專利名稱：人血紅蛋白α、β基因在大腸桿菌中的表達的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在大腸桿菌中表達人血紅蛋白α、β基因的方法。
血液短缺和傳播病毒的危險，使尋找血液來源的新途徑成為緊迫任務(wù)。利用基因工程技術(shù)已經(jīng)研制出大量的細胞因子類藥物，這類藥物具有產(chǎn)量大、無病毒污染等優(yōu)點，因此利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組人血紅蛋白(recombinanthuman hemoglobins rHb)是解決血液來源的最有希望的途徑之一。Nagai等國外學者已成功地在大腸桿菌中表達了人重組血紅蛋白(Nagai K,Perutz M,Poyart C,et al.,Oxygen binding properties of human mutant hemoglobinssynthesized in Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1985,82:7252-55)，他們以融合形式表達了血紅蛋白β鏈，表達的融合蛋白僅占總菌體蛋白的5～10％，而且需用因子Xa切割去掉非血紅蛋白部分。因為因子Xa本身來源有限，加上切割不完全、效率低，增加了下游工作的難度，所以這種融合形式的表達方法不適合重組人血紅蛋白的規(guī)?；a(chǎn)。Tame等用同樣的的方法表達了人血紅蛋白α鏈(Tame J,Fermi G,Nagai K,et al.,Functional role of thedistal valine residue ofαsubunits in human hemoglobin.JMB 1991 218:761-7)。Hoffman等將人工合成的α、β基因串聯(lián)置于Tac啟動子下以可溶性形式得到表達(Hoffman SJ,Lokker DL,Rochich JM,et al.,Expression offully functionaltetrameric human hemoglobins in Escherichia coli.Proc Nayl Acad Sci USA1990,87:8521-5)。Looker等將兩個α基因串聯(lián)與突變的β基因一起表達，形成了具有低氧親和力的穩(wěn)定四聚體(Looker D,Cozart P,Hoffman S,et al.,A human recombinant haemoglobin designed for use as a blood substitute.Nature1992 356:258-62)。Hernan用化學方式誘導將天然人β基因放在T7啟動子下得到表達，而α基因不表達，將α基因換用大腸桿菌的偏性密碼子后得到表達(Heman RA,Hui HL,Andracki ME,et al.,Human hemoglobin expression inEscherichia Coli:important of optimal codon usage.Biochemistry 1992,31:8619-25；Heman RA,Sligar SG,Tetrameric hemoglobin expression in E.Coli.J.Biological Chem1995,270:26257-60)。這些方法重組血紅蛋白的表達量低，僅占總蛋白的5～10％，且都以化學方式誘導表達，使重組人血紅蛋白的生產(chǎn)成本高。
為此，本發(fā)明的發(fā)明人一直想發(fā)明一種高表達量、低成本的表達人血紅蛋白α、β肽鏈的方法。
經(jīng)過長期的努力實驗，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用熱誘導方式進行非融合形式表達，可實現(xiàn)上述目的。
本發(fā)明的方法包括以下步驟1．從人外周血細胞中提取出總RNA，2．通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應得到人血紅蛋白的α和β基因片段，3．將α、β基因克隆入pBV220原核表達載體中，4．pBV220α和pBV220β的表達，5．表達產(chǎn)物的鑒定。
本發(fā)明的方法重組血紅蛋白的表達量高，占總蛋白約30％，下面結(jié)合附圖詳細說明本發(fā)明。


圖1為RT-PCR獲得的α、β鏈基因。
圖2為α、β鏈基因克隆載體的構(gòu)建。
圖3為α、β鏈基因表達載體的構(gòu)建。
圖4.1為α鏈基因的測序結(jié)果。
圖4.2為β鏈基因的測序結(jié)果。
圖5為α、β鏈基因在大腸桿菌中的表達。
圖6為免疫學測定(Western印跡)的結(jié)果。
一、實驗方法1．總RNA的提取按Promega公司試劑盒(RNAgents Total RNA Isolation Kit Cat#25110,可從商業(yè)渠道購得)的說明進行。
2．α、β鏈基因片段的制備用ABI公司自動合成儀，采用固相亞磷酸三酯法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，經(jīng)C18柱去鹽后，紫外分光光度計定量，冷凍干燥，然后存于TE中。用PCR儀擴增α、β鏈基因，合成四條引物。經(jīng)GOLDKEY軟件(可從商業(yè)渠道購得)分析，引物無發(fā)夾結(jié)構(gòu)，兩條引物間不形成二聚體。
α1:GGA ATT CAT ATG GTG CTG TCT CCT GCC GAC(含EcoRⅠ和NdeⅠ切點)，α2:CGG GAT CCT TAA CGG TAT TTG GAG GTC AG(含BamHⅠ切點)，
β1:TCC CCC GGG CAT ATG GTG CAC CTG ACT CCT GAG(含SmaⅠ和NdeⅠ切點)，β2:TGC ACT GCA GTT AGT GAT ACT TGT GGG CCAG(含PstⅠ切點)。
α2、β2分別用于反轉(zhuǎn)錄合成α、β基因的cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄體系20μL，加入4μl 5×RT Buffer 1μl,1μl dNTP(10mM),2μlDTT(0.1mol/L),1ug各自的下游引物，0.5μl RNasin(20U/uL),1μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(20U/μL),0.5ug RNA。65-70℃水浴10min變性后，37℃水浴1h,99℃5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。在PCR擴增各自的α、β鏈基因的50μl體系中，加入5μl 10×Buffer,1μl dNTPs(10mmol/L),1μg各自的上下游引物(1μg/ul),0.1μg cDNA,2.5μl MgCL2(25mmo1/L),0.5μl Taq酶(5U/μL)。94℃預變性3min,94℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，30個循環(huán)，最后一個循環(huán)72℃延伸10min。
3．PCR產(chǎn)物與pT7BLue載體連接按DNA快速純化回收試劑盒(PURIGENE Cat#980308，可從商業(yè)渠道購得)試劑盒的說明進行PCR產(chǎn)物的純化回收，與pT7BLue載體連接，連接體系20μL中，加入0.1μg載體，1μg PCR產(chǎn)物，4μL 5×Buffer,1.5UT4連接酶，12-16℃過夜。
4．連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)菌。
按照《分子克隆》實驗手冊挑選白色菌落提取質(zhì)粒進行PCR和酶切的初步鑒定后，酶切所需片段與同樣酶切處理的pBV220載體連接，用AppliedBiosystems Model 373A自動測序儀測序。
5．熱誘導表達少量陽性重組子接種于含氨芐青霉素50μg/mL的LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過夜，次日按1％～2％接種培養(yǎng)，同時加入血紅素40μg/mL，葡萄糖20mg/mL，30℃振蕩培養(yǎng)A600達0.4-0.6時，42℃繼續(xù)誘導培養(yǎng)4～5h。
6．SDS電泳用Tricine-SDS-PAGE凝膠分離低分子量蛋白質(zhì)，上層膠濃度為4％，下層膠濃度為16.5％，120V電泳5h。
7．表達產(chǎn)物的免疫學測定(Western印跡)采用電轉(zhuǎn)移裝置，電壓40V，轉(zhuǎn)印1.5～6h。轉(zhuǎn)印緩沖液48mMTris,39mM甘氨酸，0.037％SDS。轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜用1％脫脂奶粉37℃封閉1h，再與適當稀釋的兔抗人血紅蛋白抗血清4℃反應過夜，洗滌后與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔室溫作用1h，洗滌后DAB用顯色，20％H2SO4終止反應。
二、實驗結(jié)果1．人α、β鏈基因的克隆從去除白細胞的人外周血細胞中提取出總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄反應的模板。RNA的純度經(jīng)紫外分光光度計檢測A260/A280=1.95,RNA總量為42μg。以RNA為模板經(jīng)PCR擴增出預期的436、454bp的α、β片段。
2．表達載體的構(gòu)建2.1 PCR產(chǎn)物與pT7Blue的連接PCR產(chǎn)物經(jīng)PURIGENE純化回收后與pT7Blue質(zhì)粒連接，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增和酶切鑒定正確。
2.2酶切所需片段與同樣酶切處理的pBV220載體連接EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切連有α1/α2引物PCR擴增產(chǎn)物的pT7Blue/alpha質(zhì)粒，回收436bp片段與用相同酶切處理的pBV220連接組成pBV220/α。SmaⅠ/pstⅠ雙酶切連有β1/β2引物PCR擴增產(chǎn)物的pT7Blue/beta質(zhì)粒，回收444bp片段與用相同酶切處理的pBV220組成pBV220/B。α、β片段分別插入到pBV220載體中，經(jīng)測序與文獻報道的序列一致。
3．載體的熱誘導表達pBV220/α和pBV220/β陽性菌種接種于LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，按1％～2％接種，加入血紅素40μg/mL，葡萄糖20mg/mL,30℃振蕩培養(yǎng)至A600達0.4-0.6時，42℃搖床誘導培養(yǎng)4～5h。在16000位置，比對照菌多一條帶，與血紅蛋白標準單亞基的位置一致。
4．表達產(chǎn)物的免疫學測定(Western印跡)
權(quán)利要求
1．一種在大腸桿菌中表達人血紅蛋白α、β基因的方法，包括以下步驟(1)從人外周血細胞中提取出總RNA,(2)合成引物，(3)通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應得到人血紅蛋白的α和β基因片段，(4)將α、β基因克隆入pBV220原核表達載體中，(5)pBV220 α和pBV220β表達，(6)表達產(chǎn)物鑒定。
2．按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所合成的引物分別為含EcoRⅠ和NdeⅠ切點的α1:GGA ATT CAT ATG GTG CTG TCT CCT GCC GAC，含BamHⅠ切點的α2:CGG GAT CCT TAA CGG TAT TTG GAG GTC AG，含SmaⅠ和NdeⅠ切點的β1:TCC CCC GGG CAT ATG GTG CAC CTG ACT CCTGAG，含PstⅠ切點的β2:TGC ACT GCA GTT AGT GAT ACT TGT GGGCCAG。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在大腸桿菌中表達人血紅蛋白α、β基因的方法,其主要技術(shù)特征為以熱誘導方式、非融合形式表達。本方法具有表達量高、成本低等優(yōu)點。
文檔編號C12P21/02GK1232876SQ9910275
公開日1999年10月27日 申請日期1999年3月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月2日
發(fā)明者張 浩 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所