糖、0.3g蛋白胨、2.0g瓊脂與100ml水混合，將得到的混合物的pH值調(diào)節(jié)至6.8~7.2，滅菌后得到所述的菌種培養(yǎng)基，得到所述的菌種培養(yǎng)基。
[0019]在本發(fā)明中，采用的滅菌方法是本【技術(shù)領(lǐng)域】里常規(guī)滅菌方法。
[0020]根據(jù)本發(fā)明，含砷菌種培養(yǎng)基是按照本發(fā)明對(duì)砷濃度的要求，將含有V價(jià)砷的水溶性化合物溶于所述的菌種培養(yǎng)基(PGP)中所得到的菌種培養(yǎng)基。
[0021]在本發(fā)明中，所述的含有V價(jià)砷的水溶性化合物例如是砷酸鈉、砷酸鉀或砷酸鈣，優(yōu)選地是砷酸鈉。
[0022]在本發(fā)明中，所述含砷菌種培養(yǎng)基的砷濃度優(yōu)選地是45~48mg/l。
[0023]優(yōu)選地，棘孢木霉菌 菌懸液與菌種培養(yǎng)基的體積比是1:48~52，更優(yōu)選地是1:50。
[0024]在本發(fā)明中，使用的微生物培養(yǎng)搖床是本【技術(shù)領(lǐng)域】里通常使用的培養(yǎng)微生物的設(shè)備，是目前市場(chǎng)上銷售的產(chǎn)品。
[0025]在本發(fā)明中，棘孢木霉菌絲體體積是采用微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常規(guī)方法[《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(合肥工業(yè)大學(xué)出版社，2009)、《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(科學(xué)出版社，2010)]測(cè)定的。
[0026]棘孢木霉菌的菌懸液的含菌量采用稀釋平板計(jì)數(shù)法，該方法是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作中的常規(guī)方法(微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，科學(xué)出版社，2010)。
[0027]根據(jù)本發(fā)明，棘孢木霉菌在含砷的PGP培養(yǎng)基中重復(fù)培養(yǎng)的目的在于充分活化棘孢木霉菌對(duì)砷的耐受能力。然后于不含砷的PGP培養(yǎng)基中培養(yǎng)的目的在于去除棘孢木霉菌中可能含有的砷，同時(shí)保持其較高的耐砷活性。
[0028]B、搖瓶種子培養(yǎng)
[0029]按照純化棘孢木霉菌的菌懸液與搖瓶種子培養(yǎng)基的體積比1:400~500，將步驟B得到的含菌量為1.0~9.9X 104cfu/ml的純化棘孢木霉菌的菌懸液接種于裝有搖瓶種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在溫度26~30°C與搖床轉(zhuǎn)速160~180rpm的條件下連續(xù)培養(yǎng)28-32小時(shí)，待搖瓶中微生物進(jìn)入其生長(zhǎng)速度最快的指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，得到搖瓶種子。
[0030]所述的搖瓶種子培養(yǎng)是按照下述方法制備得到的:
[0031]將淀粉、葡萄糖、酵母粉與CaCO3按照重量比2.5:1.2:1.2:0.2溶于100重量份水中，然后進(jìn)行濕熱滅菌，得到所述的搖瓶種子培養(yǎng)。
[0032]濕熱滅菌法是指用飽和水蒸氣、沸水或流通蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。濕熱滅菌法以高溫高壓水蒸氣為介質(zhì)，由于蒸汽潛熱大，穿透力強(qiáng)，容易使蛋白質(zhì)變性或凝固，最終導(dǎo)致微生物死亡，所以該法的滅菌效率比干熱滅菌法高，是藥物制劑生產(chǎn)過(guò)程中最常用的滅菌方法。濕熱滅菌法包括煮沸滅菌法、巴氏消毒法、高壓蒸汽滅菌法、流通蒸汽滅菌法和間歇蒸汽滅菌法。
[0033]在本發(fā)明中，進(jìn)行濕熱滅菌所采用的方法是高壓蒸汽滅菌法，其具體條件是在溫度121°C的條件下滅菌15分鐘，濕熱滅菌所使用的設(shè)備是本【技術(shù)領(lǐng)域】里通常使用的滅菌設(shè)備，例如是北京科林恒達(dá)科技有限公司的型號(hào)為致微GI80TR的高溫滅菌鍋。
[0034]C、發(fā)酵種子培養(yǎng)
[0035]將步驟B得到的搖瓶種子按照搖瓶種子與發(fā)酵種子培養(yǎng)基的體積比1:200~250接入發(fā)酵種子培養(yǎng)基中，在溫度26~30°C與搖床轉(zhuǎn)速160~180rpm的條件下連續(xù)培養(yǎng)25~30小時(shí)，得到發(fā)酵種子。
[0036]這個(gè)步驟的主要目的在于培養(yǎng)用于大量生產(chǎn)棘孢木霉菌厚垣孢子的發(fā)酵種子。
[0037]所述的發(fā)酵種子培養(yǎng)基是按照下述方法制備得到的:
[0038]將淀粉、葡萄糖、酵母粉與CaCO3按照重量比4:5:2:1溶于500重量份水中，將得到溶液的PH值調(diào)節(jié)至6.5~6.8，然后蒸汽滅菌，得到所述的發(fā)酵種子培養(yǎng)基。
[0039]發(fā)酵種子培養(yǎng)基的pH值可以使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。無(wú)機(jī)酸例如是硫酸、鹽酸或磷酸；無(wú)機(jī)堿例如是氫氧化鈉、氫氧化鉀或碳酸鈉。無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液的濃度一般是0.5-2.0N。
[0040]在本發(fā)明中，所述蒸汽滅菌的具體條件是在溫度121°C的條件下滅菌15分鐘。
[0041]本發(fā)明發(fā)酵種子培養(yǎng)所使用的設(shè)備是本【技術(shù)領(lǐng)域】里通常使用的種子培養(yǎng)設(shè)備，例如是金壇市城西富威實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)的型號(hào)為HZQ-A的大型氣浴恒溫?fù)u床。
[0042]D、控制發(fā)酵[0043]在發(fā)酵罐中，按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)6~10%接種量將步驟C得到的發(fā)酵種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中在下述條件下進(jìn)行控制發(fā)酵:
[0044]控制發(fā)酵溫度:在控制發(fā)酵第O~20小時(shí)為26°C;在控制發(fā)酵第20~50小時(shí)為28°C，然后將發(fā)酵溫度控制在26°C直到控制發(fā)酵結(jié)束；
[0045]通氣量:以發(fā)酵培養(yǎng)基與空氣體積比計(jì)，在控制發(fā)酵第O~15小時(shí)為1:0.6，在控制發(fā)酵第15~50小時(shí)為1:1，在控制發(fā)酵第50小時(shí)以后為1:0.6 ;
[0046]攬祥速度:160~180rpm。
[0047]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基是按照下述方法制備得到的:
[0048]將淀粉、酵母粉、玉米漿、蛋白胨、CaCO3按照重量比16.5,11.0,22.0,16.5,2.05溶 于650重量份水中，將得到溶液的pH值調(diào)節(jié)至6.5~7.2，然后蒸汽滅菌，得到所述的發(fā)酵
培養(yǎng)基。
[0049]本發(fā)明控制發(fā)酵所使用的發(fā)酵罐是本【技術(shù)領(lǐng)域】里通常使用的發(fā)酵設(shè)備，例如是江蘇豐澤生物工程設(shè)備制造有限公司生產(chǎn)的型號(hào)為FZ-D300L的發(fā)酵設(shè)備。
[0050]這個(gè)步驟的主要作用在于通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程，以便高效、大量地生產(chǎn)棘孢木霉菌厚垣孢子。
[0051]E、后處理
[0052]向步驟D中得到的控制發(fā)酵液中添加以控制發(fā)酵液總重量計(jì)3-6%硅藻土，再對(duì)該發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾，得到的厚垣孢子再自然風(fēng)干，得到的固態(tài)厚垣孢子再使用研磨器進(jìn)行研磨，得到棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑。
[0053]使用硅藻土主要是用于提高發(fā)酵液中厚垣孢子的濃度，避免過(guò)濾過(guò)程中可能產(chǎn)生的厚垣孢子流失，此外，還可以提高過(guò)濾的速度，提高工作效率。
[0054]本發(fā)明對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾的裝置是本【技術(shù)領(lǐng)域】里通常使用的發(fā)酵設(shè)備，例如是上海鈞鼎機(jī)械制造有限公司生產(chǎn)的450型鑄鐵板框式壓濾機(jī)，
[0055]過(guò)濾后的棘孢木霉菌厚垣孢子平鋪在濾紙上，讓其在溫度20~30°C下自然風(fēng)干。
[0056]得到的固態(tài)厚垣孢子再使用本【技術(shù)領(lǐng)域】里通常使用的研磨器進(jìn)行研磨，得到棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑。
[0057]本發(fā)明還涉及采用所述制備方法所得到的棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑。所述的粉劑只含有厚垣孢子，所述厚垣孢子的含量是8.3X108cfu/g以上。
[0058]利用無(wú)菌水將本發(fā)明制備的棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑稀釋，然后使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，同時(shí)采用稀釋平板計(jì)數(shù)分析，分析結(jié)果表明所述棘孢木霉菌厚垣孢子粉的厚垣孢子含量達(dá)到8.3X 108cfu/g。通過(guò)顯微鏡分析還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明制備的棘孢木霉菌厚垣孢子粉全部為厚垣孢子，無(wú)其它類型的孢子成分。以上方法均是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作中的通過(guò)方法，具體地可以參見(jiàn)《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(合肥工業(yè)大學(xué)出版社，2009)、《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(科學(xué)出版社，2010)。
[0059]另外，將本發(fā)明制備的棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑研磨至100目，然后使用能譜儀(EDS)對(duì)其粉末樣品進(jìn)行了元素含量分析，具體分析條件如下:
[0060]美國(guó)熱電Thermo-VG Scientific公司的ESCALAB250型能譜儀；測(cè)定條件:樣品平鋪于專用樣品架上，待達(dá)到真空后，利用儀器進(jìn)行元素相對(duì)含量分析，數(shù)據(jù)采用儀器配置的專用軟件進(jìn)行分析。[0061]元素含量分析結(jié)果列于下表1中。由表1可見(jiàn)，本發(fā)明制備的棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑的碳、氧、氮、鉀、鈉、鈣、磷、硫等元素含量，具有典型的生物體元素含量特征(參見(jiàn)〈微生物學(xué)〉，高等教育出版社，2009年出版)。
[0062]表1:棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑元素含量分析結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑的制備方法，其特征在于該方法的步驟如下: A、耐砷活性保持培養(yǎng) 按照棘孢木霉菌菌懸液與菌種培養(yǎng)基的體積比1:45~55，將含菌量為1.0~9.9X104cfu/ml的棘孢木霉菌菌懸液接入在培養(yǎng)瓶中的砷濃度為43~50mg/l的菌種培養(yǎng)基里，在溫度26~30°C與搖床轉(zhuǎn)速120~140rpm的條件下連續(xù)培養(yǎng)4~6天，待其瓶中棘孢木霉菌絲體體積為所述菌種培養(yǎng)基體積的1/2~2/3時(shí)，再?gòu)脑撈恐腥〕黾吣久咕鷳乙涸谏鲜龊榈腜GP培養(yǎng)基中在上述條件下進(jìn)行培養(yǎng)，按照這種方式重復(fù)培養(yǎng)3~4次，得到含菌量為1.0~9.9X 104cfu/ml的、具有耐砷活性的棘孢木霉菌的菌懸液；然后，按照含有具有耐砷活性的棘孢木霉菌菌懸液與菌種培養(yǎng)基的體積比1:45~55，將該棘孢木霉菌菌懸液接入在培養(yǎng)瓶中的無(wú)砷菌種培養(yǎng)基里，在溫度26~30°C與搖床轉(zhuǎn)速120~140rpm的條件下連續(xù)培養(yǎng)3~5天,待其瓶中棘孢木霉菌絲體體積為所述菌種培養(yǎng)基體積的1/2~2/3時(shí)結(jié)束純化培養(yǎng)，得到含菌量為1.0~9.9X104cfu/ml的不含砷的，且具有較高耐砷活性的棘孢木霉菌的菌懸液； B、搖瓶種子培養(yǎng) 按照純化棘孢木霉菌的菌懸液與搖瓶種子培養(yǎng)基的體積比1:400~500，將步驟B得到的含菌量為1.0~9.9X 104cfu/ml的純化棘孢木霉菌的菌懸液接種于裝有搖瓶種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在溫度26~30°C與搖床轉(zhuǎn)速160~180rpm的條件下連續(xù)培養(yǎng)28-32小時(shí)，待搖瓶中微生物進(jìn)入其生長(zhǎng)速度最快的指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，得到搖瓶種子； C、發(fā)酵種子培養(yǎng) 將步驟C得到的搖瓶種子按照搖瓶種子與發(fā)酵種子培養(yǎng)基的體積比1:200~250接入發(fā)酵種子培養(yǎng)基中，在溫度26~30°C與搖床轉(zhuǎn)速160~180rpm的條件下連續(xù)培養(yǎng)25~30小時(shí)，得到發(fā)酵種子； D、控制發(fā)酵 在發(fā)酵罐中，按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)6~10%接種量將步驟C得到的發(fā)酵種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中在下述條件下進(jìn)行控制發(fā)酵: 控制發(fā)酵溫度:在控制發(fā)酵第O~20小時(shí)為26°C;在控制發(fā)酵第20~50小時(shí)為28°C，然后將發(fā)酵溫度控制在26 °C直到控制發(fā)酵結(jié)束； 通氣量:以發(fā)酵培養(yǎng)基與空氣體積比計(jì)，在控制發(fā)酵第O~15小時(shí)為1:0.6，在控制發(fā)酵第15~50小時(shí)為1:1，在控制發(fā)酵第50小時(shí)以后為1:0.6 ; 攪拌速度:160~180rpm ； E、后處理 向步驟D中得到的控制發(fā)酵液中添加以控制發(fā)酵液總重量計(jì)3-6%硅藻土，再對(duì)該發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾，得到的厚垣孢子經(jīng)自然風(fēng)干，得到的固態(tài)厚垣孢子再使用研磨器進(jìn)行研磨，得到棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟A中，所述的菌種培養(yǎng)基是按照下述方法制備得到的: 取20g削皮馬鈴薯在水中煮沸20分鐘，榨汁，將得到的汁與1.0g葡萄糖、0.3g蛋白胨、2.0g瓊脂與100ml水混合，將得到的混合物的pH值調(diào)節(jié)至6.8~7.2，滅菌后得到所述的菌種培養(yǎng)基，得到所述的菌種培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的砷是砷酸鈉、砷酸鉀或砷酸鈣。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟B中，所述的搖瓶種子培養(yǎng)是按照下述方法制備得到的: 將淀粉、葡萄糖、酵母粉與CaCO3按照重量比2.5:1.2:1.2:0.2溶于100重量份水中，然后進(jìn)行濕熱滅菌，得到所述的搖瓶種子培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟C中，所述的發(fā)酵種子培養(yǎng)基是按照下述方法制備得到的: 將淀粉、葡萄糖、酵母粉與CaCO3按照重量比4:5:2:1溶于500重量份水中，將得到溶液的PH值調(diào)節(jié)至6.5~6.8，然后蒸汽滅菌，得到所述的發(fā)酵種子培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟D中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基是按照下述方法制備得到的: 將淀粉、酵母粉、玉米漿、玉米漿、蛋白胨、CaCO3按照重量比16.5、11.0、22.0、16.5、2.05溶于650重量份水中，將得到溶液的pH值調(diào)節(jié)至6.5~7.2，然后蒸汽滅菌，得到所述的發(fā)酵培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟E中，所述的過(guò)濾方法為板框壓濾法。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟E中，所述的自然風(fēng)干溫度是20 ~30?。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述制備方法所得到的棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑，其特征在于所述的粉劑只含有厚垣孢子，所述厚垣孢子的含量是8.3X108cfu/g以上。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的棘孢木霉菌厚垣孢子粉劑在修復(fù)被砷污染的土壤中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N3/00GK103740634SQ201410003169
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】曾希柏, 蔣細(xì)良, 蘇世鳴, 王秀榮, 李蓮芳, 白玲玉, 王亞男, 段然, 吳翠霞 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所, 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所