專(zhuān)利名稱(chēng)：人源抗戊肝病毒基因工程抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防和治療用人源基因工程抗體的制備及應(yīng)用，尤其是特異性針對(duì)戊肝病毒保護(hù)性抗原ORF2蛋白的基因工程抗體。
自1975年B淋巴細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，單克隆抗體作為一類(lèi)用于基礎(chǔ)研究，實(shí)驗(yàn)室診斷，臨床治療和預(yù)防的新型產(chǎn)物，其運(yùn)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景已獲得普遍的肯定。分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)的研究發(fā)展導(dǎo)致了基因工程抗體的產(chǎn)生和發(fā)展。通過(guò)抗體分子基因水平的重組可獲得多種多樣的特異性鼠源及人源抗體，使對(duì)單克隆抗體的研究有了突破性進(jìn)展并越來(lái)越顯示出其重要意義及實(shí)際運(yùn)用前景80年代末90年代初興起的噬菌體抗體基因庫(kù)技術(shù)興起和整個(gè)基因工程抗體技術(shù)研究領(lǐng)域的發(fā)展，使當(dāng)今世界人源或基因工程抗體的開(kāi)發(fā)研究取得很大進(jìn)展并已由基礎(chǔ)研究階段步入實(shí)質(zhì)性應(yīng)用研究和開(kāi)發(fā)階段。目前美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市或待批的生物制品中，各種形式的單克隆抗體和基因工程抗體占到一定比例，目前以批準(zhǔn)上市的67種生物制品中，治療和預(yù)防用單克隆抗體和基因工程抗體共有9種。正在待批中等抗體有54種。其中已批準(zhǔn)上市并且產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益的四種人源化基因工程抗體中，其中有一種即為抗病毒基因工程抗體，其商品名為“SynagisTM″，為人源化抗呼吸道合病毒(RSV)基因工程抗體。
至今為止，大多數(shù)病毒性疾病無(wú)特異性治療藥物。戊肝病毒的主要傳播途徑是糞-口傳播，已報(bào)道的爆發(fā)流行中主要由飲用水污染造成。在流行地區(qū)，對(duì)戊肝的預(yù)防首要的是提供潔凈的飲用水，而疫苗預(yù)防是最終控制發(fā)展中國(guó)家戊型肝炎流行的重要措施。美國(guó)、印度和中國(guó)已有關(guān)于戊型肝炎病毒重組蛋白疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的報(bào)道，但結(jié)果并不一致，因此在戊型肝炎的預(yù)防和治療方面，特別是爆發(fā)流行時(shí)，被動(dòng)免疫的作用也是值得重視的。根據(jù)對(duì)疫區(qū)的研究報(bào)道，僅靠自然免疫產(chǎn)生的抗體起到的保護(hù)作用是不完全的。最近的研究表明，在爆發(fā)流行中對(duì)孕婦進(jìn)行免疫球蛋白治療可有效減少感染病毒的數(shù)量，但急性感染病例仍不能得到控制。另?yè)?jù)報(bào)道，來(lái)自于黑猩猩的針對(duì)ORF2蛋白的單克隆抗體在對(duì)恒河猴的病毒攻擊實(shí)驗(yàn)中起到了一定保護(hù)作用。因此，對(duì)人源抗戊型肝炎病毒抗體的研究不僅對(duì)疾病的預(yù)防和治療有一定的作用，而且對(duì)進(jìn)一步研究病毒在體內(nèi)的致病機(jī)制提供了有利的工具。用純鼠源單克隆抗體預(yù)防和治療病毒性疾病在國(guó)際上尚無(wú)任何批準(zhǔn)的先例，鼠源抗體人用最大的不利之處為異源蛋白，在人體內(nèi)易引起遺傳免疫排斥而使抗體失效并引起免疫性疾病。因此，特異性抗病毒人源抗體是病毒性疾病預(yù)防和治療的最有前景的生物制品之一。人源抗病毒基因工程抗體的研究除已成功的抗RSV抗體外，通過(guò)噬菌體表面呈現(xiàn)系統(tǒng)，基因工程抗體庫(kù)技術(shù)和分子生物學(xué)手段的聯(lián)合運(yùn)用，這一領(lǐng)域的研究已取得重大進(jìn)展。
本發(fā)明的目的是通過(guò)基因工程手段和噬菌體表面表達(dá)技術(shù)結(jié)合運(yùn)用，直接從人抗體基因庫(kù)中篩選出抗戊肝病毒的基因工程單克隆抗體，獲得其抗體基因，為將來(lái)可能的臨床抗病毒預(yù)防和治療提供可行性的特異性抗體藥物。
本發(fā)明陳述的人源抗戊肝病毒基因工程抗體包括1、人源抗戊肝病毒基因工程抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，包括Fab抗體基因、基因產(chǎn)物及其應(yīng)用。其主要特征在于此重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的并在原核和真核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合戊肝病毒的功能性抗體。
2、人源抗戊肝病毒基因工程抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，其主要特征在于抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補(bǔ)區(qū)域CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列決定的，其相應(yīng)的氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，是人源抗戊肝病毒基因工程抗體可變區(qū)核苷酸和氨基酸序列。
3、人源抗戊肝病毒基因工程抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，其主要基因特征在于特異性的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因來(lái)源于對(duì)人源抗戊肝病毒抗體基因庫(kù)的特異性富積篩選表達(dá)，其輕鏈(VL)和重鏈(VH)各自相應(yīng)的三個(gè)CDR區(qū)序列為本抗體特有的全新序列。重鏈(VH)三個(gè)CDR區(qū)的氨基酸序列包括HEV-Fab-216CDR1為SSAMS；CDR2為T(mén)ISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPFSGYDYVWGSYGYFDY。HEV-Fab-315CDR1為SSAMS；CDR2為T(mén)ISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPLVDMITLGGVWLFDY。HEV-Fab-319CDR1為SSAMS；CDR2為T(mén)ISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPFSGYDTLGGSYGY。HEV-Fab-328CDR1為SSAMS；CDR2為T(mén)ISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPFSGYDTFGGVWLFDY。HEV-Fab-404CDR1為SSAMS；CDR2為T(mén)ISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPFSGYDTFGGVWLFDY。
輕鏈(VL)三個(gè)CDR區(qū)的氨基酸序列包括HEV-Fab-216CDR1為T(mén)GGSSNIGSSYHVH；CDR2為ADTRRPS；CDR3為QTYDSDLGGSV。HEV-Fab-315CDR1為T(mén)GGSSNIGSSYHVH；CDR2為DTRRPS；CDR3為QTYDSDLGGSV。HEV-Fab-319CDR1為AGSSSNIGAAYDVH，CDR2為SNSNRPS；CDR3為QSYDRSLNGVV。HEV-Fab-328CDR1為T(mén)GGSSNIGSSYHVH；CDR2為ADTRRPS；CDR3為QTYDSDLGGSV。HEV-Fab-404CDR1為AGSSSNIGAAYDVH；CDR2為SNSNRPS；CDR3為QSYDRSLNGVV。
4、人源抗戊肝病毒基因工程抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404 Fab抗體，其特征在于為一種在原核細(xì)胞中獲得穩(wěn)定有效表達(dá)的基因重組的人源抗戊肝病毒ORF2蛋白基因工程Fab抗體，由重鏈Fd和lamda鏈組成。
5、人源抗戊肝病毒基因工程抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，其主要功能特征在于特異性識(shí)別戊肝病毒中和抗原ORF2蛋白，應(yīng)具有抗戊肝病毒感染的中和活性功能。
6、人源抗戊肝病毒基因工程抗體的用途，其特征在于利用上述獲得的抗體可變區(qū)，F(xiàn)ab或全抗體基因，可以在原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真核細(xì)胞及任何重組病毒系統(tǒng)中表達(dá)和生產(chǎn)此抗體基因或以此為基礎(chǔ)改建后的含有此抗體基因任何其他基因，獲得具有中和戊肝病毒感染的抗體產(chǎn)物，其基因表達(dá)產(chǎn)物可望在臨床上用于預(yù)防和治療由戊肝病毒引起的戊型肝炎。
7、人源抗戊肝病毒基因工程抗體基因的用途，其特征在于根據(jù)抗戊肝病毒中和抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404的可變區(qū)中的CDR區(qū)特異性核苷酸或氨基酸序列，可在體外人工合成與此相同的抗體輕重鏈CDR區(qū)的核苷酸序列或編碼相同氨基酸的核苷酸序列，從而獲得相同的抗體基因或用于相關(guān)基因的改造，而獲得抗戊肝病毒ORF2的中和抗體或相關(guān)蛋白或多肽產(chǎn)物。
傳統(tǒng)的利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)獲得人源單克隆抗體相當(dāng)困難，而且建立的細(xì)胞系通常不穩(wěn)定，基因易丟失。本發(fā)明陳述的人源抗戊肝病毒基因工程抗體，是在獲得抗體基因的基礎(chǔ)上獲得基因產(chǎn)物的表達(dá)，此抗體基因可隨著質(zhì)粒DNA在細(xì)菌內(nèi)的復(fù)制而穩(wěn)定復(fù)制，并可根據(jù)不同需要任意改建抗體基因，從而獲得一種可行性的臨床治療用抗體制劑。
以下的優(yōu)先實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容在這些實(shí)施例中，為說(shuō)明本發(fā)明，采用噬菌體表達(dá)載體為pComb3(Barbas C.III et al，Proc.Natl.Acas.Sci USA 1991，8910164-10168)。所用主要菌株為商品化產(chǎn)品XLI-Blu(美國(guó)Strategene公司)。所用噬菌體為VCSM13(美國(guó)Invitrogene公司)。
實(shí)施例1-5為人源抗戊肝病毒基因工程抗體的篩選制備方法；實(shí)施例7為人源抗戊肝病毒基因工程抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404的基因特征；實(shí)例7-8為人源抗戊肝病毒基因工程抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404的特異性蛋白結(jié)合及功能特征。
實(shí)例1，人源IgG Fab段基因的PCR擴(kuò)增用淋巴細(xì)胞分離液從免疫后經(jīng)檢測(cè)抗體滴度達(dá)到保護(hù)水平的人體外周抗凝血中分離淋巴細(xì)胞，用Tril-Zon(美國(guó)Gibco，BRL)提取總細(xì)胞RNA，用Olig-dT引物將提取的RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Gibco，BRL)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用一組特異性IgGFabGamma鏈、Kampa鏈及Lamda鏈引物，對(duì)人源輕鏈和重鏈Fab基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為94℃1分鐘，54℃1分鐘、72℃2分鐘，35個(gè)循環(huán)(PE 4800)，上述PCR產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，經(jīng)過(guò)DNA純化試劑盒QIAquickTMkit(德國(guó)QIAGEN公司)純化后，獲得650-700bp左右的Kamba、Lamda和Fd鏈PCR產(chǎn)物。
實(shí)例2，噬菌體抗體基因庫(kù)的建立將不同引物合成的Kamba和Lamda鏈PCR產(chǎn)物混合，將不同引物合成的Fd鏈混合，分別用SacI/XbaI和XhoI/SpeI克隆入噬菌體載體pComb3，將克隆入輕，重鏈基因的pComb3載體DNA連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，用10ul蒸溜水懸起，電轉(zhuǎn)導(dǎo)入事先制備好的200ul電轉(zhuǎn)菌XLI-Blu，(電轉(zhuǎn)條件為Bio-Red電轉(zhuǎn)儀，0.2cm電轉(zhuǎn)杯，2.5K伏)，電轉(zhuǎn)后加10mlSOC培養(yǎng)液，37℃1小時(shí)，加入10ml帶有氨芐青霉素和四環(huán)素的SB培養(yǎng)液(3)，37℃1小時(shí)，加入80-100ml前述SB，37℃ 2小時(shí)后加入輔助噬菌體M13GCM1 X10 12，1小時(shí)后加入卡那霉素(70ug/ml)，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。用4％PEG8000和3％NaCl沉淀噬菌體上清，經(jīng)9000rpm，20分鐘，4℃離心后，用2ml 0.02M PBS PH7.4重懸沉淀，建立噬菌體抗體庫(kù)，分裝保存于-20℃冰柜中。
實(shí)例3，用于抗體庫(kù)富集篩選的戊肝病毒抗原的制備所用抗原為原核表達(dá)并純化的HEVORF2蛋白，由本所肝炎室畢勝利老師惠贈(zèng)。濃度為2mg/ml。
實(shí)例4，噬菌體抗體庫(kù)的特異性富集篩選用0.1M NaHCO3(pH8.6)的溶液包被純化的戊肝病毒抗原(0.5-1μg/ml)，每孔55μl，4℃過(guò)夜；次日用1×PBST洗去未吸附的抗原，用4％的脫脂奶37℃封閉1小時(shí)，棄封閉液；每孔加入50μl噬菌體抗體庫(kù)，37℃孵育2小時(shí)，棄去孔中未結(jié)合的噬菌體，用1×TBST(50mMTris-HCl，150mM NaCl，0.5％Tween 20，pH7.5)洗液沖洗各孔，沖洗時(shí)，用帶有吸頭的移液器反復(fù)吹打，共洗10-20遍，以充分洗去未吸附的噬菌體；最后用ddH20洗兩遍，吸凈孔中的液體；每孔加入50μl Gly-HCl(pH2.2)的洗脫液，室溫孵育10分鐘。加入適量的2M Tris，以中和洗脫下來(lái)的噬菌體；將洗脫的噬菌體立即加入2ml新鮮制備的XLI-Blu菌液中(OD600＝1)，室溫孵育15-20分鐘；然后轉(zhuǎn)入250ml三角瓶中，加入SB10ml(氨芐青霉素20μg/ml，四環(huán)素10μg/ml)，立即取10μl涂氨芐青霉素平皿，以滴定噬菌體；三角瓶與37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，加入100mlSB(氨芐青霉素100μg/ml)，37℃1小時(shí)后，加入輔助噬菌體VCSM13 1ml，37℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)，加入卡那霉素(終濃度70μg/ml)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。如此反復(fù)篩選4-5次。
實(shí)例5，人IgGFab抗體可溶性表達(dá)產(chǎn)物的制備將帶有陽(yáng)性抗體輕重鏈基因插入的陽(yáng)性克隆擴(kuò)增后按常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA，用SpeI和NheI切除載體中的gIII，變FdgIII融合蛋白為獨(dú)立表達(dá)的蛋白，連接后轉(zhuǎn)化XLl-Blu菌，從過(guò)夜生長(zhǎng)的氨芐碟子中挑取單個(gè)菌落，接種SB或TB細(xì)菌培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)菌長(zhǎng)至OD600＝0.2-0.3，加入1m M IPTG，在30℃誘導(dǎo)表達(dá)10-12小時(shí)。收獲細(xì)菌，離心后加入原培養(yǎng)液1/10體積的PBS(0.02 M pH7.4)重懸，反復(fù)凍融三次，4℃10000rpm離心10分鐘，上清即為表達(dá)的Fab抗體。備用于進(jìn)一步的檢測(cè)和鑒定。陰性對(duì)照為載體pComb3轉(zhuǎn)化菌按同樣方法制備的細(xì)菌裂解液。
實(shí)例6人IgGFab抗體E216的可變區(qū)基因的核酸序列分析用Qiagen Miniprep Kit(美國(guó)Qiagen)制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行核酸序列分析。測(cè)序?yàn)樽詣?dòng)測(cè)序。至少3個(gè)克隆被用于確定同一相同的序列。所獲序列均用DNA Strider(美國(guó)微軟公司)序列分析軟件進(jìn)行分析處理，并比較Internet網(wǎng)絡(luò)上基因庫(kù)中的IgG序列。證實(shí)人源抗戊肝病毒基因工程Fab抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404基因由人IgGγ鏈Fd和λ鏈組成，其基因特征由VH和VL結(jié)構(gòu)域中的6個(gè)CDR區(qū)的特異性核甘酸序列和氨基酸構(gòu)成，序列比較資料如

圖1，是人源抗戊肝病毒基因工程抗體可變區(qū)氨基酸序列及分析比較。
實(shí)例7，從戊肝病毒免疫供體血液中分離淋巴細(xì)胞，用PCR技術(shù)擴(kuò)增了人源IgGFab抗體基因，建立了噬菌體抗體基因庫(kù)，用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)篩選并從富集篩選后獲得的Fab陽(yáng)性克隆中，最后選出5株陽(yáng)性克隆，F(xiàn)ab抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，來(lái)源于純化抗原的篩選。將表達(dá)的菌體細(xì)胞裂解上清同時(shí)檢測(cè)其對(duì)抗人Fab抗體的結(jié)合活性及對(duì)戊肝病毒純化抗原的抗原結(jié)合活性。ELISA結(jié)果表明獲得株單抗不僅被抗人IgGFab抗體所識(shí)別，同樣也識(shí)別結(jié)合上述純化戊肝病毒ORF2抗原，如說(shuō)明書(shū)附圖2所示，為ELISA檢測(cè)抗原結(jié)合活性結(jié)果。
實(shí)例8，間接免疫熒光(IFA)試驗(yàn)檢測(cè)將用于表達(dá)ORF2蛋白的桿狀病毒感染sf9細(xì)胞，27℃培養(yǎng)、96 hrs后，滴加至玻璃底片上，丙酮固定15min，加入Fab表達(dá)上清，37℃溫育30min，Tween/PBS沖洗，晾干，加入FITC標(biāo)記的抗人Fab抗體，37℃溫育30min，沖洗，晾干，伊文氏藍(lán)染色后熒光顯微鏡觀察結(jié)果(陰性對(duì)照為陰性血清對(duì)照)。結(jié)果顯示，感染96小時(shí)后的sf9細(xì)胞中觀察到熒光，如說(shuō)明書(shū)附圖3A所示，陰性血清對(duì)照未觀察到熒光，如說(shuō)明書(shū)附圖3B所示，說(shuō)明Fab抗體對(duì)戊肝病毒中和抗原ORF2蛋白的結(jié)合具有很高的特異性。
實(shí)例9，HEV-Fab-216輕鏈可變區(qū)核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列GAGCTCACGCAGCCGCCCTCAGTATCTGGGGCCCTAGGGCAGAGGGTGACCATCCCCTGCACTGGGGGCAGCE L T Q P P S V S G A L G Q R V T I P CT G G STCCAACATCGGCTCAAGTTATCACGTCCATTGGTATCGCCAACTTCCGGGAACAGCCCCCAGACTGCTCATTS N I G S S Y H V HW Y R Q L P G T A P R L L ICDR1TATGCTGACACCAGGCGACCCTCTGGGGTCCCTGGACGATTCTCTGCTTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCTCCYA D T R R P SG V P G R F S A S K S G T S A SCDR2CTGGCCATTACTGACCTCCAGGCTGGAGATGAGGCAGATTATTATTGCCAGACCTATGACTCCGATCTGGGTL A I T D L Q A G D E A D Y Y CQ T Y D S D L GCDR3GGCTCGGTGTTCGGCGGAGGGACCAGAGTGACAGTCTTAGGTG S VF G G G T R V T V L G實(shí)例10，HEV-Fab-216重鏈可變區(qū)核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列CTCGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGGCTCTGGATTCACCL E S G G G L V Q P G G S L R L S C A G S G F TTTTAGCAGCTCTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTAGTF SS S A M SW V R Q S P G K G L E W V ST I SCDR1GGTTTTGGTGGTAGCACATACTACACAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTACAAGG F G G S T Y Y T D S V K GR F T I S R D N Y KCDR2AACACCCTGTATCTGCAAATGAAGAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGTCCCCN T L Y L Q M K S L R A E D T A V Y Y C A KV PTTTAGTGGATATGATTACGTTTGGGGGAGTTATGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCF S G Y D Y V W G S Y G Y F D YW G Q G T L V TCDR3GTCTCCTCAV S S實(shí)例11，HEV-Fab-315輕鏈可變區(qū)核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列GAGCTCACGCAGCCGCCCTCAGTATCTGGGGCCCTAGGGCAGAGGGTGACCATCCCCTGCACTGGGGGCAGCE L T Q P P S V S G A L G Q R V T I PC T G G STCCAACATCGGCTCAAGTTATCACGTCCATTGGTATCGCCAACTTCCGGGAACAGCCCCCAGACTGCTCATTS N I G S S Y H V HW Y R Q L P G T A P R L L ICDR1TATGCTGACACCAGGCGACCCTCTGGGGTCCCTGGACGATTCTCTGCTTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCTCCY AD T R R P SG V P G R F S A S K S G T S A SCDR2CTGGCCATTACTGACCTCCAGGCTGGAGATGAGGCAGATTATTATTGCCAGACCTATGACTCCGATCTGGGTL A I T D L Q A G D E A D Y Y CQ T Y D S D L GCDR3GGCTCGGTGTTCGGCGGAGGGACCAGAGTGACAGTCTTAGGTG S VF G G G T R V T V L G實(shí)例12，HEV-Fab-315重鏈可變區(qū)核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列CTCGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGATACTCTCCTGTGCAGGCTCTGGATTCACCL E S G G G S V Q P G G S L I L S C A G S G F TTTTAGCAGCTCTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTAGTF SS S A M SW V R Q S P G K G L E W V ST I SCDR1GGTTTTGGTGGTAGCACATACTACACAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTACAAGG F G G S T Y Y T D S V K GR F T I S R D N Y KCDR2AACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGTCCCTN T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A KV PTTAGTGGATATGATTACGTTGGGGGGAGTATGGCTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCL V D M I T L G G V W L F D YW G Q G T L V T VCDR3實(shí)例13，HEV-Fab-319輕鏈可變區(qū)核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列GAGCTCACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGCGTCACCATCCCCTGCGCTGGGAGCAGCE L T Q P P S V S G A P G Q S V T I P CA G S STCCAATATCGGGGCAGCATATGATGTGCATTGGTACCAACAATTTCCAGGGACAGTCCCCAAACTCCTCATCS N I G A A Y D V HW Y Q Q F P G T V P K L L 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S G G G L V Q P G G S L I L S C A G S G F TTTTAGCAGCTCTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTAGTF SS S A M SW V R Q S P G K G L E W V ST I SCDR1GGTTTTGGTGGTAGCACATACTACACAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTACAAGG F G G S T Y Y T D S V K GR F T I S R D N Y KCDR2AACACTCTGTATCTGCAAATGAAGAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGTCCCCN T L Y L Q M K S L R A E D T A V Y Y C A KV PTTTAGTGGATATGATACGTTTGGGGGAGTATGGCTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCF S G Y D T F G G V W L F D YW G Q G T L V T VCDR3TCCTCAS S
權(quán)利要求
1.人源抗戊肝病毒基因工程抗體包括5株Fab抗體基因、基因產(chǎn)物及其應(yīng)用，分別命名為HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404。其主要特征在于這些重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的并在原核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合戊肝病毒中和抗原ORF2蛋白的功能性抗體。
2.人源抗戊肝病毒基因工程抗體其主要特征在于抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補(bǔ)區(qū)域(Complementarity-Determining Regions，CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列決定的，其相應(yīng)的氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，如摘要附圖。
3.人源抗戊肝病毒中和性基因工程抗體，其主要基因特征在于特異性的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因來(lái)源于對(duì)人源抗戊肝病毒抗體基因庫(kù)的特異性富積篩選表達(dá)，其輕鏈(VL)和重鏈各自相應(yīng)的三個(gè)CDR區(qū)序列為5株抗體特有的全新序列，均由重鏈Fd和Lambda鏈組成。其重鏈(VH)三個(gè)CDR區(qū)的氨基酸序列包括HEV-Fab-216CDR1為SSAMS；CDR2為T(mén)ISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPFSGYDYVWGSYGYFDY。HEV-Fab-315CDR1為SSAMS；CDR2為T(mén)ISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPLVDM。HEV-Fab-319CDR1為SSAMS；CDR2為T(mén)ISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPFSGYDTLGGSYGY。HEV-Fab-328CDR1為SSAMS；CDR2為T(mén)ISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPFSGYDTFGGVWLFDY。HEV-Fab-404CDR1為SSAMS；CDR2為T(mén)ISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3為VPFSGYDTFGGVWLFDY輕鏈(VL)三個(gè)CDR區(qū)的氨基酸序列包括HEV-Fab-216CDR1為T(mén)GGSSNIGSSYHVH；CDR2為ADTRRPS；CDR3為QTYDSDLGGSV。HEV-Fab-315CDR1為T(mén)GGSSNIGSSYHVH；CDR2為DTRRPS；CDR3為QTYDSDLGGSV。HEV-Fab-319CDR1為AGSSSNIGAAYDVH，CDR2為SNSNRPS；CDR3為QSYDRSLNGVV。HEV-Fab-328CDR1為T(mén)GGSSNIGSSYHVH；CDR2為ADTRRPS；CDR3為QTYDSDLGGSV。HEV-Fab-404CDR1為AGSSSNIGAAYDVH；CDR2為SNSNRPS；CDR3為QSYDRSLNGVV。
4.人源抗戊肝病毒基因工程抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，其主要功能特征在于特異性識(shí)別戊肝病毒中和抗原ORF2蛋白，應(yīng)具有抗戊肝病毒感染的中和活性功能。
5.根據(jù)上述4條權(quán)利要求，人源抗戊肝病毒基因工程抗體的用途，其特征在于利用上述獲得的中和性抗體可變區(qū)，F(xiàn)ab或全抗體基因，可以在原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真核細(xì)胞及任何重組病毒系統(tǒng)中表達(dá)和生產(chǎn)此抗體基因或以此為基礎(chǔ)的改建后的含有此抗體基因任何其他基因，獲得具有中和戊肝病毒感染的抗體產(chǎn)物，其基因表達(dá)產(chǎn)物可望在臨床上用于預(yù)防和治療由戊肝病毒引起的戊型肝炎。
6.根據(jù)權(quán)利要求2和3，人源抗戊肝病毒基因工程抗體基因的用途，其特征在于根據(jù)抗戊肝病毒中和抗體HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404的可變區(qū)中的CDR區(qū)特異性核苷酸或氨基酸序列，可在體外人工合成與此相同的抗體輕重鏈6個(gè)CDR區(qū)的核苷酸序列或編碼相同氨基酸的核苷酸序列，從而獲得相同的抗體基因或用于相關(guān)基因的改造，而獲得抗戊肝病毒ORF2的中和抗體或相關(guān)蛋白或多肽產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求2，3和5，人源抗戊肝病毒基因工程抗體基因的用途，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求2，3中所述的CDR區(qū)氨基酸序列為本抗體專(zhuān)有的抗體序列，任何新的工程抗體可變區(qū)基因或相關(guān)產(chǎn)物基因不應(yīng)含有與上述任何兩種CDR區(qū)序列完全相同或僅1-2個(gè)氨基酸差易的序列或含有權(quán)利要求3中任一種抗體輕重鏈的CDR區(qū)域的特征。任何新的工程抗體全抗體基因不應(yīng)含有權(quán)利要求4中所述的特征。
全文摘要
人源抗戊肝病毒性基因工程抗體，命名HEV－Fab－216，HEV－Fab－315，HEV－Fab－319，HEV－Fab－328，HEV－Fab－404，包括Fab段、基因產(chǎn)物及其應(yīng)用。其主要特征在于此重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的并在原核和真核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合戊肝ORF2蛋白的功能性抗體。其今后的可能用途在于利用此抗體CDR區(qū)或部分或全基因，可在原核、酵母、昆蟲(chóng)和真核細(xì)胞及任何表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)此抗體，可在臨床上預(yù)防或治療HEV相關(guān)疾病。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1486990SQ0312091
公開(kāi)日2004年4月7日 申請(qǐng)日期2003年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月25日
發(fā)明者梁米芳, 畢勝利, 杜潤(rùn)蕾 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所, 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制