1.一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體,其特征在于:該載體中含有蛋白酶基因、抗菌肽基因;
所述抗菌肽基因的堿基序列如SEQ ID NO:5所示;
所述蛋白酶基因選自酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因、天冬氨酸蛋白酶基因、絲氨酸蛋白酶基因中的至少一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體,其特征在于:所述酸性蛋白酶基因的堿基序列如SEQ ID NO:1所示,所述中性蛋白酶基因的堿基序列如SEQ ID NO:2所示,所述天冬氨酸蛋白酶基因的堿基序列如SEQ ID NO:3所示,所述絲氨酸蛋白酶基因的堿基序列如SEQ ID NO:4所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體,其特征在于:所述蛋白酶基因為酸性蛋白酶基因和中性蛋白酶基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體,其特征在于:所述蛋白酶基因、抗菌肽基因上游均存在α-信號肽基因序列,α-信號肽基因的堿基序列如SEQ ID NO:6所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4任所述的一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體,其特征在于:所述蛋白酶基因基因的啟動子選自pgk1-1、pgk1-2,終止子選自pgkt1-1、pgkt1-2;所述抗菌肽基因的啟動子為pgk1-3,終止子為pgkt1-3;
所述pgk1-1的堿基序列如SEQ ID NO:7所示;
所述pgkt1-1的堿基序列如SEQ ID NO:8所示;
所述pgk1-2的堿基序列如SEQ ID NO:9所示;
所述pgkt1-2的堿基序列如SEQ ID NO:10所示;
所述pgk1-3,的堿基序列如SEQ ID NO:11所示;
所述pgkt1-3的堿基序列如SEQ ID NO:12所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~4任所述的一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體,其特征在于:所述載體的骨架為pGAPZaA質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~4任所述的一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體,其特征在于:該載體中含有釀酒酵母菌的25s rDNA基因片段,其堿基序列如SEQ ID NO:14所示。
8.一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的益生重組釀酒酵母,其特征在于,該重組釀酒酵母基因組中插入有權(quán)利要求1~7任一所述的多基因共表達載體。
9.權(quán)利要求1~7任一所述一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體的構(gòu)建方法,其特征在于:包括以下步驟:
S1 整合表達載體pTEGC-BsmBI構(gòu)建:
S1.1 將G418抗性基因連入pGAPZaA質(zhì)粒載體的多克隆位點Msc I和EcoR V之間,獲得載體pGAPZaA-G418;
S1.2 將堿基序列如SEQ ID NO:14所示的rDNA基因序列的連入載體pGAPZaA-G418多克隆位點BamHI和EcoRI之間,獲得載體pGAPZaA-G418-rDNA;
S1.3 將載體pGAPZaA-G418-rDNA經(jīng)Bgl II和EcoRI雙酶切后,回收大片段產(chǎn)物,得到線性化載體pTEGC,將堿基序列如SEQ ID NO:15所示的BsmBI-2片段與線性化載體pTEGC連接,得整合表達載體pTEGC-BsmBI;
S2 啟動子、終止子的擴增
S2.1啟動子的擴增:以釀酒酵母基因組DNA為模板,分別用引物對PGK1F1-BsmBI和PGK1R1-BsmBI、PGK1F2-BsmBI和PGK1R2-BsmBI、PGK1F3-BsmBI和PGK1R3-BsmBI分別擴增出pgk1-1、pgk1-2、pgk1-3啟動子片段;
S2.2終止子的擴增:以釀酒酵母基因組DNA為模板,分別用引物對PGKT1F1-BsmBI和PGKT1R1-BsmBI、PGKT1F2-BsmBI和PGKT1R2-BsmBI、PGKT1F3-BsmBI和PGKT1R3-BsmBI分別擴增出pgkt1-1、pgkt1-2、pgkt1-3終止子片段;
S3 α-信號肽基因、酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因、抗菌肽基因的獲得
S3.1 α-信號肽-酸性蛋白酶基因的獲得:分別以含α-信號肽基因序列的T載體、含酸性蛋白酶基因基因序列的T載體為模板,通過引物MfaF1-BsmBI 、Mfa-apR 、Mfa-apF以及apR-BsmBI進行重疊延伸PCR將α-信號肽基因序列定向連入酸性蛋白酶基因基因的5’端,擴增出mfa-ap基因片段,即含有α-信號肽基因序列和酸性蛋白酶基因序列的片段;
S3.2中性蛋白酶基因的獲得:以含中性蛋白酶基因的T載體為模板,用引物npF-BsmBI以及npR-BsmBI進行擴增,獲得含有IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI的識別和切割位點的np基因片段;
S3.3 α-信號肽-抗菌肽基因的獲得:分別以含α-信號肽基因序列的T載體、含抗菌肽的T載體為模板,通過引物MfaF3-BsmBI、Mfa-ampF、Mfa-ampR以及Mfa-ampR-BsmBI進行重疊延伸PCR將α-信號肽序列定向連入無信號肽的抗菌肽基因的5’端,擴增出mfa-amp基因片段,即含有α-信號肽基因序列和抗菌肽基因序列的片段;
S4 釀酒酵母多基因共表達載體的構(gòu)建
將上述獲得的酸性蛋白酶基因表達盒元件pgk1-1、mfa-ap、pgkt1-1;中性蛋白酶基因表達盒元件pgk1-2、np、pgkt1-2;抗菌肽基因表達盒元件pgk1-3、mfa-amp、pgkt1-3利用IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI進行酶切,純化回收;同時,利用IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI切割上述整合表達載體pTEGC-BsmBI,將其線性化;將所用這些片段通過一步法定向連入線性化的整合表達載體pTEGC-BsmBI中,即得釀酒酵母多基因共表達載體;
上述所述引物的堿基序列如下:
PGK1F1-BsmBI:CGTCTCAgatc GAAGTACCTTCAAAG
PGK1R1-BsmBI:CGTCTCGgctaTATATTTGTTGTAAA
PGK1F2-BsmBI:CGTCTCAgtcaGAAGTACCTTCAAAG
PGK1R2-BsmBI:CGTCTCGgcatTATATTTGTTGTAAA
PGK1F3-BsmBI:CGTCTCAtgcaGAAGTACCTTCAAAG
PGK1R3-BsmBI:CGTCTCGtcgaTATATTTGTTGTAAA
PGKT1F1-BsmBI:CGTCTCAtgtacGATCTCCCATCGTCTCTACT
PGKT1R1-BsmBI:CGTCTCGgtcaAAGCTTTTTCGAAACGCAG
PGKT1F2-BsmBI:CGTCTCAtacgGATCTCCCATCGTCTCTACT
PGKT1R2-BsmBI:CGTCTCGtgcaAAGCTTTTTCGAAACGCAG
PGKT1F3-BsmBI:CGTCTCAatcgGATCTCCCATCGTCTCTACT
PGKT1R3-BsmBI: CGTCTCGagtcAAGCTTTTTCGAAACGCAG
MfaF1-BsmBI:CGTCTCAgctaATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC
Mfa- apR:AGAGCAGCGGGCCCATGTCTTTTCTCGAGA
Mfa-apF :TCTCGAGAAAAGACATGGGCCCGCTGCTCT
apR-BsmBI:CGTCTCAatagCTAGTTCTTGGGAGAGGCA
npF-BsmBI:CGTCTCAgtcaATGAGAGTTACTACTTTGTCTACTG
npR-BsmBI CGTCTCAagctT TTAACACTTCAATTCGATAGCGT
MfaF3-BsmBI:CGTCTCAtcga ATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC
Mfa-ampR:ACTTAGAGAAGATACCTCTTTTCTCGAGAGA
Mfa-ampF:TCTCTCGAGAAAAGAGGTATCTTCTCTAAGT
Mfa-ampR-BsmBI:CGTCTCAtagcTCTGTTGTTTTGCCAAGAGGT。
10.一種能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的益生重組釀酒酵母的構(gòu)建方法,其特征在于,將權(quán)利要求9構(gòu)建的釀酒酵母多基因共表達載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母宿主,篩選出陽性單克隆菌落,并測序驗證正確,即得能輔助降解蛋白質(zhì)并分泌抗菌肽的益生重組釀酒酵母。