檢測空腸彎曲菌喹諾酮類抗生素耐藥突變位點(diǎn)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測空腸彎曲菌喹諾酮類抗生素耐藥突變位點(diǎn)的方法。該方法包括:以gyrA基因編碼序列的第257位是C的空腸彎曲菌作為野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株，以gyrA基因編碼序列的第257位是T的空腸彎曲菌作為突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株，與待測空腸彎曲菌分別同時進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析；根據(jù)高分辨率熔解曲線的比較結(jié)果確定待測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T：如待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線與野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的一致，待測空腸彎曲菌候選為gyrA基因編碼序列的第257位是C的菌株，如待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線與突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的一致，待測空腸彎曲菌候選為gyrA基因編碼序列的第257位是T的菌株。
【專利說明】檢測空腸彎曲菌喹諾酮類抗生素耐藥突變位點(diǎn)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測空腸彎曲菌喹諾酮類抗生素耐藥突變位點(diǎn)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)又稱空腸彎曲桿菌,是引起人急性胃腸炎的最重要的食源性致病菌之一，臨床上95%以上的彎曲菌性腸炎都是由空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌引起。空腸彎曲菌可通過食物鏈傳播給人，污染的禽肉、牛奶和飲用水都是主要的傳播途徑。喹諾酮類藥物是治療空腸彎曲菌引起的腸炎中使用最普遍的藥，同時也是臨床上針對彎曲菌感染的一線治療藥物。耐藥空腸彎曲菌的出現(xiàn)導(dǎo)致臨床上空腸彎曲菌病病程遷延不愈和治療失敗，極大的威脅人類健康，同時耐藥菌株也導(dǎo)致治療成本增加等問題，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失?？漳c彎曲菌對喹諾酮類抗生素的耐藥性是由其DNA促旋酶A亞基的編碼基因(gyrA基因)上的喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)的點(diǎn)突變所引起。gyrA的野生型基因如序列表的序列3所示，其讀碼框(編碼序列)為序列3第287至2878位核苷酸所示(2592個核苷酸)。gyrA基因讀碼框(編碼序列)第257位(序列3的第543位)核苷酸由C突變?yōu)門 (因此又稱C257T突變)，造成其編碼的蛋白質(zhì)的第86位氨基酸殘基由蘇氨酸(由aca編碼)突變?yōu)楫惲涟彼?由ata編碼)，引起空腸彎曲菌對喹諾酮類抗生素表現(xiàn)出高水平耐藥(最小抑菌濃度均≥64mg/ μ L)。因此，gyrA基因讀碼框的第257位核苷酸被稱為257突變位點(diǎn)，又被稱為喹諾酮類抗生素耐藥突變位點(diǎn)。為了確定待檢空腸彎曲菌是否高水平耐受喹諾酮類抗生素，有必要建立一種快速準(zhǔn)確的分子生物學(xué)檢測方法。
[0003]目前用于檢測空腸彎 曲菌耐藥的方法主要有傳統(tǒng)的藥物敏感性試驗(yàn)法和基因型突變檢測法。傳統(tǒng)的基因型突變檢測法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-線性探針法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析法、錯配擴(kuò)增突變聚合酶鏈反應(yīng)法及熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法等方法，上述幾種以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的基因型突變檢測方法成本較高，不適宜對大量樣品進(jìn)行檢測，而且僅是定性試驗(yàn)，無法進(jìn)行點(diǎn)突變基因突變方向判定的定性試驗(yàn)。傳統(tǒng)的藥物敏感性試驗(yàn)需要進(jìn)行空腸彎曲菌培養(yǎng)，要求較高的培養(yǎng)條件，需要花費(fèi)大量的時間，不滿足急性傳染病緊急疫情防治工作的需要。
[0004]高分辨率熔解曲線(High Resolution Melting, HRM)是在實(shí)時熒光定量PCR基礎(chǔ)上通過飽和染料監(jiān)控核酸的熔解曲線變化進(jìn)行分析的一種新興技術(shù)。高分辨率熔解曲線技術(shù)基于有序列變化的基因片段之間微弱的Tm值差異，通過DNA片段熔解曲線的差異進(jìn)行突變檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種簡便、快捷、準(zhǔn)確率高、可進(jìn)行批量檢測的檢測引起高水平耐受喹諾酮類抗生素空腸彎曲菌點(diǎn)突變的方法。
[0006]本發(fā)明所提供的檢測空腸彎曲菌喹諾酮類抗生素耐藥突變位點(diǎn)的方法，是一種快速檢測由于核苷酸點(diǎn)突變引起對喹諾酮類抗生素耐藥的空腸彎曲桿菌gryA突變位點(diǎn)的分子生物學(xué)方法，具體是輔助檢測或檢測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T的方法，包括:以gyrA基因編碼序列的第257位是C的空腸彎曲菌作為野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株，以gyrA基因編碼序列的第257位是T的空腸彎曲菌作為突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株，與待測空腸彎曲菌分別同時進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析,所述野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線分析、所述突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線分析和所述待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線分析中除PCR擴(kuò)增的模板為各自的基因組DNA外，其它分析條件均相同；將待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線與野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線和突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線進(jìn)行比較，根據(jù)比較結(jié)果確定待測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T:如果所述待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線與所述野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線一致，所述待測空腸彎曲菌候選為gyrA基因編碼序列的第257位是C的菌株，如果所述待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線與所述突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線一致，所述待測空腸彎曲菌候選為gyrA基因編碼序列的第257位是T的菌株；
[0007]所述野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸與SEQ ID N0.3的第495-625位相同，所述突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸除第543位為T外，其它與SEQ ID N0.3的第495-625位相同；
[0008]所述高分辨率熔解曲線分析包括PCR擴(kuò)增，所述PCR擴(kuò)增采用的擴(kuò)增引物滿足如下條件:擴(kuò)增的目的DNA片段長度為100-250bp且包括空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位；所述PCR擴(kuò)增采用的反應(yīng)體系中的鎂離子濃度為2.0mM。
[0009]在本發(fā)明的一個【具體實(shí)施方式】中，所述PCR擴(kuò)增采用的擴(kuò)增引物是PgyrA131，PgyrAl31由上游引物和下游引 物組成，所述上游引物是SEQ ID N0.1所示的單鏈DNA，所述下游引物是SEQ ID N0.2所示的單鏈DNA。
[0010]在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例方式中，所述野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株為空腸彎曲菌NCTCl1168株(標(biāo)準(zhǔn)株，獲自NCTC，編號為11168)。所述突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株為空腸彎曲桿菌ZPl I。
[0011]上述方法中，所述高分辨率熔解曲線分析中，每20微升PCR反應(yīng)體系中含有10微升PCR擴(kuò)增緩沖液，2.0mM鎂離子緩沖液，0.4 μ M所述上游引物，0.4 μ M所述下游引物，所述模板lOOpg，其余為水；所述PCR擴(kuò)增緩沖液、鎂離子緩沖液和水均來自LightCycler 480High Resolution Melting Master。
[0012]所述LightCycler 480 High Resolution Melting Master 為羅氏(Roche)試劑，貨號為 04909631001。
[0013]上述方法中，所述PCR擴(kuò)增采用的引物退火條件為60°C退火30s。
[0014]在本發(fā)明的一個【具體實(shí)施方式】中，所述PCR擴(kuò)增中采用的PCR反應(yīng)溫度程序如下:先95°C預(yù)變性IOmin ;然后進(jìn)行如下30個循環(huán):95°C變性10s，60°C退火30s，72°C延伸10s。
[0015]在本發(fā)明的一個【具體實(shí)施方式】中，所述高分辨率熔解曲線分析采用羅氏LightCycler480實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)(該系統(tǒng)包括羅氏480熒光定量PCR儀器和羅氏的基因掃描程序模塊)。
[0016]上述方法中涉及的輔助檢測或檢測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T的引物PgyrA131也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0017]本發(fā)明還提供了可利用高分辨率熔解曲線分析技術(shù)輔助檢測或檢測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T的成套產(chǎn)品。
[0018]本發(fā)明所提供的輔助檢測或檢測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T的成套產(chǎn)品，包括擴(kuò)增引物、LightCycler480High Resolution Melting Master和羅氏LightCycler480實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)；所述擴(kuò)增引物滿足如下條件:擴(kuò)增的目的DNA片段長度為100-250bp且包括空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位。
[0019]上述成套產(chǎn)品中，所述擴(kuò)增引物具體可為上述PgyrA131。
[0020]本發(fā)明的方法能快速、大批量(如采用384孔PCR反應(yīng)板，可以同時檢查一百多個待測空腸彎曲菌)確定待檢空腸彎曲菌是否耐受喹諾酮類抗生素，從而簡化了以藥敏試驗(yàn)為代表的傳統(tǒng)檢測方法的復(fù)雜程序，具有良好的特異性和靈敏度，比其他檢測方法操作簡便、準(zhǔn)確快速，而且PCR產(chǎn)物無需開管二次處理，也不需要凝膠電泳檢測目的條帶。非常適合臨床大批量快速篩查高水平耐藥菌，繼而提供準(zhǔn)確的用藥指導(dǎo)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為五個鎂離子濃度PCR反應(yīng)體系的高分辨率熔解曲線-標(biāo)化平移曲線。
[0022]I為1.5mM鎂離子PCR反應(yīng)體系的高分辨率熔解曲線，2為2.0mM鎂離子PCR反應(yīng)體系的高分辨率熔解曲線，3為2.5mM鎂離子PCR反應(yīng)體系的高分辨率熔解曲線，4為3.0mM鎂離子PCR反應(yīng)體系的高分辨率熔解曲線，5為3.5mM鎂離子PCR反應(yīng)體系的高分辨率熔解曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0024]下述實(shí)施例中所用的野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株為空腸彎曲菌NCTCl1168株(NationalCollection of Type Cultures (簡稱 NCTC)菌種，編號為 11168)。
[0025]下述實(shí)施例中所用的突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株為空腸彎曲桿菌ZPll (Xia Chen, Gao-WaNaren, Congming ffu,Yang Wang, Lei Dai, L1-Ning Xia, Peng-jie Luo, QingjingZhang, Jian-Zhong Shen.Prevalence and antimicrobial resistance of Campylobacterisolates in broilers from China.Vet Microbiol.2010.144:133-139 ;陳霞.山東省肉雞源耐藥彎曲菌流行病學(xué)調(diào)查及其對喹諾酮和氨基糖苷類耐藥機(jī)制研究.[博士學(xué)位論文].北京.中國農(nóng)業(yè)大學(xué).2011)公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，該菌株只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0026]下述實(shí)施例中的待測空腸彎曲菌:喹諾酮類藥物敏感(不耐藥)的空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株 ATCC33560 (American type culture collection (簡稱 ATCC)菌種，編號為33560)、耐喹諾酮類抗生素的空腸彎曲桿菌HT8、空腸彎曲桿菌LY10、空腸彎曲桿菌LY17、空腸彎曲桿菌SX4、空腸彎曲桿菌PL66S、空腸彎曲桿菌LY121、空腸彎曲桿菌ZP74 (參考文獻(xiàn):Xia Chen, Gao-Wa Naren, Congming ffu, Yang Wang, Lei Dai, L1-Ning Xia, Peng-jieLuo, Qingjing Zhang, Jian-Zhong Shen.Prevalence and antimicrobial resistance ofCampylobacter isolates in broilers from China.Vet Microbiol.2010.144:133-139 ；陳霞.山東省肉雞源耐藥彎曲菌流行病學(xué)調(diào)查及其對喹諾酮和氨基糖苷類耐藥機(jī)制研究.[博士學(xué)位論文].北京.中國農(nóng)業(yè)大學(xué).2011)公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，這些菌株只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0027]實(shí)施例1、利用高分辨率熔解曲線分析輔助檢測或檢測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T
[0028]本實(shí)施例中采用羅氏LightCycler480實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)(該系統(tǒng)包括羅氏480熒光定量PCR儀器和羅氏的基因掃描程序(Gene Scanning)模塊)進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析建立輔助檢測或檢測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T的方法。具體如下:
[0029]1、高分辨率熔解曲線分析中PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計
[0030]通過對空腸彎曲菌NCTCl1168株、空腸彎曲桿菌ZPl1、空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC33560、耐喹諾酮類抗生素的空腸彎曲桿菌HT8、空腸彎曲桿菌LY10、空腸彎曲桿菌LY17、空腸彎曲桿菌SX4、空腸彎曲桿菌PL66S、空腸彎曲桿菌LY121和空腸彎曲桿菌ZP74的gyrA基因進(jìn)行比對，設(shè)計擴(kuò)增包含gyrA基因讀碼框的第257位核苷酸在內(nèi)的多對引物，對每一對引物進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果得到特異PCR引物PgyrA131，PgyrAl31由如下上游引物和下游引物組成: [0031]上游引物:5，CCCGTATAGTGGGTGCTGTT3’(SEQ ID N0.1)；
[0032]下游引物:5，TCCAAAGTTGCCTTGTCCTG3’(SEQID N0.2)。
[0033]實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明，PgyrA131對空腸彎曲菌NCTC11168株、空腸彎曲桿菌ZP11、空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC33560、耐喹諾酮類抗生素的空腸彎曲桿菌HT8、空腸彎曲桿菌LY10、空腸彎曲桿菌LY17、空腸彎曲桿菌SX4、空腸彎曲桿菌PL66S、空腸彎曲桿菌LY121和空腸彎曲桿菌ZP74的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的目的片段長度均為131bp。PgyrAl31對空腸彎曲菌NCTC11168株和空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC33560的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的目的片段的序列均為SEQ ID N0.3的第495-625位。PgyrA131對空腸彎曲桿菌ZPl1、耐喹諾酮類抗生素的空腸彎曲桿菌HT8、空腸彎曲桿菌LY10、空腸彎曲桿菌LY17、空腸彎曲桿菌SX4、空腸彎曲桿菌PL66S、空腸彎曲桿菌LY121和空腸彎曲桿菌ZP74的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的目的片段的序列均為gyrA基因的第495-625位核苷酸，除第543位為T外，其它與SEQ ID N0.3的第495-625位相同。說明PgyrA131對空腸彎曲桿菌具有特異性。
[0034]2、野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株和突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的確立
[0035]以空腸彎曲菌NCTCl1168株為野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株，以空腸彎曲桿菌ZPlI為突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株。
[0036]空腸彎曲菌NCTCl1168株為喹諾酮類抗生素敏感空腸彎曲菌，為標(biāo)準(zhǔn)陰性未突變菌株?？漳c彎曲菌NCTCl1168株的gyrA基因的第495-625位核苷酸與SEQ ID N0.3的第495-625位相同。
[0037]空腸彎曲桿菌ZPll為耐喹諾酮類抗生素菌株。空腸彎曲桿菌ZPll的gyrA基因的第495-625位核苷酸除第543位為T外，其它與SEQ ID N0.3的第495-625位相同。
[0038]3、PCR反應(yīng)體系中鎂離子濃度的優(yōu)化
[0039]I)設(shè)置5個PCR反應(yīng)體系，分別為1.5mM鎂離子PCR反應(yīng)體系、2.0mM鎂離子PCR反應(yīng)體系、2.5mM鎂離子PCR反應(yīng)體系、3.0mM鎂離子PCR反應(yīng)體系和3.5mM鎂離子PCR反應(yīng)體系。每20微升PCR反應(yīng)體系中含有10微升PCR擴(kuò)增緩沖液，鎂離子緩沖液，PgyrA131上游引物各0.4μ M，模板lOOpg，其余為水。1.5mM鎂離子PCR反應(yīng)體系中的鎂離子緩沖液為1.5mM鎂離子緩沖液，2.0mM鎂離子PCR反應(yīng)體系中的鎂離子緩沖液為2.0mM鎂離子緩沖液，2.5mM鎂離子PCR反應(yīng)體系中的鎂離子緩沖液為2.5mM鎂離子緩沖液，3.0mM鎂離子PCR反應(yīng)體系中的鎂離子緩沖液為3.0mM鎂離子緩沖液，3.5mM鎂離子PCR反應(yīng)體系中的鎂離子緩沖液為3.5mM鎂離子緩沖液。
[0040]各個PCR反應(yīng)體系中的所述PCR擴(kuò)增緩沖液、鎂離子緩沖液和水均來自羅氏(Roche)的 LightCycler 480 High Resolution Melting Master (貨號為 04909631001)。所述PCR擴(kuò)增緩沖液包含新型飽和DNA染料(Resolight)。
[0041]空腸彎曲桿菌ZPlI和空腸彎曲菌NCTCl1168株均分別設(shè)置上述1.5mM鎂離子PCR反應(yīng)體系、2.0mM鎂離子PCR反應(yīng)體系、2.5mM鎂離子PCR反應(yīng)體系、3.0mM鎂離子PCR反應(yīng)體系和3.5mM鎂離子PCR反應(yīng)體系，每個菌株的每個反應(yīng)體系重復(fù)3次(即一張PCR反應(yīng)板上每個菌株的每個反應(yīng)體系點(diǎn)3個孔，每孔20微升)。其中，空腸彎曲菌NCTCl1168的每個反應(yīng)體系中的模板均為空腸彎曲菌NCTCl1168株的基因組DNA，空腸彎曲桿菌ZPll的每個反應(yīng)體系中的模板均為空腸彎曲桿菌ZPll的基因組DNA?？漳c彎曲菌的基因組DNA均按照TIANamp Bacteria DNA Kit 方法制備。
[0042]2) PCR反應(yīng)溫度條件
[0043]上述I)的各個PCR反應(yīng)體系均采用如下PCR反應(yīng)溫度程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增:先95°C預(yù)變性IOmin ;然后進(jìn)行如下30個循環(huán):95°C變性10s，60°C退火30s，72°C延伸10s。
[0044]3)升溫采集熒光信號
`[0045]PCR結(jié)束后，上述I)的各個PCR反應(yīng)體系均進(jìn)行如下操作:儀器在Imin以內(nèi)升溫到95°C，之后在Imin以內(nèi)冷卻至40°C。從40°C開始以0.02°C /s升溫速率升溫到95°C，每度采集25次熒光信號。然后進(jìn)入基因掃描軟件模塊分析結(jié)果，通過標(biāo)陰、信號歸一化處理、溫度坐標(biāo)平移和差異化作圖四個步驟，得到結(jié)果圖像。
[0046]以空腸彎曲菌NCTCl1168株為野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株，以空腸彎曲桿菌ZPlI為突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株在1.5mM鎂離子PCR反應(yīng)體系、2.0mM鎂離子PCR反應(yīng)體系、2.5mM鎂離子PCR反應(yīng)體系、3.0mM鎂離子PCR反應(yīng)體系和3.5mM鎂離子PCR反應(yīng)體系這5個PCR體系下進(jìn)行上述高分辨率熔解曲線分析的結(jié)果如圖1所示，表明2.0mM鎂離子PCR反應(yīng)體系的高分辨率熔解曲線(圖1中標(biāo)號為2的那組曲線)顯示為兩條曲線，左側(cè)的為突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線，右側(cè)的為野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線，突變組和野生組三次重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)得到的曲線重合度高，且突變與野生兩種類型的區(qū)分度最好，適合用來作為判定待測臨床菌株為野生型還是突變型的標(biāo)準(zhǔn)，說明2.0mM鎂離子PCR反應(yīng)體系滿足特異性和靈敏性和重復(fù)性的要求。
[0047]4、本發(fā)明的輔助檢測或檢測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T的方法
[0048]根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用羅氏LightCycler480實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)(該系統(tǒng)包括羅氏480熒光定量PCR儀器、96孔PCR反應(yīng)板和384孔PCR反應(yīng)板和羅氏的基因掃描程序(Gene Scanning)模塊)進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析建立了如下輔助檢測或檢測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T的方法，包括:
[0049]以gyrA基因編碼序列的第257位是C的空腸彎曲菌NCTCl 1168株作為野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株，以gyrA基因編碼序列的第257位是T的空腸彎曲桿菌ZPll作為突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株，與待測空腸彎曲菌分別同時進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析,所述野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線分析、所述突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線分析和所述待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線分析中除PCR擴(kuò)增的模板為各自的基因組DNA外，其它分析條件均相同；將待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線與野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線和突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線進(jìn)行比較，根據(jù)比較結(jié)果確定待測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T:如果所述待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線與所述野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線一致，所述待測空腸彎曲菌候選為gyrA基因編碼序列的第257位是C的菌株，如果所述待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線與所述突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線一致，所述待測空腸彎曲菌候選為gyrA基因編碼序列的第257位是T的菌株;
[0050]所述野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸與SEQ ID N0.3的第495-625位相同，所述突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸除第543位為T外，其它與SEQ ID N0.3的第495-625位相同；
[0051]所述高分辨率熔解曲線分析包括PCR擴(kuò)增，所述PCR擴(kuò)增采用的擴(kuò)增引物是PgyrA131, PgyrAl31由上游引物和下游引物組成，所述上游引物是SEQ ID N0.1所示的單鏈DNA，所述下游引物是SEQ ID N0.2所示的單鏈DNA ;所述PCR擴(kuò)增采用的反應(yīng)體系中的鎂離子濃度為2.0mM ；
[0052]所述高分辨率熔 解曲線分析中，各個菌株的PCR反應(yīng)體系中，每20微升PCR反應(yīng)體系中含有10微升PCR擴(kuò)增緩沖液，2.0mM鎂離子緩沖液，PgyrA131上游引物各0.4 μ M，模板lOOpg，其余為水；野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR反應(yīng)體系中的模板為野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA，突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR反應(yīng)體系中的模板為突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA，待測空腸彎曲菌的PCR反應(yīng)體系中的模板為待測空腸彎曲菌的基因組DNA ；
[0053]各個菌株的PCR反應(yīng)體系中的所述PCR擴(kuò)增緩沖液、鎂離子緩沖液和水均來自羅氏(Roche)的LightCycler 480 High Resolution Melting MasteK貨號為 04909631001 )。所述PCR擴(kuò)增緩沖液包含新型飽和DNA染料(Resolight);各個菌株的PCR反應(yīng)體系重復(fù)3次(即一張PCR反應(yīng)板上每個菌株的每個反應(yīng)體系點(diǎn)3個孔，每孔20微升)。
[0054]各個菌株的PCR反應(yīng)體系均采用如下PCR反應(yīng)溫度程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增:先95°C預(yù)變性IOmin ;然后進(jìn)行如下30個循環(huán):95°C變性10s，60。。退火30s，72。。延伸IOs ；
[0055]PCR結(jié)束后，上述各個菌株的PCR反應(yīng)體系均進(jìn)行如下操作:儀器在Imin以內(nèi)升溫到95°C，之后在Imin以內(nèi)冷卻至40°C。從40°C開始以0.02°C /s升溫速率升溫到95°C，每度采集25次熒光信號。然后進(jìn)入基因掃描軟件模塊分析結(jié)果，通過標(biāo)陰、信號歸一化處理、溫度坐標(biāo)平移和差異化作圖四個步驟，得到結(jié)果圖像-各個菌株的高分辨率熔解曲線，將待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線與野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線和突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線進(jìn)行比較，根據(jù)比較結(jié)果確定待測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T:如果所述待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線與所述野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線一致，所述待測空腸彎曲菌候選為gyrA基因編碼序列的第257位是C的菌株，如果所述待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線與所述突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線一致，所述待測空腸彎曲菌候選為gyrA基因編碼序列的第257位是T的菌株。
[0056]按照該步驟的輔助檢測或檢測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T的方法，分別以空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC33560、耐喹諾酮類抗生素的空腸彎曲桿菌HT8、空腸彎曲桿菌LY10、空腸彎曲桿菌LY17、空腸彎曲桿菌SX4、空腸彎曲桿菌PL66S、空腸彎曲桿菌LY121和空腸彎曲桿菌ZP74這8個菌株中的每個菌株作為待測空腸彎曲菌，檢測該8個待測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T。結(jié)果表明，空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC33560的高分辨率熔解曲線與所述野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線一致，空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC33560候選為gyrA基因編碼序列的第257位是C的菌株；耐喹諾酮類抗生素的空腸彎曲桿菌HT8、空腸彎曲桿菌LYlO、空腸彎曲桿菌LY17、空腸彎曲桿菌SX4、空腸彎曲桿菌PL66S、空腸彎曲桿菌LY121和空腸彎曲桿菌ZP74這7個菌株的高分辨率熔解曲線均與所述突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線一致，所述耐喹諾酮類抗生素的空腸彎曲桿菌HT8、空腸彎曲桿菌LY10、空腸彎曲桿菌LY17、空腸彎曲桿菌SX4、空腸彎曲桿菌PL66S、空腸彎曲桿菌LY121和空腸彎曲桿菌ZP74這7個菌株均候選為gyrA基因編碼序列的第257位是T的菌株。
[0057]測序結(jié)果表明，空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC33560的gyrA基因編碼序列的第257位是C，空腸彎曲桿菌HT8、空腸彎曲桿菌LY10、空腸彎曲桿菌LY17、空腸彎曲桿菌SX4、空腸彎曲桿菌PL66S、 空腸彎曲桿菌LY121和空腸彎曲桿菌ZP74的gyrA基因編碼序列的第257位均是T。說明本發(fā) 明輔助檢測或檢測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T的方法準(zhǔn)確可靠。
【權(quán)利要求】
1.輔助檢測或檢測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T的方法，包括: 以gyrA基因編碼序列的第257位是C的空腸彎曲菌作為野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株，以gyrA基因編碼序列的第257位是T的空腸彎曲菌作為突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株，與待測空腸彎曲菌分別同時進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，所述野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線分析、所述突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線分析和所述待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線分析中除PCR擴(kuò)增的模板為各自的基因組DNA外，其它分析條件均相同；將待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線與野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線和突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線進(jìn)行比較，根據(jù)比較結(jié)果確定待測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T:如果所述待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線與所述野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線一致，所述待測空腸彎曲菌候選為gyrA基因編碼序列的第257位是C的菌株，如果所述待測空腸彎曲菌的高分辨率熔解曲線與所述突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的高分辨率熔解曲線一致，所述待測空腸彎曲菌候選為gyrA基因編碼序列的第257位是T的菌株； 所述野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸與SEQ ID N0.3的第495-625位相同，所述突變型標(biāo)準(zhǔn)菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸除第543位為T外，其它與SEQ ID N0.3的第495-625位相同； 所述高分辨率熔解曲線分析包括PCR擴(kuò)增，所述PCR擴(kuò)增采用的擴(kuò)增引物滿足如下條件:擴(kuò)增的目的DNA片段長度為100-250bp且包括空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位；所述PCR擴(kuò)增采用的反應(yīng)體系中的鎂離子濃度為2.0mM。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增采用的擴(kuò)增引物是PgyrA131, PgyrAl31由上游引物和下游引物組成，所述上游引物是SEQ ID N0.1所示的單鏈DNA，所述下游引`物是SEQ ID N0.2所示的單鏈DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述高分辨率熔解曲線分析中，每20微升PCR反應(yīng)體系中含有10微升PCR擴(kuò)增緩沖液，2.0mM鎂離子緩沖液，0.4 μ M所述上游引物，0.4μ M所述下游引物，所述模板lOOpg，其余為水；所述PCR擴(kuò)增緩沖液、鎂離子緩沖液和水均來自 LightCycler 480 High Resolution Melting Master。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增采用的引物退火條件為60°C退火30s。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增中采用的PCR反應(yīng)溫度程序如下:先95°C預(yù)變性IOmin ;然后進(jìn)行如下30個循環(huán):95°C變性10s，60°C退火30s，72°C延伸10s。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述高分辨率熔解曲線分析采用羅氏LightCycler480實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)。
7.輔助檢測或檢測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T的引物PgyrA131，是由SEQ ID N0.1所示的單鏈DNA和SEQ ID N0.2所示的單鏈DNA組成的一個引物對。
8.輔助檢測或檢測空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位是C還是T的成套產(chǎn)品，包括擴(kuò)增引物、LightCycler 480 High Resolution Melting Master 和羅氏LightCycler480實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)；所述擴(kuò)增引物滿足如下條件:擴(kuò)增的目的DNA片段長度為100-250bp且包括空腸彎曲菌gyrA基因編碼序列的第257位。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所 述的成套產(chǎn)品，其特征在于:所述擴(kuò)增引物為權(quán)利要求7所述的PgyrA131ο
【文檔編號】C12N15/11GK103695559SQ201410003192
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】吳聰明, 汪洋, 吳辰斌, 沈建忠 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)