專利名稱：抗膀胱癌的基因工程免疫毒素及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗癌基因工程免疫毒素，表達(dá)該免疫毒素的核苷酸序列，含有該核苷酸序列的載體，以及含有該載體的宿主細(xì)胞。
免疫毒素(IT)是指將抗體與毒素蛋白相融合而產(chǎn)生的一種大分子蛋白。其中抗體部分主要負(fù)責(zé)引導(dǎo)毒素蛋白與靶抗原的特異性結(jié)合，毒素部分則主要是實(shí)施對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。長(zhǎng)期以來(lái)，人們就已致力于用單克隆抗體治療多種疾病，然而效果并不理想。為此人們不得不設(shè)計(jì)另一種方案以達(dá)到更為有效的治療結(jié)果，免疫毒素正是在此情況下應(yīng)運(yùn)而生的。第一代免疫毒素是通過(guò)化學(xué)方法將完整的單抗分子與完整的毒蛋白分子相偶聯(lián)。偶聯(lián)后的分子很大，毒性也很強(qiáng)，偶聯(lián)的效率低，生產(chǎn)成本高，而且偶聯(lián)物很容易在體內(nèi)解離，產(chǎn)生很大的副作用。第二代IT則是用Fab代替完整的單抗，與毒蛋白分子中負(fù)責(zé)殺死細(xì)胞的部分偶聯(lián)，從而使分子變小，滲透力增強(qiáng)，同時(shí)也降低了免疫原性，但是，第一代IT所存在的其他問(wèn)題并沒(méi)有得到解決。而且，所用的Fab是以蛋白酶切單克隆抗體的方法獲得的，效率低、成本高．1984年人-鼠嵌合抗體的出現(xiàn)標(biāo)志著基因工程抗體時(shí)代的開(kāi)始，所謂基因工程抗體就是在單克隆抗體的基礎(chǔ)上用基因工程技術(shù)改造和創(chuàng)造出來(lái)的新型抗體，它包括三種基本類型人-鼠嵌合抗體、改形抗體、小分子抗體(Fab、Fv、單鏈抗體即scFv、單域抗體、最小結(jié)合單位)。基因工程抗體的出現(xiàn)使免疫毒素的研究進(jìn)入了新的時(shí)代。第三代IT就是目前方興未艾的基因工程免疫毒素，它是利用基因重組技術(shù)將基因工程抗體與經(jīng)過(guò)刪節(jié)的毒素蛋白基因相融合并克隆到大腸桿菌表達(dá)載體中進(jìn)行表達(dá)，直接得到了均一的活性蛋白。第三代IT大大簡(jiǎn)化了免疫毒素的構(gòu)建過(guò)程，使大量生產(chǎn)免疫毒素成為可能，同時(shí)它又進(jìn)一步降低了分子量，使其穿透力大大增強(qiáng)，從而更易穿透實(shí)體瘤，到達(dá)腫瘤高壓區(qū)。另外，由于第三代IT為均一的蛋白，這一特點(diǎn)無(wú)疑在一定程度上提高了免疫毒素的活性降低其毒副作用，從而使IT更具威力。
免疫毒素作為一種新型的治療戰(zhàn)略主要有三個(gè)特性以區(qū)別于其它類型的抗體定向治療方案其一是免疫毒素對(duì)細(xì)胞的作用方式是不依賴于其它試劑或寄主的附屬機(jī)制的。其二是免疫毒素對(duì)正常細(xì)胞是無(wú)害的并能有效地被內(nèi)吞入細(xì)胞。最后一點(diǎn)是免疫毒素毒殺細(xì)胞的機(jī)制與傳統(tǒng)的化療放療的方法截然不同。另外，作為一個(gè)具有實(shí)際治療效果的免疫毒素，以下幾個(gè)特點(diǎn)是必備的1，免疫毒素應(yīng)具有特異性，不與正常組織反應(yīng)。2，毒素與抗體連接不能損害抗體結(jié)合抗原的能力。3．免疫毒素必須被內(nèi)吞進(jìn)入內(nèi)吞泡。4．毒素的活性部分必須轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中。5．對(duì)于體內(nèi)治療，毒素與抗體的連接部分必須足夠穩(wěn)定以確保免疫毒素能夠穿過(guò)組織到達(dá)作用部位。以上述幾點(diǎn)為依據(jù)，人們研制開(kāi)發(fā)了多種免疫毒素以治療各種不同疾病。與抗體連接的毒素蛋白通常有篦麻毒蛋白(Ricin)、白喉毒素(DT)和假單胞菌屬外毒素(PE)。假單胞菌屬外毒素(PE)在IT的構(gòu)建方面扮演了越來(lái)越重要的角色。雖然，同屬于ADP-核糖基化酶的白喉毒素(DT)也常被用于IT的構(gòu)建，但有研究表明，用由PE構(gòu)建的免疫毒素與由DT構(gòu)建的免疫毒素比較，前者比后者具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。本發(fā)明用的是PE。PE是由三個(gè)結(jié)構(gòu)域(Domain,D)構(gòu)成的DⅠ,DⅡ和DⅢ。其中DⅠ又由DⅠa和DⅠb組成，具有結(jié)合細(xì)胞的能力，負(fù)責(zé)引導(dǎo)PE與靶細(xì)胞膜受體結(jié)合。DⅡ由6至7個(gè)α-螺旋組成，負(fù)責(zé)PE的跨膜運(yùn)輸。而DⅢ則具有核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，負(fù)責(zé)催化EF-2的ADP-核糖基化。并且，其C-端的REDLK序列與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留序列KDEL相似，可引導(dǎo)PE進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
早期的免疫毒素通常是用完整的毒蛋白與抗體相偶聯(lián)而成的，交叉反應(yīng)嚴(yán)重，從而失去了其導(dǎo)向藥物的意義。為了解決這個(gè)問(wèn)題，將PE基因中編碼受體識(shí)別和結(jié)合的那部分(DⅠa和DⅠb)基因刪除，成為PE40或PE38基因，再與抗體基因相連接，表達(dá)所得到的蛋白產(chǎn)物即為PE40或PE38免疫毒素。缺失了結(jié)合區(qū)的免疫毒素大大提高了對(duì)靶細(xì)胞的特異性。
構(gòu)成免疫毒素的另一個(gè)組分是抗體。抗體在免疫毒素中行使導(dǎo)向功能，將免疫毒素帶到靶細(xì)胞周圍，由毒素蛋白殺傷靶細(xì)胞。因此，抗體分子的大小、特異性、穩(wěn)定性及與毒素蛋白結(jié)合的穩(wěn)定性均直接關(guān)系到IT是否能有效地行使其功能。第一代的免疫毒素用的是完整的單克隆抗體分子，抗體的特異性和穩(wěn)定性雖不存在問(wèn)題，但分子太大，不易穿透組織到達(dá)靶部位，而且免疫原性高容易引起免疫反應(yīng)，因此，現(xiàn)在已不采用這種方法。第二代的免疫毒素使用Fab代替完整的抗體分子，雖解決了分子太大的問(wèn)題，但仍然用化學(xué)偶聯(lián)的方法將毒素蛋白與抗體連接，所得到的免疫毒素在體內(nèi)容易解離，而且連接效率低，生產(chǎn)成本高。利用基因工程抗體技術(shù)制備的第三代免疫毒素基本上解決了上述的問(wèn)題。目前，IT的抗體部分常用抗體的Fv片段來(lái)構(gòu)建。這不僅是因?yàn)镕v片段分子小，它是含有完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小單位，還因?yàn)榭梢杂么竽c桿菌表達(dá)，發(fā)酵生產(chǎn)，大大降低生產(chǎn)成本，使免疫毒素得以普及使用。但由于VH和VL間不能形成共價(jià)鍵，在體內(nèi)不穩(wěn)定，很容易解離。為了提高Fv片段的穩(wěn)定性，在VH和VL間插入一條多肽鏈，即連接肽，把VH和VL連接起來(lái)，形成所謂單鏈抗體(scFv)。連接肽通常為一條15aa長(zhǎng)的具有柔韌性的短肽，最常用的是(Gly4Ser)3。(參考文獻(xiàn)1．黃華梁，基因工程抗體，單克隆抗體通訊，1991,7(3):1-4；2．劉喜富、黃華梁，基因工程抗體研究進(jìn)展，生物工程進(jìn)展，1994,14(1):54；3．黃華梁，人源化抗體、小分子抗體與腫瘤治療，單克隆抗體通訊，1993,9(3):19；4.WawrzynczakEJ,Systemic immunotoxin therapy of cancer:advances andprospects,Br.J.Cancer,1991,64:624-630；5.Brinkmann U&Pastan I,Recombinant immunotoxins:From basic research tocancer therapy,METHOD:A companion to methods in enzymology,1995,8,143-156)。
膀胱癌在中國(guó)是泌尿系統(tǒng)發(fā)生率最高的惡性腫瘤。它是多發(fā)性，多病灶的，并且在經(jīng)過(guò)化療和放療等標(biāo)準(zhǔn)治療方法后，還有很高的發(fā)病率。
本發(fā)明的目的就是用基因工程抗體技術(shù)開(kāi)發(fā)一種低毒、高效、價(jià)廉的膀胱癌的生物治療制劑-抗膀胱癌的基因工程免疫毒素。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼所述免疫毒素的核苷酸序列。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供兩種可用于構(gòu)建和表達(dá)免疫毒素的通用的大腸桿菌質(zhì)粒，及含有編碼所述免疫毒素核苷酸序列的表達(dá)載體。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)低毒、高效、價(jià)廉的膀胱癌的生物治療制劑-抗膀胱癌的基因工程免疫毒素的方法。
因而，本發(fā)明提供了一種抗膀胱癌的免疫毒素，它是由基因工程抗體和毒素蛋白連接而成的。其中，基因工程抗體部分可以是完整的抗體分子、Fab、單域抗體或單鏈抗體(scFv)；毒素蛋白部分可以是篦麻毒蛋白、白喉毒素(DT)或假單孢菌外毒素(PE)。
抗膀胱癌的基因工程抗體最好是單鏈抗體(其分子量只為原單克隆抗體的1/6)，毒素蛋白最好是截去了與細(xì)胞膜結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的假單孢菌外毒素，即PE38。
本發(fā)明的抗膀胱癌的基因工程免疫毒素最好是由抗膀胱癌單鏈抗體和假單孢菌外毒素PE38構(gòu)成的雜合蛋白。它是由抗膀胱癌單克隆抗體的重、輕鏈可變區(qū)基因通過(guò)一段接頭與PE38基因連接起來(lái)之后，在宿主中表達(dá)的產(chǎn)物。它能特異地殺傷膀胱癌細(xì)胞。
本發(fā)明提供了一種編碼所述免疫毒素的核苷酸序列。其中包括單鏈抗體基因和PE38基因之間的接頭序列，該接頭可以是任何一種使單鏈抗體和PE38在表達(dá)的融合蛋白中保持一定的距離的接頭，從而使它們互不影響各自的折疊。但最好使用含有多聚組氨酸，從而有利于以后的純化，并含有適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)，便于以后替換不同的單鏈抗體或毒素蛋白的接頭。
本發(fā)明提供了兩種可用于構(gòu)建和表達(dá)免疫毒素的通用的大腸桿菌質(zhì)粒，及含有編碼本發(fā)明免疫毒素核苷酸序列的表達(dá)載體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，一種質(zhì)粒為pAHM，它是以pAL781為背景質(zhì)粒。選擇該質(zhì)粒、單鏈抗體基因、PE38基因三者均沒(méi)有的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成含有這些酶切位點(diǎn)的DNA片段，取代背景質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建而成的通用的免疫毒素表達(dá)質(zhì)粒。該質(zhì)粒具備如下特點(diǎn)在已構(gòu)建好的免疫毒素基礎(chǔ)上，置換任何一種單鏈抗體基因或毒素蛋白基因，從而獲得不同類型的免疫毒素，含有編碼本發(fā)明免疫毒素核苷酸序列的pAHM命名為pHMTX。另一種質(zhì)粒為pTMF，它是以pET28a為背景質(zhì)粒。根據(jù)免疫毒素的酶切位點(diǎn)和進(jìn)一步研究的需要，設(shè)計(jì)和合成了一個(gè)DNA片段，將這一片段置換pET28a中的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建而成的不僅限于免疫毒素的高效表達(dá)的質(zhì)粒。該質(zhì)粒除了具有高效表達(dá)的特點(diǎn)外，還具備如下特點(diǎn)具有多種較稀少的酶切位點(diǎn)，便于插入各種外源基因使它們或共表達(dá)或成融合蛋白表達(dá)；在兩組酶切位點(diǎn)之間有一凝血酶的酶切位點(diǎn)，可將表達(dá)的融合蛋白純化后分開(kāi)；在多克隆位點(diǎn)的3捰端(His6)密碼子，便于表達(dá)產(chǎn)物作金屬鰲合層析純化。含有編碼本發(fā)明免疫毒素核苷酸序列的pTMF命名為pTMF-IT。
本發(fā)明還提供了一種含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。所述的宿主細(xì)胞最好為大腸桿菌。
本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)基因工程免疫毒素的方法。這一方法可以歸結(jié)為如下步驟1．設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊?，從抗膀胱癌的雜交瘤細(xì)胞株中分別擴(kuò)增和克隆出單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因；從帶有PE38基因的質(zhì)粒中，擴(kuò)增出PE38基因；2．將擴(kuò)增出的單克隆抗體重鏈可變區(qū)，輕鏈可變區(qū)基因，通過(guò)適當(dāng)?shù)慕宇^和毒素蛋白基因連接，插入載體，構(gòu)建出高效的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；3．培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，使其表達(dá)所述的免疫毒素；4．分離表達(dá)的免疫毒素。
本發(fā)明的生產(chǎn)基因工程免疫毒素的方法最好包括以下步驟1、設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊?，從分泌抗膀胱癌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株中分別擴(kuò)增和克隆出單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因；2、將得到的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因插入到通用的單鏈抗體表達(dá)載體，構(gòu)建成單鏈抗體基因，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行鑒定；3、選定一種帶有強(qiáng)啟動(dòng)子的質(zhì)粒作為背景質(zhì)粒，選擇該質(zhì)粒、單鏈抗體基因、PE38基因三者均沒(méi)有的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成含有這些酶切位點(diǎn)的DNA片段，取代背景質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成通用的免疫毒素表達(dá)質(zhì)粒；4、根據(jù)單鏈抗體基因信號(hào)肽和輕鏈FR4的核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，用PCR方法從單鏈抗體表達(dá)質(zhì)粒中擴(kuò)增出帶有合適的酶切位點(diǎn)、信號(hào)肽和適當(dāng)接頭的單鏈抗體基因，把此基因插入到免疫毒素表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；5、從帶有PE38基因的質(zhì)粒中，酶切出PE38基因，把此基因插入到已帶有單鏈抗體基因和接頭的免疫毒素表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從而構(gòu)建成免疫毒素基因；6、誘導(dǎo)免疫毒素表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定表達(dá)產(chǎn)物的分子量、表達(dá)量和表達(dá)形式，用ELISA檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的抗膀胱癌抗體活性，用培養(yǎng)的膀胱癌細(xì)胞株和其他癌細(xì)胞株檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物對(duì)膀胱癌細(xì)胞的殺傷能力和殺傷特異性；7、構(gòu)建高效表達(dá)的表達(dá)載體，將免疫毒素基因插入該載體，構(gòu)建出高效的表達(dá)質(zhì)粒；8、用構(gòu)建出的高效表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；9、培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，使其表達(dá)所述的免疫毒素；10、分離表達(dá)的免疫毒素。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1．?dāng)U增抗膀胱癌單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的引物及表達(dá)單鏈抗體的質(zhì)粒pWAI80的物理圖。
圖2．抗膀胱癌單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列及所編碼的氨基酸序列。
圖3．合成的多克隆位點(diǎn)片段及免疫毒素通用表達(dá)質(zhì)粒pAHM的物理圖。
圖4．從單鏈抗體表達(dá)質(zhì)粒擴(kuò)增單鏈抗體基因的引物、PE38基因的接頭及免疫毒素中單鏈抗體基因與PE38基因之間的接頭。
圖5．PE38基因的核苷酸序列。
圖6．抗膀胱癌免疫毒素的表達(dá)質(zhì)粒pHMTX的物理圖。
圖7．抗膀胱癌免疫毒素表達(dá)產(chǎn)物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。
圖8．抗膀胱癌免疫毒素對(duì)膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果。
圖9．構(gòu)建提高免疫毒素表達(dá)量的表達(dá)質(zhì)粒pTMF的合成片段及其物理圖。
圖10．抗膀胱癌免疫毒素在pTMF表達(dá)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。
實(shí)施例(一)抗膀胱癌單鏈抗體的構(gòu)建根據(jù)抗體可變區(qū)FR1和FR4的序列，設(shè)計(jì)了一組PCR引物，用其中2對(duì)引物(圖1)，以分泌抗膀胱癌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株BDI1細(xì)胞提取的總DNA作模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。分別擴(kuò)增出抗膀胱癌單克隆抗體的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因，平端克隆到質(zhì)粒pUC19，測(cè)序驗(yàn)證確為抗體可變區(qū)基之后，用相應(yīng)的限制酶切下這兩個(gè)基因，插入到本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的單鏈抗體表達(dá)質(zhì)粒pWAI80(圖1)中，VH在5′端，VL在3′端，兩者之間為L(zhǎng)inker-(Gly4Ser)3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL1-blue，挑取轉(zhuǎn)化子，用酶切鑒定，確證已構(gòu)建成單鏈抗體基因(基因序列見(jiàn)圖2)，該質(zhì)粒命名為pV4YLH。接種轉(zhuǎn)化子的單菌落到Super Broth(3％BactoTrypton-2％Bacto YeastExtract-1％MOPS pH7.0-20mM MgCl2-0.05mg/ml Amp)中，37℃培養(yǎng)～6h(OD600=0.2)，用1mM IPTG 30℃誘導(dǎo)過(guò)夜。收集菌體，用凍融法裂解。離心所得的上清液，用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA方法測(cè)定單鏈抗體的活性。結(jié)果證明，單鏈抗體的抑制率為83％(表1)，說(shuō)明抗膀胱癌單鏈抗體已構(gòu)建和表達(dá)成功。
表1．用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA檢測(cè)抗膀胱癌單鏈抗體活性的結(jié)果BDI-1抗膀胱癌單克隆抗體；NIL未誘導(dǎo)的菌體裂解上清液
(二)抗膀胱癌免疫毒素的構(gòu)建與表達(dá)1．構(gòu)建免疫毒素的表達(dá)質(zhì)粒為了便于單鏈抗體基因和PE38基因的插入，以及以后變換單鏈抗體基因或毒素蛋白基因，需要構(gòu)建一個(gè)具有適當(dāng)酶切位點(diǎn)的表達(dá)質(zhì)粒。為此設(shè)計(jì)了一段接頭(圖3)以置換pAL-781中的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)這段接頭的原則是，它所有的酶切位點(diǎn)都不存在于scFv基因、PE38基因和pAL-781質(zhì)粒中。經(jīng)酶切及測(cè)序分析，確證GJ1/GJ2接頭已成功地裝入pAL-781質(zhì)粒中，并將新質(zhì)粒命名為pAHM(圖3)。該質(zhì)粒具有如下特點(diǎn)在已構(gòu)建好的免疫毒素基礎(chǔ)上，置換任何一種單鏈體基因或毒素蛋白基因，從而獲得不同類型的免疫毒素。
2．抗膀胱癌scFv基因的擴(kuò)增及裝入根據(jù)抗膀胱癌scFv基因中信號(hào)肽pelB基因和VL的FR4序列設(shè)計(jì)并合成了擴(kuò)增scFv基因所需的引物CH120(5′端)和SCL43(3′端)(圖4)。
在CH120中加入NdeⅠ位點(diǎn)，并使擴(kuò)增出的scFv帶有pelB基因，使構(gòu)建成的免疫毒素具有外分泌功能。在SCL43中則加入了一段經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的，以后與PE38連接的接頭(圖4)。用這兩個(gè)引物從pV4YLH中擴(kuò)增出scFv基因，經(jīng)酶切后，插入質(zhì)粒pAHM。經(jīng)過(guò)鑒定，新質(zhì)粒命名為pAHMf-b。
3．PE38與載體pAHMf-b的連接通過(guò)HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切可將含終止密碼的PE38基因(圖5)從載體中切下。由于pAHM載體的多克隆位點(diǎn)中沒(méi)有HindⅢ位點(diǎn)，合成了一個(gè)5′端NotⅠ-HindⅢ接頭AD1/AD2(圖4)。用此接頭與PE38連接，再與同樣雙切后的pAHMf-b載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌G1724，獲得了轉(zhuǎn)化株，并通過(guò)了酶切鑒定，從而構(gòu)建完成了抗膀胱癌免疫毒素的表達(dá)質(zhì)粒。該質(zhì)粒命名為pHMTX(圖6)。
4．抗膀胱癌免疫毒素在大腸桿菌中的表達(dá)將含有pHMTX的GI724單菌落接種到RM培養(yǎng)基(6g Na2HPO4,3g KH2PO4,0.5g NaCl,1g NH4Cl,20g水解酪蛋白，0.095g MgCl2,50％甘油，1ml 100mg/ml氨芐青霉素，加水至1升)中，30℃振蕩過(guò)夜，第二天取出100μl過(guò)夜的GI724轉(zhuǎn)接到20ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30℃搖大約3-4小時(shí)，使其OD550=0.5。然后加入終濃度為100μg/ml色氨酸，37℃，誘導(dǎo)2小時(shí)。離心，4℃,4000rpm,10分鐘，去上清，菌體重懸于4ml PBS中。將超聲儀探頭置于PBS液面稍下方，以最大功率超聲3次，每次10秒，然后將超聲過(guò)的溶液置于液氮中數(shù)秒，使其冷凍，再迅速放于37℃水浴中使其融化，如此超聲，凍融反復(fù)3次。然后，離心，4℃,5000rpm,10分鐘，保留上清，沉淀重懸于3-4ml PBS，與上清同放于-20℃保存。跑8％的SDS-PAGE觀察表達(dá)情況(圖7)。以空載體pAHM和只插入scFv的載體pAHMf-b為對(duì)照，可觀察到在70kDa處有一明顯的表達(dá)帶，上清液的相應(yīng)位置也有同樣的表達(dá)帶，說(shuō)明有一部分表達(dá)產(chǎn)物是以可溶性形式表達(dá)的，因此可以直接用上清液鑒定免疫毒素的生物活性。(三)抗膀胱癌免疫毒素生物活性的鑒定1．免疫毒素的抗體活性用競(jìng)爭(zhēng)性抑制ELISA測(cè)定免疫毒素的抗體活性。抗原為膀胱癌細(xì)胞株EJ細(xì)胞。將膀胱癌細(xì)胞株EJ細(xì)胞接種于酶標(biāo)板內(nèi)，CO2孵化箱37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿每個(gè)孔底，取出，每孔加100μl 0.05％戊二醛(溶于0.01M PBS)10分鐘以固定細(xì)胞。然后用0.01M PBS洗三次，每孔加入200μl保存液(明膠200mg,NaN30.1g,BSA 1g,PBS 100ml)，封蓋，4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〕鰝溆妹笜?biāo)板，每孔加滿4％脫脂奶粉37℃，再封閉1小時(shí)。用洗滌液(PBS/0.05％Tween20)洗3次，加入待測(cè)液pHMTX上清100μl/well，并作空白對(duì)照(只加酶標(biāo)二抗)，陽(yáng)性對(duì)照(只加單抗，酶標(biāo)二抗，不加待測(cè)液)，37℃,1小時(shí)。用洗滌液洗5次，每孔加100μl 0.5％戊二醛，室溫3分鐘，棄掉，用三蒸水洗5次，再加入抗膀胱癌單克隆抗體(雜交瘤細(xì)胞BDI-1所得的腹水)100μl/孔，37℃,1小時(shí)。用洗滌液洗6次，加入酶標(biāo)二抗(HRP-羊抗鼠IgG)100μl/孔，37℃,1小時(shí)。用洗滌液洗6次，加入OPD溶液(總體積為100ml:48.6ml 0.05M檸檬酸，51.4ml 0.1M磷酸氫二鈉，40mg鄰苯二胺，150μl H2O2)100μl/孔，37℃,15-30分鐘，加2M H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)OD492。結(jié)果表明，免疫毒素能顯著抑制單克隆抗體的活性，抑制率為37％(表2)。說(shuō)明免疫毒素的scFv部分是有活性的。
表2．抗膀胱癌免疫毒素的抗體活性檢測(cè)結(jié)果
2．抗膀胱癌免疫毒素對(duì)膀胱癌細(xì)胞的殺傷活性將膀胱癌細(xì)胞株EJ細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl(約5000個(gè)細(xì)胞)，在CO2孵箱中過(guò)夜。待測(cè)液pHMTX表達(dá)上清液按三種不同量5μl,10μl,50μl加樣，同時(shí)作空載體pAHM上清液，單鏈抗體載體pAHMf-b上清液，死細(xì)胞和活細(xì)胞對(duì)照，37℃,CO2孵箱培養(yǎng)48小時(shí)。每孔加入25μl MTT(5μg/ml，溶于PBS)，再于37℃,CO2孵箱保溫4小時(shí)。倒掉孔內(nèi)液體，每孔分別加入100μl DMSO,37℃,1小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)OD492。按如下公式計(jì)算出細(xì)胞存活率，并作圖。
結(jié)果如表3、圖8所示，5μl pHMTX上清對(duì)膀胱癌細(xì)胞殺傷作用較小，存活率為63％，當(dāng)加樣量增至10μl及50μl時(shí)，存活率僅為37％。正如所料，空載體pAHM和單鏈抗體載體pAHMf-b的上清液對(duì)細(xì)胞的存活率沒(méi)有明顯的影響。
表3．抗膀胱癌免疫毒素對(duì)膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果
>3．免疫毒素對(duì)細(xì)胞殺傷的特異性為測(cè)定IT的細(xì)胞殺傷特異性，選擇了除靶細(xì)胞BIU-87和EJ(膀胱癌細(xì)胞)外，還選用了另外五種細(xì)胞Hela(宮頸癌細(xì)胞)，MCF-7(乳腺癌細(xì)胞)，3T3(小鼠成纖維細(xì)胞)，A549(肺腺癌細(xì)胞)，BCL(肝癌細(xì)胞)作為對(duì)照。每種細(xì)胞均設(shè)死細(xì)胞及活細(xì)胞對(duì)照。其它方法與具體步驟與上述相同。結(jié)果表明[表4]，與各自的活細(xì)胞對(duì)照比較來(lái)看，當(dāng)加樣量為50μl時(shí)，可以清楚看出靶細(xì)胞BIU-87和EJ(膀胱癌細(xì)胞)明顯被殺傷細(xì)胞皺縮，邊界不清，看不到活細(xì)胞所具有的多邊形邊界，細(xì)胞內(nèi)溶物外流。而對(duì)于3T3(小鼠成纖維細(xì)胞)，Hela(宮頸癌細(xì)胞)，BCL(肝癌細(xì)胞)以及MCF-7(乳腺癌細(xì)胞)則無(wú)明顯作用細(xì)胞飽滿伸展，多邊形邊界清晰。然而，A549(肺腺癌細(xì)胞)在50μl免疫毒素的作用下，則有一定反應(yīng)，但無(wú)膀胱癌細(xì)胞作用明顯。推測(cè)，可能是A549細(xì)胞表面亦有與抗膀胱癌單鏈抗體類似的靶抗原，從而，發(fā)生了交叉反應(yīng)。
表4．抗膀胱癌免疫毒素的細(xì)胞毒特異性試驗(yàn)結(jié)果-無(wú)殺傷作用；+有殺傷作用
(四)高效表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)由于pAHM的表達(dá)量不高，不適用于生產(chǎn)，需要構(gòu)建一個(gè)高效表達(dá)免疫毒素的質(zhì)粒。以具有T7啟動(dòng)子的pET28a為背景質(zhì)粒，根據(jù)免疫毒素的酶切位點(diǎn)和進(jìn)一步研究的需要，設(shè)計(jì)和合成了一個(gè)DNA片段。將這一片段置換pET28a中的多克隆位點(diǎn)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證之后，構(gòu)建成一個(gè)新的質(zhì)粒，命名為pTMF(圖9)。該質(zhì)粒除了具有高效表達(dá)的特點(diǎn)外，還具備如下特點(diǎn)具有多種較稀少的酶切位點(diǎn)，便于插入各種外源基因使它們或共表達(dá)或成融合蛋白表達(dá)；在兩組酶切位點(diǎn)之間有一凝血酶的酶切位點(diǎn)，可將表達(dá)的融合蛋白純化后分開(kāi)；在多克隆位點(diǎn)的3’端有(His)6密碼子，便于表達(dá)產(chǎn)物作金屬鰲合層析純化。
用NdeⅠ和EcoRⅠ從pHMTX中切下免疫毒素基因，插入到用同樣兩種酶切的pTMF中，命名為pTMF+IT，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)篩選和酶切鑒定后，挑選單克隆，用1mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在37℃下誘導(dǎo)6小時(shí)，將細(xì)菌離心沉淀后，用超聲波破碎，跑SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。免疫毒素的表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白25％，相當(dāng)于52mg/L培養(yǎng)物，其中以可溶性形式表達(dá)的免疫毒素占可溶性蛋白10.6％，相當(dāng)于42mg/L培養(yǎng)物(圖10)。這一表達(dá)量已能用于生產(chǎn)。(五)結(jié)論所構(gòu)建的抗膀胱癌免疫毒素具有與膀胱癌細(xì)胞特異結(jié)合并特異地將其殺傷的作用，可發(fā)展成為膀胱癌的生物治療藥物。
權(quán)利要求
1．一種抗膀胱癌的免疫毒素，它是由抗膀胱癌的基因工程抗體和毒素蛋白連接而成的。
2．按照權(quán)利要求1所述的免疫毒素，其特征在于，基因工程抗體部分是完整的抗體分子、Fab、單域抗體或單鏈抗體(scFv)。
3．按照權(quán)利要求1所述的免疫毒素，其特征在于，毒素蛋白部分是篦麻毒蛋白、白喉毒素(DT)或假單孢菌外毒素(PE)。
4．按照權(quán)利要求1所述的免疫毒素，其特征在于，所述的基因工程抗體是單鏈抗體，毒素蛋白是截去了與細(xì)胞膜結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的假單孢菌外毒素，即PE38。
5．按照權(quán)利要求4所述的免疫毒素，其特征在于，所述的單鏈抗體具有如下的重鏈可變區(qū)氨基酸序列1 CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GCA GAA CTT GTG AAG CCA GGG GCC 481 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1649 TCA GTC AAG TTG TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA GAC ACC 9617 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 32CDR197 TTT ATA CAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT 14433 Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 48145 GGA AGG ATT GAT CCT GCG GAT GGT AAT GTT AAA TAT GAC CCG AAG TTC 19249 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Val Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 64CDR2193 CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCG GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TAC 24065 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 80241 CTG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT 28881 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 96289 GCT AGA TCG GGC TCT ACG GTA ATA GAT TAC TAT GTT ATG GAC TAC TGG 33697 Ala Arg Ser Gly Ser Thr Val Ile Asp Tyr Tyr Val Met Asp Tyr Trp 112CDR3337 GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 366113 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 122
6．按照權(quán)利要求4所述的免疫毒素，其特征在于，所述的單鏈抗體具有如下的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列1 GAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CTA GGG 481 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1649 GAA CGG GTC ACC ATG ACC TGC ACT GCC AGC TCA AGT ATA AGT TCC ACT 9617 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Thr 32CDR197 TAC TTG CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AAA CTC TGG 14433 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 48145 ATT TAT AGC ACT TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCA ACT CGC TTC AGT 19249 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser 64CDR2193 GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGC ATG GAG 24065 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 80241 GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAC CAG TAT CAT CGT TCC CCA 28881 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 96CDR3289 TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAG TTG GAA CTA AAA32497 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys108
7．按照權(quán)利要求4所述的免疫毒素，其特征在于，所述的PE38具有如下的核苷酸序列1 GGCGGCAGCC TGGCCGCGCT GACCGCGCAC CAGGCTTGCC ACCTGCCGCT GGAGACTTTC61 ACCCGTCATC GCCAGCCGCG CGGCTGGGAA CAACTGGAGC AGTGCGGCTA TCCGGTGCAG121 CGCCTGGTCG CCCTCTACCT GGCGGCGCGG CTGTCGTGGA ACCAGGTCGA CCAGGTGATC181 CGCAACGCCC TGGCCAGCCC CGGCAGCGGC GGCGACCTGG GCGAAGCGAT CCGCGAGCAG241 CCGGAGCAGG CCCGTCTGGC CCTGACCCTG GCCGCCGCCG AGAGCGAGCG CTTCGTCCGG301 CAGGGCACCG GCAACGACGA GGCCGGCGCG GCCAACGGCC CGGCGGACAG CGGCGACGCC361 CTGCTGGAGC GCAACTATCC CACTGGCGCG GAGTTCCTCG GCGACGGCGG CGACGTCAGC421 TTCAGCACCC GCGGCACGCA GAACTGGACG GTGGAGCGGC TGCTCCAGGC GCACCGCCAA481 CTGGAGGAGC GCGGCTATGT GTTCGTCGGC TACCACGGCA CCTTCCTCGA AGCGGCGCAA541 AGCATCGTCT TCGGCGGGGT GCGCGCGCGC AGCCAGGACC TCGACGCGAT CTGGCGCGGT601TTCTATATCG CCGGCGATCC GGCGCTGGCC TACGGCTACG CCCAGGACCA GGAACCCGAC661 GCACGCGGCC GGATCCGCAA CGGTGCCCTG CTGCGGGTCT ATGTGCCGCG CTCGAGCCTG721 CCGGGCTTCT ACCGCACCAG CCTGACCCTG GCCGCGCCGG AGGCGGCGGG CGAGGTCGAA781 CGGCTGATCG GCCATCCGCT GCCGCTGCGC CTGGACGCCA TCACCGGCCC CGAGGAGGAA841 GGCGGGCGCC TGGAGACCAT TCTCGGCTGG CCGCTGGCCG AGCGCACCGT GGTGATTCCC901 TCGGCGATCC CCACCGACCC GCGCAACGTC GGCGGCGACC TCGACCCGTC CAGCATCCCC961 GACAAGGAAC AGGCGATCAG CGCCCTGCCG GACTACGCCA GCCAGCCCGG CAAACCGCCG1021 CGCGAGGACC TGAAGTAACT GCCGCGACCG GCCGGCTCCC TTCGCAGGAG CCGGCCTTCT1081 CGGGGCCTGG CCATACATCA GGTTTTCCTG ATGCCAGCCC AATCGAATAT GAGAATTC
8．按照權(quán)利要求4所述的免疫毒素，其特征在于，在單鏈抗體基因與PE38基因之間的接頭具有如下核苷酸序列CAT CAC CAT CAC CAT GGC GGT GGT GAG CTC GCG GCC GCT(His)5SacⅠ NotⅠGGT GAA GCT TCC GGA GGT CCC GAGHindⅢ
9．一種編碼權(quán)利要求1至8中任何一項(xiàng)所述的免疫毒素的核苷酸序列。
10．一種含有權(quán)利要求9所述序列的表達(dá)載體。
11．按照權(quán)利要求10所述的載體，它是pAHM。
12．按照權(quán)利要求10所述的載體，它是pTMF。
13．一種含有權(quán)利要求10-12中任何一項(xiàng)所述的載體的宿主細(xì)胞。
14．按照權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，它是大腸桿菌菌株。
15．一種生產(chǎn)抗膀胱癌的基因工程免疫毒素的方法，包括a．設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊?，從抗膀胱癌的雜交瘤細(xì)胞株中分別擴(kuò)增和克隆出單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因；從帶有PE38基因的質(zhì)粒中，擴(kuò)增出PE38基因；b．將擴(kuò)增出的單克隆抗體重鏈可變區(qū)，輕鏈可變區(qū)基因，通過(guò)適當(dāng)?shù)慕宇^和毒素蛋白基因連接，插入載體，構(gòu)建出高效的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；c．培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，使其表達(dá)所述的免疫毒素；d．分離表達(dá)的免疫毒素。
16．一種生產(chǎn)抗膀胱癌的基因工程免疫毒素的方法，包括a．設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊铮瑥姆置诳拱螂装﹩慰寺】贵w的雜交瘤細(xì)胞株中分別擴(kuò)增和克隆出單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因；b．將得到的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因插入到通用的單鏈抗體表達(dá)載體，構(gòu)建成單鏈抗體基因，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行鑒定；c．選定一種帶有強(qiáng)啟動(dòng)子的質(zhì)粒作為背景質(zhì)粒，選擇該質(zhì)粒、單鏈抗體基因、PE38基因三者均沒(méi)有的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成含有這些酶切位點(diǎn)的DNA片段，取代背景質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成通用的免疫毒素表達(dá)質(zhì)粒；d．根據(jù)單鏈抗體基因信號(hào)肽和輕鏈FR4的核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，用PCR方法從單鏈抗體表達(dá)質(zhì)粒中擴(kuò)增出帶有合適的酶切位點(diǎn)、信號(hào)肽和適當(dāng)接頭的單鏈抗體基因，把此基因插入到免疫毒素表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；e．從帶有PE38基因的質(zhì)粒中，酶切出PE38基因，把此基因插入到已帶有單鏈抗體基因和接頭的免疫毒素表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從而構(gòu)建成免疫毒素基因；f．構(gòu)建高效表達(dá)的表達(dá)載體，將免疫毒素基因插入該載體，構(gòu)建出高效的表達(dá)質(zhì)粒；g．用構(gòu)建出的高效表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，使其表達(dá)所述的免疫毒素；h．分離表達(dá)的免疫毒素。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗膀胱癌的免疫毒素,它是由抗膀胱癌的基因工程抗體和毒素蛋白連接而成的。本發(fā)明還提供了兩種含有本發(fā)明免疫毒素基因的大腸桿菌的表達(dá)質(zhì)粒pAHM和pTMF。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)抗膀胱癌的免疫毒素的方法。這一免疫毒素具有特異殺傷膀胱癌細(xì)胞的作用。
文檔編號(hào)C12P21/00GK1229799SQ9910337
公開(kāi)日1999年9月29日 申請(qǐng)日期1999年3月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月18日
發(fā)明者黃華梁, 黃浩旻, 李志華, 俞莉章, 林晴, 張明生 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所