本發(fā)明涉及基因工程和發(fā)酵工程等領(lǐng)域，更具體地，涉及一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的重組釀酒酵母。
背景技術(shù)：
：飼料原料中蛋白質(zhì)成分一般比較豐富，一般需要通過蛋白酶類降解成肽類、氨基酸，進行再利用；許多益生菌類，例如芽孢桿菌以及黑曲霉或米曲霉等都會分泌蛋白酶，對環(huán)境中蛋白質(zhì)成分進行分解利用，從而促進益生菌自身的菌體生長，但是釀酒酵母或乳酸菌分泌的蛋白酶類較少，對蛋白質(zhì)物料降解能力較低，一般需要補充蛋白胨等蛋白質(zhì)降解代謝物才能較好的生長；飼料中也一般采用酸性或中性蛋白酶。蛋白酶按照其作用方式，分為內(nèi)切酶和外切酶，一般的微生物蛋白酶類通常分為內(nèi)切酶和外切酶的混合物。飼用動物大多需要補充蛋白酶類，例如早期斷奶仔豬常需要添加蛋白酶類，彌補體內(nèi)分泌消化酶的不足?？咕?antimicrobialpeptide)原指昆蟲體內(nèi)經(jīng)誘導而產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)，分子量在2000～7000左右，由20～60個氨基酸殘基組成。這類活性多肽多數(shù)具有強堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點。抗菌肽抑制致病菌生長，不同抗菌肽對細菌、真菌、原蟲以及病毒等具有不同殺傷能力；抗菌肽還具有選擇性免疫激活和調(diào)節(jié)功能。釀酒酵母作為益生菌的重要組成部分。在釀酒酵母表達系統(tǒng)實現(xiàn)蛋白質(zhì)降解酶類和抗菌肽的分泌表達，能夠?qū)烧叩膬?yōu)點進行有機搭配：一方面分泌出來蛋白酶可以降解培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)，增加氮源、促進目的益生菌生長；另一方面可以分泌抗菌肽，抑制雜菌。此外，表達的蛋白酶基因中，發(fā)揮了不同最適pH下的蛋白酶或不同酶切位點的蛋白酶之間的協(xié)同作用，因而能夠更有效地對蛋白質(zhì)原料進行降解，生產(chǎn)具有功能性的小肽或氨基酸等。在應用方面，利用酵母培養(yǎng)物飼養(yǎng)動物，能補充消化酶、增強免疫并促進生長；在餐廚廢棄物中，降解廢棄蛋白質(zhì)、增加氮源、抑制雜菌。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種能夠在飼料添加、工業(yè)酒精生產(chǎn)、餐廚廢棄物等能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽重組釀酒酵母。本發(fā)明是通過將酸性蛋白酶(Acidprotease)基因、中性蛋白酶(Neutralprotease)基因、天冬氨酸蛋白酶(Aspartic-typeEndopeptidase)基因、絲氨酸蛋白酶(SerineProtease)基因不同的搭配和優(yōu)化，結(jié)合抗菌肽基因通過釀酒酵母共表達載體轉(zhuǎn)入到釀酒酵母中。不同的蛋白酶基因基因間的不同搭配，可實現(xiàn)蛋白酶間的合理優(yōu)化，有效發(fā)揮蛋白酶間的協(xié)同作用，同時分泌有抗菌活性的抗菌肽類，從而得到具有多功能益生重組釀酒酵母。本發(fā)明的目的在于提供一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體及其構(gòu)建方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的益生重組釀酒酵母及其構(gòu)建方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體，該載體中含有蛋白酶基因、抗菌肽基因；所述抗菌肽基因的堿基序列如SEQIDNO：5所示；所述蛋白酶基因選自酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因、天冬氨酸蛋白酶基因、絲氨酸蛋白酶基因中的至少一種。進一步的，所述酸性蛋白酶基因的堿基序列如SEQIDNO：1所示，所述中性蛋白酶基因的堿基序列如SEQIDNO：2所示，所述天冬氨酸蛋白酶基因的堿基序列如SEQIDNO：3所示，所述絲氨酸蛋白酶基因的堿基序列如SEQIDNO：4所示。進一步的，所述蛋白酶基因為酸性蛋白酶基因和中性蛋白酶基因。進一步的，所述蛋白酶基因、抗菌肽基因上游均存在α-信號肽基因序列，α-信號肽基因的堿基序列如SEQIDNO：6所示。進一步的，所述蛋白酶基因基因的啟動子選自pgk1-1、pgk1-2，終止子選自pgkt1-1、pgkt1-2；所述抗菌肽基因的啟動子為pgk1-3，終止子為pgkt1-3；所述pgk1-1的堿基序列如SEQIDNO：7所示；所述pgkt1-1的堿基序列如SEQIDNO：8所示；所述pgk1-2的堿基序列如SEQIDNO：9所示；所述pgkt1-2的堿基序列如SEQIDNO：10所示；所述pgk1-3，的堿基序列如SEQIDNO：11所示；所述pgkt1-3的堿基序列如SEQIDNO：12所示。進一步的，所述載體的骨架為pGAPZaA質(zhì)粒。進一步的，上述載體中含有釀酒酵母菌的25srDNA基因片段，其堿基序列如SEQIDNO：14所示。一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的益生重組釀酒酵母，該重組釀酒酵母基因組中插入有上述任一所述的多基因共表達載體。上述任一所述一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：S1整合表達載體pTEGC-BsmBI構(gòu)建：S1.1將G418抗性基因連入pGAPZaA質(zhì)粒載體的多克隆位點MscI和EcoRV之間，獲得載體pGAPZaA-G418；S1.2將堿基序列如SEQIDNO：14所示的rDNA基因序列的連入載體pGAPZaA-G418多克隆位點BamHI和EcoRI之間，獲得載體pGAPZaA-G418-rDNA；S1.3將載體pGAPZaA-G418-rDNA經(jīng)BglII和EcoRI雙酶切后，回收大片段產(chǎn)物，得到線性化載體pTEGC，將堿基序列如SEQIDNO：15所示的BsmBI-2片段與線性化載體pTEGC連接，得整合表達載體pTEGC-BsmBI；S2啟動子、終止子的擴增S2.1啟動子的擴增：以釀酒酵母基因組DNA為模板，分別用引物對PGK1F1-BsmBI和PGK1R1-BsmBI、PGK1F2-BsmBI和PGK1R2-BsmBI、PGK1F3-BsmBI和PGK1R3-BsmBI分別擴增出pgk1-1、pgk1-2、pgk1-3啟動子片段；S2.2終止子的擴增：以釀酒酵母基因組DNA為模板，分別用引物對PGKT1F1-BsmBI和PGKT1R1-BsmBI、PGKT1F2-BsmBI和PGKT1R2-BsmBI、PGKT1F3-BsmBI和PGKT1R3-BsmBI分別擴增出pgkt1-1、pgkt1-2、pgkt1-3終止子片段；S3α-信號肽基因、酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因、抗菌肽基因的獲得S3.1α-信號肽-酸性蛋白酶基因的獲得：分別以含α-信號肽基因序列的T載體、含酸性蛋白酶基因基因序列的T載體為模板，通過引物MfaF1-BsmBI、Mfa-apR、Mfa-apF以及apR-BsmBI進行重疊延伸PCR將α-信號肽基因序列定向連入酸性蛋白酶基因基因的5’端，擴增出mfa-ap基因片段，即含有α-信號肽基因序列和酸性蛋白酶基因序列的片段；S3.2中性蛋白酶基因的獲得：以含中性蛋白酶基因的T載體為模板，用引物npF-BsmBI以及npR-BsmBI進行擴增，獲得含有IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI的識別和切割位點的np基因片段；S3.3α-信號肽-抗菌肽基因的獲得：分別以含α-信號肽基因序列的T載體、含抗菌肽的T載體為模板，通過引物MfaF3-BsmBI、Mfa-ampF、Mfa-ampR以及Mfa-ampR-BsmBI進行重疊延伸PCR將α-信號肽序列定向連入無信號肽的抗菌肽基因的5’端，擴增出mfa-amp基因片段，即含有α-信號肽基因序列和抗菌肽基因序列的片段；S4釀酒酵母多基因共表達載體的構(gòu)建將上述獲得的酸性蛋白酶基因表達盒元件pgk1-1、mfa-ap、pgkt1-1；中性蛋白酶基因表達盒元件pgk1-2、np、pgkt1-2；抗菌肽基因表達盒元件pgk1-3、mfa-amp、pgkt1-3利用IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI進行酶切，純化回收；同時，利用IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI切割上述整合表達載體pTEGC-BsmBI，將其線性化；將所用這些片段通過一步法定向連入線性化的整合表達載體pTEGC-BsmBI中，即得釀酒酵母多基因共表達載體；上述所述引物的堿基序列如下：PGK1F1-BsmBI：CGTCTCAgatcGAAGTACCTTCAAAGPGK1R1-BsmBI：CGTCTCGgctaTATATTTGTTGTAAAPGK1F2-BsmBI：CGTCTCAgtcaGAAGTACCTTCAAAGPGK1R2-BsmBI：CGTCTCGgcatTATATTTGTTGTAAAPGK1F3-BsmBI：CGTCTCAtgcaGAAGTACCTTCAAAGPGK1R3-BsmBI：CGTCTCGtcgaTATATTTGTTGTAAAPGKT1F1-BsmBI：CGTCTCAtgtacGATCTCCCATCGTCTCTACTPGKT1R1-BsmBI：CGTCTCGgtcaAAGCTTTTTCGAAACGCAGPGKT1F2-BsmBI：CGTCTCAtacgGATCTCCCATCGTCTCTACTPGKT1R2-BsmBI：CGTCTCGtgcaAAGCTTTTTCGAAACGCAGPGKT1F3-BsmBI：CGTCTCAatcgGATCTCCCATCGTCTCTACTPGKT1R3-BsmBI：CGTCTCGagtcAAGCTTTTTCGAAACGCAGMfaF1-BsmBI：CGTCTCAgctaATGAGATTTCCTTCAATTTTTACMfa-apR：AGAGCAGCGGGCCCATGTCTTTTCTCGAGAMfa-apF：TCTCGAGAAAAGACATGGGCCCGCTGCTCTapR-BsmBI：CGTCTCAatagCTAGTTCTTGGGAGAGGCAnpF-BsmBI：CGTCTCAgtcaATGAGAGTTACTACTTTGTCTACTGnpR-BsmBICGTCTCAagctTTTAACACTTCAATTCGATAGCGTMfaF3-BsmBI：CGTCTCAtcgaATGAGATTTCCTTCAATTTTTACMfa-ampR：ACTTAGAGAAGATACCTCTTTTCTCGAGAGAMfa-ampF：TCTCTCGAGAAAAGAGGTATCTTCTCTAAGTMfa-ampR-BsmBI：CGTCTCAtagcTCTGTTGTTTTGCCAAGAGGT。一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的益生重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，將上述構(gòu)建的釀酒酵母多基因共表達載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母宿主，篩選出陽性單克隆菌落，并測序驗證正確，即得能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的益生重組釀酒酵母。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明基因重組釀酒酵母能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白酶降解，增加氮源或生產(chǎn)功能性小肽，同時分泌的抗菌肽具有抑制雜菌，促進機體生長和增強免疫等多種作用。此外，將不同特性的蛋白酶基因間的組合搭配，發(fā)揮不同蛋白酶對蛋白質(zhì)降解的協(xié)同作用，其中重組釀酒酵母能夠?qū)崿F(xiàn)分泌不同pH范圍的蛋白酶類，并不對抗菌肽基因進行降解，從而同步實現(xiàn)蛋白的降解和抗菌肽分泌等。附圖說明圖1為實施例2構(gòu)建的重組釀酒酵母蛋白酶水解圈；圖中1～9分別為挑選的不同重組單克隆，11號為宿主釀酒酵母菌。圖2為實施例2重組釀酒酵母對金黃色葡萄球菌ATCC22023的抑菌活性檢測結(jié)果；圖中A、B均為本發(fā)明重組釀酒酵母菌的發(fā)酵液，“+”為氨芐青霉素，作為陽性對照；“-”為H2O，作為陰性對照；圖3為實施例2重組釀酒酵母對枯草芽孢桿菌的抑菌活性檢測結(jié)果；圖中“81”和“65”均為本發(fā)明重組釀酒酵母菌的發(fā)酵液，“+”為氨芐青霉素，作為陽性對照；“-”為H2O，作為陰性對照。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。實施例1含酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因以及抗菌肽基因的釀酒酵母多基因共表達載體的構(gòu)建一、整合表達載體pTEGC-BsmBI構(gòu)建1)G418抗性基因的獲得PCR擴增目的基因，以載體pPIC9k為模板，利用G418F-MscI和G418R-EcoRV引物(表1)擴增G418抗性基因。PCR反應條件：98℃10s，55℃15s，72℃50s，30個循環(huán)，72℃10min。經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳驗證。目的基因回收、純化、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、驗證、送樣測序?；厥占兓康钠?，保存于-20℃?zhèn)溆?。將得到的G418抗性基因與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，37℃培養(yǎng)，提取其質(zhì)粒DNA，利用G418F-MscI和G418R-EcoRV引物進行菌落PCR篩選陽性菌株，將陽性克隆送至英濰捷基測序驗證基因的正確性。測序結(jié)果表明：G418抗性基因及其酶切位點正確連入T載，未發(fā)生突變，G418抗性基因的堿基序列如SEQIDNO：13所示。表1擴增G418抗性基因引物注：下劃線處字母為限制性內(nèi)切酶的識別/切割序列。2)載體pGAPZaA-G418的構(gòu)建在37℃下，利用限制性內(nèi)切酶MscI和EcoRV切割pGAPZaA質(zhì)粒，并在1.5％的瓊脂糖凝膠電泳驗證；利用限制性內(nèi)切酶切割MscI和EcoRV切割pMD-G418載體，獲得G418抗性基因，在1.5％的瓊脂糖凝膠電泳驗證；回收純化上述酶切產(chǎn)物中的pGAPZaA載體、G418抗性基因，利用T4連接酶將G418抗性基因連入載體pGAPZaA，獲得載體pGAPZaA-G418。3)rDNA基因擴增以釀酒酵母基因組DNA為模板，采用引物rDNAF和rDNAR引物(見表2)PCR擴增rDNA基因；PCR擴增條件為：98℃10s，55℃15s，72℃60s，30個循環(huán)，72℃10min；在1％瓊脂糖凝膠電泳驗證，并在上下游分別引入EcoRI和BamHI酶切位點。將得到的rDNA基因與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，37℃培養(yǎng)，提取其質(zhì)粒DNA，利用rDNAF和rDNAR引物進行菌落PCR篩選陽性菌株。測序結(jié)果表明：rDNA基因及其酶切位點正確連入T載，未發(fā)生突變，rDNA基因的堿基序列如SEQIDNO：14所示。表2擴增rDNA基因引物注：下劃線處字母為限制性內(nèi)切酶的識別/切割序列。4)載體pGAPZaA-G418-rDNA構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI分切下上述T載體上的rDNA片段、切割質(zhì)粒pGAPZaA-G418，回收純化pGAPZaA-G418載體骨架，利用T4連接酶將rDNA連入線性化后的載體pGAPZaA-G418，獲得重組載體pGAPZaA-G418-rDNA。5)整合表達載體pTEGC-BsmBI構(gòu)建限制性內(nèi)切酶切割BglII和EcoRI切割質(zhì)粒pGAPZaA-G418-rDNA，切除該載體上BglII到EcoRI酶切位點間的GAP啟動子、a-信號肽等序列，回收大片段產(chǎn)物，得到線性化載體pTEGC。以pMD19-Tsimple載體為模板，通過引物PMDF-BsmBI和PMDR-BsmBI(見表3)擴增出含有2個BsmBI酶切位點識別序列，約233bp的片段BsmBI-2，連入T載體，送至英濰捷基測序，測序正確，未發(fā)生突變，BsmBI-2的堿基序列如SEQIDNO：15所示。利用限制性內(nèi)切酶切割BglII和EcoRI切下重組后的T載體，回收約233bp的DNA片段BsmBI-2，然后利用T4連接酶將其正確連入線性化載體pTEGC，獲得整合表達載體pTEGC-BsmBI。表3擴增含BsmBI骨架DNA引物注：下劃線處的大寫字母為BglII或EcoRI酶切位點；小寫字母為IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI酶的識別序列。二、啟動子、終止子的擴增1)啟動子的擴增：以釀酒酵母基因組DNA為模板，利用PGK1F1-BsmBI和PGK1R1-BsmBI引物(見表4)擴增出pgk1-1啟動子片段(其堿基序列如SEQIDNO：7所示)，用作表達酸性蛋白酶基因的啟動子。同理，以釀酒酵母基因DNA為模板，利用PGK1F2-BsmBI和PGK1R2-BsmBI引物(見表4)擴增出pgk1-2啟動子片段(其堿基序列如SEQIDNO：9所示)，用作表達中性蛋白酶基因的啟動子。同理，以釀酒酵母基因DNA為模板，利用PGK1F3-BsmBI和PGK1R3-BsmBI引物(見表4)擴增出pgk1-3啟動子片段(其堿基序列如SEQIDNO：11所示)，用作表達抗菌肽基因的啟動子。上述擴增所得啟動子基因片段均分別連入到pMD19-TSimple載體中，測序驗證，保留正確的陽性克隆。2)終止子的擴增：以釀酒酵母基因組DNA為模板，利用引物PGKT1F1-BsmBI和PGKT1R1-BsmBI(見表4)擴增pgkt1-1終止子(其堿基序列如SEQIDNO：8所示)，用于表達酸性蛋白基因的終止子。以釀酒酵母基因組DNA為模板，利用引物PGKT1F2-BsmBI和PGKT1R2-BsmBI(見表4)擴增pgkt1-2終止子(其堿基序列如SEQIDNO：10所示)，用于表達中性蛋白酶基因的終止子。以釀酒酵母基因組DNA為模板，利用引物PGKT1F3-BsmBI和PGKT1R3-BsmBI(見表4)擴增pgkt1-3終止子(其堿基序列如SEQIDNO：12所示)，用于表達抗菌肽基因的終止子。上述擴增得到終止子基因片段均連入到pMD19-TSimple載體中，測序驗證，保留正確的陽性克隆。表4擴增釀酒酵母啟動子、終止子的引物注：下劃線處大寫字母為IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI的識別序列，下劃線小寫粗體字母為IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI的切割序列。三、α-信號肽基因、酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因、抗菌肽基因的獲得1)α-信號肽基因的獲得：以釀酒酵母基因組DNA為模板，利用MfaF和MfaR引物(見表5)擴增得到Mfa-BsmBI(即含有BsmBI的α-信號肽基因序列的片段)片段，擴增程序如下：98℃10s，55℃15s，72℃30s，30個循環(huán)，72℃10min；連入T載體，送樣測序，挑選正確的陽性克隆，從而將α-信號肽基因(其堿基序列如SEQIDNO：6所示)保存至T載體中。表5擴增α-信號肽基因、酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因、抗菌肽基因引物注：下劃線處大寫字母為IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI的識別序列，下劃線處小寫粗體字母為IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI的切割序列。2)酸性蛋白酶基因的獲得：參照Genbank上公布的黑曲酶(Aspergillusniger)的酸性內(nèi)肽酶(酸性蛋白酶)ap(XM_001397119.2)，通過人工合成優(yōu)化后的酸性內(nèi)肽酶(酸性蛋白酶)基因ap的堿基序列如SEQIDNO：1所示(堿基長度1140bp，氨基酸序列無信號肽)。3)中性蛋白酶基因的獲得：參照Genbank上公布的米曲霉(Aspergillusoryzae)中性蛋白酶基因np(S53810.1)通過人工合成優(yōu)化后的中性蛋白酶基因np的堿基序列如SEQIDNO：2所示(堿基長度1059bp，氨基酸序列有信號肽)。4)抗菌肽基因的獲得：通過人工合成優(yōu)化后的小棘蛙Ranaexilispinosa的抗菌肽Esculentin-1RE1突變體Es-1RE1-T的堿基序列如SEQIDNO：5所示，其氨基酸序列為GIFSKFLGKGLKNLFMKGAKTIGKEVGMDVVRTGIDIAGCKIKGEC(SEQIDNO:46)。將上述所得酸性蛋白酶基因ap、中性蛋白酶基因np、抗菌肽Esculentin-1RE1突變體Es-1RE1-T基因序列分別保存于pMD19-TSimple質(zhì)粒中，備用。5)α-信號肽-酸性蛋白酶基因的獲得：分別以含α-信號肽基因序列的T載體、含酸性蛋白酶基因ap序列的T載體為模板，用特異引物MfaF1-BsmBI、Mfa-apR、Mfa-apF以及apR-BsmBI(見表5)通過重疊延伸PCR(SOE-PCR)將α-信號肽基因序列定向連入酸性蛋白酶基因ap的5’端，擴增出mfa-ap基因片段(含有α-信號肽基因序列和酸性蛋白酶基因ap)。6)中性蛋白酶基因的獲得：以含中性蛋白酶基因np的T載體為模板，用引物npF-BsmBI以及npR-BsmBI(見表5)進行擴增，獲得含有IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI的識別和切割位點的np基因片段。7)α-信號肽-抗菌肽基因的獲得：分別以含α-信號肽基因序列的T載體、含抗菌肽Esculentin-1RE1突變體Es-1RE1-T基因的T載體為模板，用引物MfaF3-BsmBI、Mfa-ampF、Mfa-ampR以及Mfa-ampR-BsmBI(見表5)通過重疊延伸PCR(SOE-PCR)將α-信號肽序列定向連入無信號肽的抗菌肽基因的5’端，擴增出mfa-amp基因片段(含有α-信號肽基因序列和抗菌肽Esculentin-1RE1突變體Es-1RE1-T基因)。上述擴增得到基因片段均連入到pMD19-Simple載體中，測序驗證，保留正確的陽性克隆。四、含酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因以及抗菌肽基因的多基因共表達載體pTEGC-ap-np-amp的構(gòu)建將上述“二”和“三”中獲得的酸性蛋白酶基因表達盒元件pgk1-1(啟動子)、mfa-ap(含有α-信號肽基因序列和酸性蛋白酶基因ap)、pgkt1-1(終止子)；中性蛋白酶基因表達盒元件pgk1-2(啟動子)、np(含有中性蛋白酶基因np)、pgkt1-2(終止子)；抗菌肽基因表達盒元件pgk1-3(啟動子)、mfa-amp(含有α-信號肽基因序列和抗菌肽Esculentin-1RE1突變體Es-1RE1-T基因)、pgkt1-3(終止子)利用IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI分別從T載體切下，純化回收；同時，利用IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI切割上述“一”中構(gòu)建的整合表達載體pTEGC-BsmBI，將其線性化。利用T4連接酶將上述片段一次連接反應定向連入整合表達載體pTEGC-BsmBI，獲得釀酒酵母多基因共表達載體pTEGC-ap-np-amp，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑選轉(zhuǎn)化子，測序驗證，獲得正確連接的陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即得含酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因以及抗菌肽基因的多基因共表達載體pTEGC-ap-np-amp。實施例2一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的益生重組釀酒酵母的構(gòu)建一、多基因共表達載體pTEGC-ap-np-amp的預處理將實施例1構(gòu)建好的多基因共表達載體pTEGC-ap-np-amp轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a進行活化并在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取其質(zhì)粒，并進行純化回收。利用限制性內(nèi)切酶HpaI進行線性化酶切，回收純化，備用。二、重組酵母轉(zhuǎn)化子的篩選與驗證多基因共表達載體pTEGC-ap-np-amp線性化后，采用電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入釀酒酵母(對G418的最高耐受濃度為200μg/ml)中，在G418濃度為300μg/ml的YPD平板上培養(yǎng)48h以上，挑取長出的單菌落為轉(zhuǎn)化子。驗證后的轉(zhuǎn)化子逐步在含300ug/ml、500ug/ml、600ug/ml的G418的YPD液體培養(yǎng)基中進行高抗篩選，獲得陽性單克隆菌落，測序驗證，獲得正確連接的陽性重組酵母轉(zhuǎn)化子，即得能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的益生重組釀酒酵母。三、重組釀酒酵母分泌的蛋白酶及抑菌活性檢驗1)蛋白酶活性檢測實驗方法：將上步所得能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的益生重組釀酒酵母轉(zhuǎn)接到含有1％干酪素的的YPD平板上，配方如下(YPD各成分含量減半，加入干酪素作為蛋白酶酶解底物)：酵母提取物2.5g/l，胰蛋白胨2.5g/l，葡萄糖10.0g/l，干酪素10.0g/l，瓊脂粉15g/l，在30℃條件下培養(yǎng)48h以上，在4度放置1h，觀察有無明顯的透明的水解圈。利用國標“蛋白酶制劑”(GB/T23527-2009)中的福林酚法對重組釀酒酵母進行蛋白酶酶活的測定。實驗結(jié)果：觀察結(jié)果如圖1所示，從中可以看出，本實施例構(gòu)建的重組釀酒酵母周圍有明顯水解透明圈出現(xiàn)(重組菌的水解圈大小均大于宿主釀酒酵母)，說明重組釀酒酵母能夠降解利用蛋白。對重組釀酒酵母的蛋白酶酶活檢測結(jié)果如表6所示，從中可以看出實施例2構(gòu)建的重組釀酒酵母的蛋白酶酶活顯著高于未經(jīng)改造的宿主釀酒酵母，可達26U/ml。上述結(jié)果說明實施例2中將相應的酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因以及抗菌肽基因在釀酒酵母體內(nèi)共表達，篩選獲得的重組菌的酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因得到很好的表達效果，且所分泌的酸性蛋白酶、中性蛋白酶具有很好的酶活性。表6重組菌蛋白酶酶活測定菌種蛋白酶酶活(U/ml)宿主釀酒酵母3.3實施例2重組釀酒酵母262)抑菌活性檢測實驗方法：將革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌ATCC22023、枯草芽孢桿菌作為受試菌，經(jīng)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至在OD600nm＝0.4-1，適當稀釋、混勻、均勻涂布至MH培養(yǎng)基平板中(培養(yǎng)基配方為：5g/l牛肉膏浸粉、17.5g/l酪素水解物、1.5g/l淀粉、瓊脂粉20g/l)。將本實施例所得重組釀酒酵母菌的發(fā)酵液加入牛津杯中，以滅菌水為陰性對照，以氨芐青霉素(1.5μg)為陽性對照，在37℃培養(yǎng)16-18h，觀察抑菌圈情況。實驗結(jié)果：實驗結(jié)果如圖2和圖3所示，從中可以看出，本實施例構(gòu)建的重組釀酒酵母菌的發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌ATCC22023和枯草芽孢桿菌均有明顯的抑菌圈，說明所得重組釀酒酵母菌成功分泌出抗菌肽。實施例3含酸性蛋白酶基因、天冬氨酸蛋白酶基因以及抗菌肽基因的多基因共表達載體的構(gòu)建本實施例構(gòu)建釀酒酵母多基因共表達載體的方法同實施例1，除了將連入載體中的中性蛋白酶基因替換為黃曲酶(Aspergillusflavus)的天冬氨酸蛋白酶基因(堿基序列如SEQIDNO：3所示，參考Genbank上公布基因序列NCBI:XM_002375471.經(jīng)密碼子優(yōu)化、化學合成獲得)外，其他均與實施例1相同，本實施例構(gòu)建的釀酒酵母多基因共表達載體命名為pTEGC-ap-atp-amp。實施例4含酸性蛋白酶基因、絲氨酸蛋白酶基因以及抗菌肽基因的多基因共表達載體的構(gòu)建本實施例構(gòu)建釀酒酵母多基因共表達載體的方法同實施例1，除了將連入載體中的中性蛋白酶基因替換為米曲霉(Aspergillusoryzae)的絲氨酸蛋白酶基因(堿基序列如SEQIDNO：4所示，參考Genbank上公布基因序列NCBI:XM_001821085.2.經(jīng)密碼子優(yōu)化、化學合成獲得)外，其他均與實施例1相同，本實施例構(gòu)建的釀酒酵母多基因共表達載體命名為pTEGC-ap-sp-amp。實施例5含天冬氨酸蛋白酶基因、絲氨酸蛋白酶基因以及抗菌肽基因的多基因共表達載體的構(gòu)建本實施例構(gòu)建釀酒酵母多基因共表達載體的方法同實施例1，除了將連入載體中的酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因替換為黃曲酶(Aspergillusflavus)的天冬氨酸蛋白酶基因(堿基序列如SEQIDNO：3所示，參考Genbank上公布基因序列NCBI:XM_002375471.經(jīng)密碼子優(yōu)化、化學合成獲得)和米曲霉(Aspergillusoryzae)的絲氨酸蛋白酶基因(堿基序列如SEQIDNO：4所示，參考Genbank上公布基因序列NCBI:XM_001821085.2.經(jīng)密碼子優(yōu)化、化學合成獲得)外，其他均與實施例1相同，本實施例構(gòu)建的釀酒酵母多基因共表達載體命名為pTEGC-atp-sp-amp。實施例6一種重組釀酒酵母的構(gòu)建將實施例3構(gòu)建的釀酒酵母多基因共表達載體pTEGC-ap-atp-amp用限制性內(nèi)切酶線性化，采用醋酸鋰介導的電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，在G418濃度為300μg/ml的YPD平板上培養(yǎng)48h以上，挑取長出的單菌落為轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR驗證后的轉(zhuǎn)化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液體培養(yǎng)基中篩選，獲得陽性單克隆菌落，測序驗證，獲得正確連接的陽性重組酵母轉(zhuǎn)化子，即可。實施例7一種重組釀酒酵母的構(gòu)建將實施例4構(gòu)建的釀酒酵母多基因共表達載體pTEGC-ap-sp-amp用限制性內(nèi)切酶線性化，采用醋酸鋰介導的電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，在G418濃度為300μg/ml的YPD平板上培養(yǎng)48h以上，挑取長出的單菌落為轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR驗證后的轉(zhuǎn)化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液體培養(yǎng)基中篩選，獲得陽性單克隆菌落，測序驗證，獲得正確連接的陽性重組酵母轉(zhuǎn)化子，即可。實施例8一種重組釀酒酵母的構(gòu)建將實施例5構(gòu)建的釀酒酵母多基因共表達載體體pTEGC-atp-sp-amp用限制性內(nèi)切酶線性化，采用醋酸鋰介導的電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，在G418濃度為300μg/ml的YPD平板上培養(yǎng)48h以上，挑取長出的單菌落為轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR驗證后的轉(zhuǎn)化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液體培養(yǎng)基中篩選，獲得陽性單克隆菌落，測序驗證，獲得正確連接的陽性重組酵母轉(zhuǎn)化子，即可。實施例9抗菌肽突變體與原抗菌肽的抗菌性能對比通過生物公司合成小棘蛙Ranaexilispinosa的抗菌肽Esculentin-1RE1與及其突變體Es-1RE1-T(其堿基序列如SEQIDNO：5所示)。以沙門氏菌CMCC50071、大腸桿菌CICC10899和金黃色葡萄球菌ATCC22023作為指示菌，檢測抗菌肽Esculentin-1RE1突變前后對上述指示菌的最小抑菌濃度(MIC)。檢測結(jié)果如表7所示，本發(fā)明采用的小棘蛙抗菌肽突變體Es-1RE1-T的抗菌性能(MIC指標)均優(yōu)于未突變的抗菌肽。表7抗菌肽抗菌性能對比表下面對上述不同實施例制備的重組釀酒酵母作進一步的性能檢測一、重組釀酒酵母抑菌活性的檢測以抑菌活性檢測為例實驗方法：將革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌ATCC22023、革蘭氏陰性菌大腸桿菌CICC10899作為受試菌，經(jīng)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至在OD600nm＝0.4-1，適當稀釋、混勻、均勻涂布至MH培養(yǎng)基平板中(培養(yǎng)基配方為：5g/l牛肉膏浸粉、17.5g/l酪素水解物、1.5g/l淀粉、瓊脂粉20g/l)。分別取等量的活化后的實施例2、6、7、8構(gòu)建的重組釀酒酵母菌和未經(jīng)改造的原始宿主釀酒酵母菌的發(fā)酵液上清，牛津杯中，以滅菌水為陰性對照，以氨芐青霉素(1.5μg)為陽性對照，在37℃培養(yǎng)16-18h，觀察抑菌圈情況。實驗結(jié)果：檢測結(jié)果如表8所示，從中可以看出，實施例2構(gòu)建的重組釀酒酵母菌的發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌ATCC22023和大腸桿菌CICC10899的抑菌圈最為明顯，抑菌活性最強，實施例6-8構(gòu)建的重組釀酒酵母對金黃色葡萄球菌ATCC22023和大腸桿菌CICC10899均有抑菌效果(抑菌圈大小)，但略低于實施例2的。表8不同實施例的重組釀酒酵母菌抑菌統(tǒng)計表注：牛津杯外徑外8mm，實際抑菌圈大小為d-8，mm。二、重組釀酒酵母蛋白酶活性的檢測實驗方法：挑選各實施例中利用干酪素篩選的水解圈最大的單克隆，分別取等量的活化后的實施例2、6、7、8構(gòu)建的重組釀酒酵母菌和未經(jīng)改造的原始宿主釀酒酵母菌，分別接入誘導底物含2％干酪素的YPD液體培養(yǎng)基中，各組培養(yǎng)基用量相等，在30℃、220rpm條件下振蕩培養(yǎng)至72h，每隔24h補充適量葡萄糖等碳源，吸取上清液進行蛋白酶酶活測定。參考國標“蛋白酶制劑”(GB/T23527-2009)中的福林酚法的在pH6.5，溫度為40℃進行總蛋白酶酶活的測定。參考國標GB/T22492-2008“大豆肽粉”提取并測定酸溶蛋白(小肽和氨基酸)含量，指示重組菌對蛋白質(zhì)的降解效果。實驗結(jié)果：檢測結(jié)果如表9，從中可以看出，實施例2構(gòu)建重組釀酒酵母蛋白酶活最高，達到35U/ml；降解蛋白質(zhì)的能力最佳，其培養(yǎng)基中的酸溶蛋白含量最高，達到15.6g/100ml。而實施例6～8構(gòu)建的重組釀酒酵母菌總蛋白酶酶活約為實施例2的一半。其培養(yǎng)基中酸溶蛋白含量在7-8g/100ml，明顯低于實施例2的重組釀酒酵母。。而宿主釀酒酵母只有內(nèi)源性蛋白酶酶活，約為4.3U/ml，其酸溶蛋白含量與培養(yǎng)基接近，基本不能降解蛋白。上述結(jié)果說明實施例2構(gòu)建重組釀酒酵母菌具有很好的酸性蛋白酶、中性蛋白酶活性，即在重組釀酒酵母菌中將酸性蛋白酶、中性蛋白酶和抗菌肽進行共同表達時，重組釀酒酵母菌具有最好的蛋白酶活性。表9重組釀酒酵母液體發(fā)酵降解蛋白(干酪素)組別蛋白酶酶活(U/ml)酸溶蛋白含量(g/100ml)培養(yǎng)基‐5.4宿主釀酒酵母4.35.8實施例2重組釀酒酵母3515.6實施例6重組釀酒酵母138.8實施例7重組釀酒酵母187.2實施例8重組釀酒酵母167.3三、不同重組釀酒酵母進行高蛋白固態(tài)發(fā)酵的效果檢測實驗方法：分別取等量的活化后的實施例2、6、7、8構(gòu)建的重組釀酒酵母菌和未經(jīng)改造的原始宿主釀酒酵母菌進行生料的固態(tài)發(fā)酵，生產(chǎn)酵母培養(yǎng)物，配方如下：豆粕(大豆分離蛋白)40g，麩皮10g，紅糖10g，谷殼5g，料水比為1:1。GB/T6432-1994“飼料中粗蛋白測定”的凱氏定氮法測定粗蛋白含量；參考國標GB/T22492-2008“大豆肽粉”提取并測定酸溶蛋白含量；參考GB/T13093-2006“飼料中細菌總數(shù)的測定”檢測細菌數(shù)及酵母活菌數(shù)。實驗結(jié)果：檢測結(jié)果如表10所示，從中可以看出，實施例2重組釀酒酵母發(fā)酵含高蛋白物料的培養(yǎng)基后，酵母活菌數(shù)最高，粗蛋白增加量更多，酸溶蛋白含量更高，且表達了抗菌肽基因的重組菌的酵母培養(yǎng)物中雜菌(芽孢類)少；而實施例6-7的重組釀酒酵母固態(tài)發(fā)酵后產(chǎn)品酵母活菌數(shù)、粗蛋白以及酸溶蛋白等含量比宿主酵母菌的高，但均低于實施例2的，且雜菌數(shù)也略高于實施例2的。由此可知，實施例2構(gòu)建的重組釀酒酵母的固態(tài)發(fā)酵效果最好。表10不同重組釀酒酵母固態(tài)發(fā)酵48h結(jié)果四、不同重組釀酒酵母對餐廚廢棄物進行發(fā)酵的效果檢測實驗方法：分別取等量的活化后的實施例2、6、7、8構(gòu)建的重組釀酒酵母菌和未經(jīng)改造的原始宿主釀酒酵母菌對未滅菌的1天內(nèi)的餐廚廢棄物進行液體發(fā)酵，分解利用其有機物，并轉(zhuǎn)化為酵母蛋白以及乙醇等有益物質(zhì)，發(fā)酵培養(yǎng)基如下：餐廚廢棄物75g，葡萄糖10g，胰蛋白胨5g，料水比為1:1，調(diào)節(jié)pH至6.0。發(fā)酵72h，測定其產(chǎn)物濕重下各參數(shù)。實驗結(jié)果：檢測結(jié)果如表11所示，從中可以看出，實施例2重組釀酒酵母對餐廚廢棄物發(fā)酵中，菌酵母活菌數(shù)更高，粗蛋白增加量更多，酸溶蛋白含量更高，且表達了抗菌肽基因的重組菌的酵母培養(yǎng)物中雜菌(芽孢類)比其他未表達抗菌肽的重組菌的少一個數(shù)量級，重組菌的實驗組的酵母菌數(shù)更多，雜菌更少，因而乙醇濃度相應的更高；實施例6-7的重組釀酒酵母發(fā)酵餐廚廢棄物后其酵母活菌數(shù)、粗蛋白增量、酸溶蛋白增量均優(yōu)于宿主釀酒酵母，比實施例2的低，雜菌數(shù)也較高。表11不同重組釀酒酵母發(fā)酵餐廚廢棄物60h后的檢測結(jié)果上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>廣州格拉姆生物科技有限公司<120>一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的益生重組釀酒酵母<130><160>46<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1140<212>DNA<213>人工序列<400>1catgggcccgctgctctccgcaaagcataccggaagtacggaatagctcccagcagtttc60aacatcgatctggcagactttaaacccattacgacaacccatgctgctgctgggagcgag120attgcagagcctgatcagactggcgctgtcagtgctacttccgtcgagaacgatgccgag180ttcgtttcgcctgttcttattggcggccagaagatcgtcatgacatttgacactggttct240tctgacttttgggtgttcgatacgaatctcaatgaaaccttgacgggacacacggagtac300aacccttcgaactcctcgaccttcaagaagatggacggatacaccttcgatgtctcgtat360ggtgacgactcgtacgcctctggccccgtcggaacggataccgtcaacattggcggcgcc420attgtcaaggagcaagccttcggtgtccccgaccaggtatcccagtcgttcatcgaggac480acgaactccaacggcctggtcgggttgggcttttcctccatcaacaccatcaaaccggag540gcgcaagacacgttcttcgccaatgtcgcaccaagtctggacgagcccgtcatgaccgcc600tcgctcaaggctgacggagtgggcgagtacgagttcggcacgatcgacaaagacaagtac660cagggcaacattgccaacatcagcgtggactcatcgaacggatactggcagttctccact720cccaagtactccgtggcagacggagagctgaaggacattggaagcttgaacacctcgatc780gcggacaccggtacctcccttatgctgctggatgaagacgtggttactgcctactatgcg840caagttcccaactcggtctacgtgagcagtgccggtggttacatctacccctgcaacacc900actcttcccagcttctcgcttgtcctcggcgagtcgagcctggccacgatccccggtaac960ctgatcaatttctccaaggttggcaccaacaccaccaccggacaggccttgtgctttggc1020ggcattcaatccaacggaaacacctcgctgcagattctgggcgatattttcctgaaggcc1080tttttcgttgtcttcgacatgcgcggcccctcgcttggtgttgcctctcccaagaactag1140<210>2<211>1059<212>DNA<213>人工序列<400>2atgagagttactactttgtctactgctttgttcgctttgacttctactgctgtttctgct60ccaactgctggttcttcttctccaggtttggaagttaagttgactcaaatcgacaacact120agagttaaggctgttgttaagaacactggttctgaagaagtttctttcgttcacttgaac180ttcttcaaggacgctggtccagttaagaaggtttctgtttacagaggtcaagacgaagtt240caattcgaaggtatcaagagaagattgagatcttctggtatcactaaggaagctgttact300tctttgggtgctggtgaaactttggaagacgaattcgacatcgcttctacttctgacttg360gcttctggtggtccagtttctatcagatctcacggtttcgttccaatcgttgttgacggt420aagatcactggttacatcccatacaagtctaacgacttgactgttaatgttgacggtggt480aaggctgctaaggttactaaggctttgtctcaattgactagaagaactgaagttactgac540tgtaagggtgacgctgaatcttctttgactactgctttgtctaacgctgctaagttggct600aaccaagctgctgaagctgctgaatctggtgacgaatctaagttcgaagaatacttcaag660actactgaccaacaaactagaactactgttgctgaaagattgagagctgttgctaaggaa720gctggttctacttctggtggttctactacttaccactgtaacgacccatacggttactgt780gaaccaaacgttttggcttacactttgccatctaagaacgaaatcgctaactgtgacatc840tactactctgaattgccaccattggctcaaaagtgtcacgctcaagaccaagctactact900actttgcacgaattcactcacgctccaggtgtttaccaaccaggtactgaagacttgggt960tacggttacgacgctgctactcaattgtctgctcaagacgctttgaacaacgctgactct1020tacgctttgtacgctaacgctatcgaattgaagtgttaa1059<210>3<211>1059<212>DNA<213>人工序列<400>3atgagagttactactttgtctactgctttgttcgctttgacttctactgctgtttctgct60ccaactgctggttcttcttctccaggtttggaagttaagttgactcaaatcgacaacact120agagttaaggctgttgttaagaacactggttctgaagaagtttctttcgttcacttgaac180ttcttcaaggacgctggtccagttaagaaggtttctgtttacagaggtcaagacgaagtt240caattcgaaggtatcaagagaagattgagatcttctggtatcactaaggaagctgttact300tctttgggtgctggtgaaactttggaagacgaattcgacatcgcttctacttctgacttg360gcttctggtggtccagtttctatcagatctcacggtttcgttccaatcgttgttgacggt420aagatcactggttacatcccatacaagtctaacgacttgactgttaatgttgacggtggt480aaggctgctaaggttactaaggctttgtctcaattgactagaagaactgaagttactgac540tgtaagggtgacgctgaatcttctttgactactgctttgtctaacgctgctaagttggct600aaccaagctgctgaagctgctgaatctggtgacgaatctaagttcgaagaatacttcaag660actactgaccaacaaactagaactactgttgctgaaagattgagagctgttgctaaggaa720gctggttctacttctggtggttctactacttaccactgtaacgacccatacggttactgt780gaaccaaacgttttggcttacactttgccatctaagaacgaaatcgctaactgtgacatc840tactactctgaattgccaccattggctcaaaagtgtcacgctcaagaccaagctactact900actttgcacgaattcactcacgctccaggtgtttaccaaccaggtactgaagacttgggt960tacggttacgacgctgctactcaattgtctgctcaagacgctttgaacaacgctgactct1020tacgctttgtacgctaacgctatcgaattgaagtgttaa1059<210>4<211>741<212>DNA<213>人工序列<400>4atgatgaaggacactttgtctttcgctagattggctttgttgttgttcggtttcgttgtt60atcccaactcaagctatcgttggtggtatcgctactactaactctatctctatcggtgct120gtttacactcaaggtttgttcggttctcaatacgcttgtgctggtactttcgtttcttct180aacaagttcttgactgctgctgactgtgttttgggtcactctccaagagacatctctatc240aagtggggtgcttctaacagattgaacgaaccatctt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