專利名稱：一種通過循環(huán)差減進(jìn)行大規(guī)模cDNA克隆和測(cè)序的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和cDNA克隆領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種對(duì)某一物種的任一種細(xì)胞類型進(jìn)行大規(guī)模全面cDNA測(cè)序的方法。
隨著生物學(xué)尤其是分子生物學(xué)的發(fā)展，目前人們已經(jīng)知道，生物的性狀由遺傳物質(zhì)-基因所決定。為了深入了解生物的各種生化過程，為了了解疾病與基因的相關(guān)性，為了開發(fā)具有新品質(zhì)的農(nóng)作物等，都需要人們能夠盡可能地(最好全面地)獲得生物體的DNA資料。
在任何一種生物體(尤其是真核生物)中，基因的表達(dá)因空間和時(shí)間而存在很大差異。即使是同一生物個(gè)體，其不同類型的細(xì)胞會(huì)表達(dá)不同的基因，同一細(xì)胞在不同時(shí)期也會(huì)表達(dá)不同的基因。例如，以人為例，人類基因組中的基因總數(shù)估計(jì)在5萬至10萬條之間(Bishop，J.O.，J.G.Morton，M.Rosbash，and M.Richardson.(1974)Three abundance classes in Hela cell messenger RNA.Nature 250199-204.)。在任一細(xì)胞類型中，大約只有一萬條基因是表達(dá)的，而這些基因在單個(gè)細(xì)胞中的平均表達(dá)量可能從20萬個(gè)拷貝至不到一個(gè)拷貝不等。因此，如何盡可能多地，甚至全部地測(cè)得被表達(dá)的基因就成為本領(lǐng)域一個(gè)難以逾越的障礙。
隨著PCR技術(shù)的改進(jìn)，從單個(gè)細(xì)胞中(Li，H.，Gyllensten，U.B.，Cui，X.，Saiki，R.K.，Erlich，H.A.& Arnheim，N.(1988)Nature(London)335，414-417)制備cDNA文庫已成為可能。而且在理論上可以制備出代表著大部分以至全部基因的一系列cDNA文庫。因此，先制備cDNA文庫，然后對(duì)從cDNA文庫中隨機(jī)選取的cDNA克隆進(jìn)行不重復(fù)的大規(guī)模測(cè)序，已被證明是發(fā)現(xiàn)新基因的一條有效途徑(Adams，M.D.，J.M.Kelley，J.D.Gocayne，M.Dubnick，M.H.Polemeropoulos，H.Xiao，C.R.Kerlavage，W.R.McCombie，and J.Craig Venter.(1991)Complementary DNA sequencingExpressedsequence tags and Human Genome Project.Science 2521651-1656.Adams，M.D.，A.R.Kerlavage，C.Fields，and J.C.Venter.(1993a)3,400 new expressed sequence tagsidentify diversity of transcripts in human brain.Nature Genet.4256-257.Adams，M.D.，M.B.Soares，A.R.Kerlavage，C.Fields，and J.C.Venter.(1993b)Rapid cDNA sequencing(expressed sequence tags)from a dirextionally cloned human infant brain cDNA library.Nature Genet.4373-380.；Adams，M.D.，A.R.Kerlavage，R.D.Fleischmann，R.A.Fuldner，C.J.Bult，N.H.Lee，E.F.Kirkness，K.C.Weinstock，J.D.Gocayne，O.White，et al.(1995)Initial assessment of human gene diversity and expression patterns based upon 83millions nucleotides of cDNA sequence.Nature 3773-174.；Khan，A.S.，A.S.Wilcox，M.H.Polymeropoulos，J.A.Hopkins，T.J.Stevens，M.Robinson，A.K.Orpana，andJ.M.Sikela.(1992)Single pass sequencing and physical and genetic mapping of humanbrain cDNAs.Nature Genet.2180-185.；McCombie，W.R.，M.D.Adams，J.M.Kelley，M.G.FitzGerald，T.R.Utterback，M.Khan，M.Dubnick，A.R.Kerlavage，J.C.Venter，andC.Fields.(1992)Caenorhabditis elegans expressed sequence tags identity gene familiesand potential disease gene homologues.Nature Genet.1124-131.；Okubo，K.，N.Hori.R.Matoba，T.Niiyama，A.Fukushima，Y.Kojima，and K.Matsubara.(1992)LargeScale cDNA sequencing for analysis of quantitative and qualitative aspects of geneexpression.Nature Genet.2173-179.)。這種大規(guī)模隨機(jī)cDNA測(cè)序技術(shù)方法的完善必將大大加速正在進(jìn)行的人類和其它物種新基因發(fā)現(xiàn)計(jì)劃。
然而，開展大規(guī)模隨機(jī)cDNA測(cè)序工作必須克服的各種技術(shù)難點(diǎn)首先，由于各種細(xì)胞類型本身的豐度就有差異，每種細(xì)胞類型中各類基因的表達(dá)量差異極大，因此如果需要測(cè)得一種生物體的全部cDNA，就需要從處于發(fā)育的不同階段的細(xì)胞中獲取cDNA，從而使得一個(gè)完整的cDNA文庫變得極為龐大。在容量達(dá)到107個(gè)克隆的cDNA文庫中，任何組織中即使是最稀少種類的mRNA也可能被重復(fù)克隆進(jìn)去，從而使消減工作以及最稀有基因的挑選工作幾乎無法進(jìn)行。為克服這些困難，首先就迫切需要找到一種理想的構(gòu)建cDNA文庫的方法。因?yàn)橐话愕腸DNA文庫常常包含了一些豐度很高但并非想要得到的克隆(簡稱為“垃圾”克隆)(Adams，M.D.，J.M.Kelley，J.D.Gocayne，M.Dubnick，M.H.Polemeropoulos，H.Xiao，C.R.Kerlavage，W.R.McCombie，and J.Craig Venter.(1991)Complementary DNAsequencingExpressed sequence tags and Human Genome Project.Science 2521651-1656.Adams，M.D.，M.Dubnick，A.R.Kerlavage，R.Moreno，J.M.Kelley，T.R.Utterback，J.W.Nagle，C.Fields，and J.Craig Venter.(1992)Sequence identification of 2,375 humanbrain genes.Nature 355632-634.)。這些“垃圾”克隆包括(1)、僅由mRNA的Poly A尾構(gòu)成的克??；(2)、僅有極短的cDNA插入片段的克?。?3)、僅含有接頭—寡聚(dT)18引物(該引物用于與人工接頭連接的cDNA第一鏈的合成)3′部分的克隆。
(4)、嵌合克隆，指來源于在連接反應(yīng)中由幾條不同的mRNA相連接而產(chǎn)生的，易造成假象的cDNA克隆。
這些克隆的存在不僅會(huì)嚴(yán)重?fù)p害大規(guī)模測(cè)序方法在整體上的有效性，還將在很大程度上破壞所得測(cè)序結(jié)果的完整性。
除此之外，作為一條普遍的規(guī)律，某種cDNA克隆在其cDNA文庫中的豐度總是和與它相對(duì)應(yīng)的mRNA在細(xì)胞中的豐度相同。復(fù)性動(dòng)力學(xué)的分析顯示，在任一典型的體細(xì)胞中的mRNA，按其豐度分類可分為以下三類①、豐度極高的mRNA(這類mRNA通常只有10-15種，但高度重復(fù)，其含量占總含量的10-20％)；②、中等豐度的mRNA(約有1000-2000種，中度重復(fù)，占mRNA總含量的40-45％)；③、低豐度的mRNA，又稱“復(fù)雜的”mRNA(拷貝數(shù)低，這類mRNA約有15,000-20,000種，但也只占mRNA總含量的40-45％)(Bishop，J.O.，J.G.Morton，M.Rosbash，and M.Richardson.(1974)Three abundance classes in Hela cell messengerRNA.Nature 250199-204.；Davidson，E.H.and R.J.Britten.(1979)Regulation of geneexpressionPossible role of repetitives sequences.Science 2041052-1059.)。
因此，當(dāng)大多數(shù)①與②類mRNA已被鑒定后，再從文庫中取出一個(gè)新克隆時(shí)，它將有超過60％的可能性是一條已測(cè)序列的。要發(fā)現(xiàn)一條新基因就不得不做大量的重復(fù)測(cè)序工作。由于mRNA的豐度差異極大，造成大量的重復(fù)測(cè)序，即使是許多市售的高質(zhì)量cDNA文庫，也不是進(jìn)行大規(guī)模cDNA測(cè)序的理想材料。
為了克服以上困難，構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫，并對(duì)其進(jìn)行均質(zhì)化和差減化技術(shù)處理是目前較先進(jìn)而有前途的技術(shù)發(fā)展方向。
均質(zhì)化方法之一是對(duì)基因組DNA進(jìn)行飽和雜交，它雖然可以使cDNA文庫均質(zhì)化(Weissman，S.M.(1978)Mol.Biol.Med.4，133-143.；)，但這種方法實(shí)際并不可行的，因?yàn)橐峁┏鲲柡蛿?shù)量的稀少cDNA去參加雜交反應(yīng)是非常困難的。另一種方法是利用復(fù)性動(dòng)力學(xué)，按照二級(jí)動(dòng)力學(xué)的條件，對(duì)cDNA進(jìn)行退火，因?yàn)橄∩俚腸DNA退火的速度比豐度較高的cDNA更慢，因此退火后剩下的單鏈cDNA片段將在這個(gè)反應(yīng)過程中逐步均質(zhì)化(即豐度較低的cDNA有更多的機(jī)會(huì)留下，從而使cDNA文庫中各種豐度的cDNA克隆數(shù)目接近一致)(Weissman，S.M.(1987)Mol.Biol Med.4，133-143.；Ko，M.S.H..(1990)Nucleic Acids Res.18，5705-5711.；Patanjali，S.R.，Parimoo，S.& Weissman，S.M.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88.1943-1947.)。均質(zhì)化方法可使cDNA文庫中的每種克隆的出現(xiàn)頻率維持在一個(gè)較小的范圍內(nèi)。根據(jù)一些學(xué)者的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，想得到完全等克分子的cDNA文庫實(shí)際是不可能的。
均質(zhì)化的好處在于(1)均質(zhì)化cNDA文庫能加速克隆的定位，以便得到與疾病相關(guān)的基因，能提高差減雜交的效率，加速尋找表達(dá)序列在染色體上的排布及它們?cè)谝芽寺〉交蚪MDNA大片段上的位置(即外顯子作圖)。(2)通過減少彼此相同的克隆數(shù)，均質(zhì)化使在膜上高密度地覆蓋cDNA文庫成為可能(在一張非均質(zhì)化文庫膜上覆蓋107個(gè)克隆則是一項(xiàng)可望而不可及的工作)。(3)通過增加稀少的cDNA克隆的出現(xiàn)頻率而同時(shí)又減少高豐度cDNA的比率，均質(zhì)化能通過cDNA的隨機(jī)測(cè)序大大加速表達(dá)序列數(shù)據(jù)庫的發(fā)展。
選用均質(zhì)化的文庫，即所有克隆的豐度基本一致的文庫將會(huì)有利于大規(guī)模測(cè)(Soares，M.B.1994.Construction of directionally cloned cDNA libraries in phagemidvectors.In Automated DNA sequencing and analysis(ed.M.D.Adams，C.Fields andJ.C.Venter)，pp.110-114.Academic Press，New York，NY..Soares，M.B.，M.F.Bonaldo，P.Jelenc，L.Lawton，and A.Efstratiadis.1994.Consruction andcharacterization of a normalized cDNA library.Proc.Natl.Acad.Sci.919228-9232.)，這一點(diǎn)已得到Berry等人實(shí)驗(yàn)的證實(shí)(Berry，R.，T.J.Stevens，N.A.Walter，A.S.Wilcox，T.Rubano，J.A.Hopkins，J.Weber，R.Goold，M.B.Soares，and J.M.Sikela.1995.Gene-based sequence-tagged-sites(STSs)as the basis for a human gene map.NatureGenet.10415-423.；Houlgatte，R.，R.Mariage-Samson，S.Duprat，A.Tessier，S.Bentolila，B.Lamy，and C.Auffray.1995.The Genexpress IndexA resource for gene discovery andgenic map of human genome.Genome Res.5272-304.)。計(jì)算結(jié)果表明，在COt＝5.5時(shí)(其中，CO代表總DNA濃度，單位是以核苷酸數(shù)計(jì)的摩爾每升；t代表時(shí)間(復(fù)性時(shí)間)，單位是秒)，三類mRNA中高豐度類型的含量急劇減少，各類克隆的豐度也就被限制在一定的范圍之內(nèi)了(Soares，M.B.1994.Construction of directionally clonedcDNA libraries in phagemid vectors.In Automated DNA sequencing and analysis(ed.M.D.Adams，C.Fields and J.C.Venter)，pp.110-114.Academic Press，New York，NY.)。
由于在人類全部基因中已有相當(dāng)大一部分完成了鑒定工作，所以不可能再完全依賴均質(zhì)化文庫的方法來避免對(duì)那些在多種組織中都有表達(dá)的基因進(jìn)行重復(fù)測(cè)序。因此Soares等人認(rèn)為，選用可對(duì)表達(dá)量低的基因以及尚未被鑒定的基因有富集作用的差減cDNA文庫，將在大規(guī)模全部測(cè)序中發(fā)揮出越來越強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。
在為了提高文庫中最長的那些cDNA克隆的表現(xiàn)度而所作的嘗試中，Soares等人已建立了四種構(gòu)建均質(zhì)化文庫的方法(參見下面的論述)，并將其成功地應(yīng)用于構(gòu)建各種均質(zhì)化文庫(包括15個(gè)人類文庫、3個(gè)小鼠文庫、2個(gè)大鼠文庫和1個(gè)孟氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)。其中的人類與小鼠文庫已提供給“人類基因組分子分析和表達(dá)綜合協(xié)作組織”(IMAGE)(Lennon，G.G.，C.Auffray，M.Polymeropoulos，andM.B.Soares.1996.The I.M.A.G.E.ConsortiumAn integrated molecular analysis ofgenomes and their expression.Genomics 33151-152.)。而且已從這些文庫中得到了總共315,408個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，簡稱為“EST”)。該文獻(xiàn)已對(duì)上述四種使cDNA文庫均質(zhì)化的方法作一詳細(xì)說明并進(jìn)行比較分析；還對(duì)構(gòu)建差減cDNA文庫的一種簡單流程作了祥細(xì)描述。
雖然，現(xiàn)有技術(shù)中已有一些均質(zhì)化和差減方法，但是仍存在許多不足之處。在Soares等人94年發(fā)表的文章(Soares，M.B.1994.Construction of directionally clonedcDNA libraries in phagemid vectors.In Automated DNA sequencing and analysis(ed.M.D.Adams，C.Fields and J.C.Venter)，pp.110-114.Academic Press，New York，NY.)中詳細(xì)描述了一種均質(zhì)化方法(即Soares方法1)。該方法被用于構(gòu)建1NIB與1NFLS均質(zhì)化文庫，并且從這兩個(gè)文庫中分別獲得了45,192條和86,088條表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)。通過這一均質(zhì)化方法，可以將克隆的豐度限定在一狹窄范圍。但是，用Southern分析法對(duì)這兩個(gè)文庫進(jìn)行的廣泛鑒定表明，在應(yīng)用Soares方法1的均質(zhì)化過程中，截短的克隆時(shí)常會(huì)比它們對(duì)應(yīng)的未截短的克隆更容易被保留下來。
為何在用Soares方法1(Soares，M.B.1994.Construction of directionally clonedcDNA libraries in phagemid vectors.In Automated DNA sequencing and analysis(ed.M.D.Adams，C.Fields and J.C.Venter)，pp.110-114.Academic Press，New York，NY.)進(jìn)行均質(zhì)化過程中，截短的cDNA會(huì)比它們對(duì)應(yīng)的未截短更容易保留下來呢？為了弄清這一問題，不妨先看一下Soares方法1的簡要步驟(1)由定向克隆的cDNA文庫制備的單鏈DNA與寡聚(dT)18引物退火。
(2)在脫氧核苷酸及二脫氧核苷酸存在下，進(jìn)行人為控制下的引物延伸反應(yīng)，產(chǎn)生長約200-300個(gè)核苷酸的非編碼鏈3′端延伸產(chǎn)物。
(3)HAP(羥基磷灰石柱)層析，純化上一步驟產(chǎn)生的部分雙鏈環(huán)狀DNA。
(4)將步驟(3)所得的部分雙鏈環(huán)狀DNA進(jìn)行解鏈，并使其在一個(gè)相對(duì)較低的COt下復(fù)性(COt約為5-10)。
(5)用HAP純化剩下的單鏈環(huán)狀DNA，即得均質(zhì)化文庫。
(6)將單鏈環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)化為雙鏈環(huán)狀DNA。
(7)由穿孔法將雙鏈質(zhì)粒注入宿主菌。
由于截短的cDNA相對(duì)于它們所對(duì)應(yīng)的未截短cDNA而言產(chǎn)生的概率較低，因此，在復(fù)性反應(yīng)中，cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物將更能與和它有重疊區(qū)的未截短cDNA復(fù)性，而不是與它本身的模板(即截短的cDNA)復(fù)性。另一方面，未截短cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物也是最可能與其本身的模板(而非截短的cDNA)復(fù)性。這不僅因?yàn)槲唇囟蘡DNA的數(shù)量高于截短的cDNA，還因?yàn)橛晌唇囟炭寺U(kuò)增出的短片段與一個(gè)截短的克隆之間存在重疊區(qū)的可能性很小。這樣造成的結(jié)果是，未截短的單鏈克隆很可能將與不止一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物(這些擴(kuò)增片段相互無重疊區(qū))復(fù)性，而截短的克隆將很可能保持單鏈狀態(tài)，從而在HAP篩選后得以保留在洗脫液中，成為均質(zhì)化文庫的組成部分。
為此Soares等人設(shè)計(jì)了方法2-1與2-2(即Soares方法2-1與2-2)，二者除雜交條件不同外，其余步驟完全一樣。借此，可以以由原始文庫制備的質(zhì)粒DNA為模板，在體外合成RNA，并將該RNA用作與以單鏈環(huán)狀DNA形式存在的相同文庫進(jìn)行雜交的驅(qū)逐片段(driver)(即與文庫雜交的核酸片段)。這兩種改進(jìn)方法提高了均質(zhì)化文庫中最長的那些cDNA克隆的表現(xiàn)度。
但是，在每一個(gè)以Soares方法2-1和方法2-2構(gòu)建的文庫中，Soares等都發(fā)現(xiàn)存在一些遠(yuǎn)比其它克隆更難以實(shí)現(xiàn)均質(zhì)化的cDNA克隆(如在5Nb2HFLS20W肝/脾文庫中的α-球蛋白基因及乳房文庫中的G3PD基因)。雖然這一問題在方法2-3中已有改進(jìn)，但其均質(zhì)化程度仍難以達(dá)到由Soares方法1所得均質(zhì)化程度相同水平。此外，方法2-3并非一個(gè)真正的均質(zhì)化過程，因?yàn)槠淠康牟⒎鞘顾衏DNA克隆的豐度達(dá)到相等(或接近)，而在于顯著減少(甚至消除，視使用的COt而定)豐度最高的那些克隆的表現(xiàn)度。
雖然Soares等人在綜合Soares方法1與方法2優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上嘗試建立了方法3與方法4，以便既能達(dá)到可由Soares方法1獲得的充分的均質(zhì)化程度，又能達(dá)到可由方法2-1，2-2及2-3獲得的最長cDNA克隆的高度表現(xiàn)度。但是仍只是局部的改進(jìn)，所以效果并沒有很大提高。
因此，本領(lǐng)域迫切需要高效率且全面地進(jìn)行大規(guī)模隨機(jī)cDNA測(cè)序的技術(shù)方案，以便有力地推進(jìn)分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、醫(yī)藥和育種等領(lǐng)域的發(fā)展。
本發(fā)明的目的在于提供一種適于高效地進(jìn)行大規(guī)模cDNA測(cè)序的方法，該方法可應(yīng)用于各種真核生物，尤其高度植物和動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物)的cDNA大規(guī)模測(cè)序。
本發(fā)明的發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種cDNA測(cè)序方法，它包括以下步驟(1)以生物體的組織為材料，構(gòu)建cDNA起始文庫，其中該文庫中的插入片段長度為0.5-3.0kb；(2)按設(shè)定的分檔Cot值，對(duì)步驟(1)的cDNA起始文庫進(jìn)行均質(zhì)化，從而得到對(duì)應(yīng)于分檔Cot值的cDNA均質(zhì)化文庫，其中Co是總DNA濃度，單位是以核苷酸數(shù)計(jì)的摩爾每升而t是復(fù)性時(shí)間，單位是秒；
(3)對(duì)于前一步驟的各cDNA均質(zhì)化庫，分別挑選5-500個(gè)克隆進(jìn)行DNA測(cè)序；(4)用已測(cè)序的cDNA克隆來合成對(duì)應(yīng)于已測(cè)序列的探針，并將該合成的探針與前一步驟中的cDNA均質(zhì)化庫進(jìn)行雜交差減，從而從該cDNA庫中除去已測(cè)序的cDNA克隆，并形成差減化處理過的均質(zhì)化cDNA庫；(5)重復(fù)步驟(3)和(4)1-5,000次。
本發(fā)明的發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，為了更有效和更全面地測(cè)定在某一生物體、某一組織、或某一細(xì)胞中表達(dá)的基因，可以通過以下措施來實(shí)現(xiàn)構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA起始文庫以保證文庫中克隆對(duì)應(yīng)于幾乎所有或所有的mRNA；對(duì)Cot值進(jìn)行分檔，以便在均質(zhì)化過程中各種豐度的cDNA被保留在一種或多種cDNA均質(zhì)化文庫中；和通過差減雜交，從均質(zhì)化cDNA庫中除去已被測(cè)序的cDNA克隆，使雜交差減的cDNA均質(zhì)化庫保留未被測(cè)序的cDNA克隆，從而顯著提高下一輪測(cè)序的效率。
為了研究基因在不同組織的表達(dá)情況，本發(fā)明方法還可以用生物體不同組織為材料，構(gòu)建不同組織的cDNA起始文庫；并分別均質(zhì)化以得到不同組織的均質(zhì)化庫；在不同組織的cDNA均質(zhì)化庫之間進(jìn)行雜交差減，以形成雜交差減化的均質(zhì)化cDNA庫。此外，還可以先在不同組織的cDNA起始文庫之間進(jìn)行差減雜交，以獲得含有差異表達(dá)cDNA的起始文庫。
在本發(fā)明中，“不同組織”指因生物體不同，類型不同，發(fā)育階段不同和/或病理狀況不同等而導(dǎo)致的不完全相同的組織。不同組織的例子包括(但并不限于)同一生物體的不同類型的組織(如人的腦和肌肉)、同一生物體不同發(fā)育階段的組織(如胚胎期和成年期的腦)、同一生物體的正常組織和病理組織(如正常的腦和患老年癡呆病的腦組織)、和不同生物體的組織(如大鼠和兔的腦組織)等。
對(duì)于構(gòu)建的待測(cè)序的某個(gè)cDNA文庫，先用不同組織的cDNA起始文庫或cDNA均質(zhì)化文庫進(jìn)行雜交差減，可以有效快速地測(cè)得所需的表達(dá)存在差異的cDNA。具體地，對(duì)于待測(cè)序的病理組織cDNA文庫，可以用正常組織的cDNA文庫進(jìn)行雜交差減，以便快速有效地獲得在病理組織中表達(dá)存在差異的cDNA克隆并測(cè)序。類似地，用不同發(fā)育階段的同一組織類型的cDNA文庫進(jìn)行雜交差減，就可以獲得在不同發(fā)育階段表達(dá)存在差異的cDNA克隆。
此外，為了進(jìn)一步提高測(cè)序效率，減少重復(fù)測(cè)序，在雜交差減步驟中，還可根據(jù)已知的cDNA序列信息(尤其如果對(duì)于某一物種(如人)已經(jīng)知道較多的DNA序列信息)人工合成探針，或者利用其他已有的測(cè)序過的克隆來合成相應(yīng)的探針；并將該合成的探針與cDNA起始文庫或上一步驟中的cDNA均質(zhì)化庫進(jìn)行雜交差減。
在本發(fā)明中所用的DNA測(cè)序方法可選用本領(lǐng)域常規(guī)的測(cè)序方法，可以手工進(jìn)行，也可以用自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行。一種有用的DNA測(cè)序程序包括對(duì)于測(cè)定的序列片段，判斷是否是新的cDNA克??；對(duì)于新的cDNA克隆，進(jìn)行5′端完整性分析；對(duì)于5′端完整的新cDNA克隆，繼續(xù)測(cè)序直到獲得全長序列。
在本發(fā)明中，在均質(zhì)化過程中，通常將Cot值被分成3-8檔。也可以分成更多的檔(如10檔)或更少檔(如2檔)。然而較佳地，分成3-5檔。
一種方案是將Cot值被分成如下的三檔0＜Cot≤1、Cot＝1-50和Cot≥50，從而使相同的cDNA起始文庫可以在不同Cot值得到對(duì)應(yīng)的，選自下組的均質(zhì)化庫(a)高重復(fù)cDNA均質(zhì)化庫；(b)中等重復(fù)cDNA均質(zhì)化庫；和(c)低重復(fù)cDNA均質(zhì)化庫。另一種方案是將Cot值分成如下的四檔0＜Cot≤0.5；Cot＝0.5-10；Cot＝10-50和Cot≥50。尤其是為了測(cè)定低豐度的cDNA，可以在Cot值為0-5范圍內(nèi)多劃分幾檔。
獲得高質(zhì)量的cDNA起始文庫(即含有大多數(shù)或全部cDNA，并且垃圾克隆少)也是成功進(jìn)行測(cè)序的關(guān)鍵。為此，應(yīng)采用合適的高效擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)抽提的mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，以形成相應(yīng)的cDNA，這些技術(shù)包括(但并不限于)混合逆轉(zhuǎn)錄酶技術(shù)、SMART PCR技術(shù)、核苷酸加帽技術(shù)和它們的組合。此外，必須對(duì)擴(kuò)增判斷進(jìn)行分離，以去除過短的(如小于200bp)片段。再將符合長度要求的片段插入合適的載體，構(gòu)建成cDNA起始文庫。
一種可用于本發(fā)明的構(gòu)建cDNA起始文庫的方法包括抽提mRNA，通過選自下組的技術(shù)對(duì)mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，以形成相應(yīng)的cDNA混合逆轉(zhuǎn)錄酶技術(shù)、SMART PCR技術(shù)、核苷酸加帽技術(shù)和它們的組合；分離收集0.5-3.0kb的cDNA片段；將分離的cDNA片段克隆人合適的載體；分離含0.5-3.0kb插入片段的載體；轉(zhuǎn)化合適的菌體，得到cDNA起始文庫。
其中，分離收集0.5-3.0kb的cDNA片段可通過電泳割膠或凝膠層析柱純化技術(shù)；而分離含0.5-3.0kb插入片段的載體可通過HPLC反相層析。
作為本發(fā)明的發(fā)明點(diǎn)之一，本方法發(fā)明首先提出了構(gòu)建高質(zhì)量cDNA起始基因文庫的一系列技術(shù)步驟，其目的在于從一開始就最大限度地減少“垃圾”克隆進(jìn)入各種不同組織的cDNA起始基因文庫的數(shù)量。其中，通過高效的核酸擴(kuò)增技術(shù)步驟可擴(kuò)增出最完整長度的cDNA，克隆進(jìn)載體之前和之后都被純化處理，這些技術(shù)步驟可確保構(gòu)建的cDNA起始基因文庫中的cDNA足夠長。
此外，據(jù)Soares，et al(Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.91，pp.9228-9232，)報(bào)道，約有13％的IB文庫(來源于人腦mRNA)克隆子缺少poly(A)尾。據(jù)估計(jì)這可能是由于擴(kuò)增時(shí)失常引發(fā)所造成的。因此，為了進(jìn)一步提高cDNA起始文庫的質(zhì)量，可以用結(jié)合有d(T)18-25的親和柱進(jìn)行處理可大大減少cDNA起始基因文庫中缺少poly(A)尾的克隆子數(shù)量，以確保構(gòu)建出的cDNA起始基因文庫質(zhì)量更高。
為了測(cè)定在某一生物體中表達(dá)的各種基因，為了確保高效率地大規(guī)模隨機(jī)cDNA測(cè)序工作的順利進(jìn)行，一種有利的方法是構(gòu)建足夠多或所有的來源該物種(如人)的這種高質(zhì)量的cDNA起始文庫。例如，這些cDNA起始文庫可以是人類、小鼠、大鼠及血吸蟲的cDNA起始文庫，也可以是某物種的正常組織或典型病理組織的cDNA起始庫，或不同發(fā)育階段組織的cDNA文庫。用于構(gòu)建cDNA起始文庫的材料可以是各種組織。例如，可包括(但不限于)源自下列材料的cDNA起始庫(a)人嬰兒腦，人胎肝脾，人足孕胎盤，人8-9周胎盤，人乳房，成人腦，人視網(wǎng)膜，人松果體腺，人卵巢癌，人黑素細(xì)胞，人胎心，人甲狀旁腺癌，人衰老成纖維細(xì)胞，人多發(fā)性硬化病灶，人胎肺，(b)交配后19.5天的小鼠胚胎，交配后17.5天的小鼠胚胎，交配后13.5-14.5天的小鼠胚胎，(c)大鼠心，大鼠腎；(d)8周齡成體血吸蟲等。
足夠多的高質(zhì)量cDNA起始基因文庫的必要性，是因?yàn)樵谀撤N單獨(dú)的細(xì)胞類型中，估計(jì)有三分之一的mRNA在每個(gè)細(xì)胞中的表達(dá)量只有1-10個(gè)拷(Galau，G.A.，Britten，R.J.&Davidson，E.H.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，1020-1023.)。而一種單獨(dú)的細(xì)胞類型可以表達(dá)出1萬條乃至更多的mRNA。如果每條mRNA都產(chǎn)生出兩到三條分開的500bp至2000bp的cDNA片段，那么在經(jīng)過完全的均質(zhì)化之后，任一單獨(dú)的cDNA片段的表現(xiàn)度將是1/30,000。當(dāng)cDNA的來源于復(fù)雜組織時(shí)，單獨(dú)片段的表現(xiàn)度將降得更低。如果一個(gè)文庫來源于在不同階段表達(dá)的所有mRNA，則每一片段的表現(xiàn)度將低于1/100,000。
為此，可通過以下的一系列步驟來獲得具有完全代表性(即各類型細(xì)胞中的表達(dá)序列都可得到體現(xiàn))的文庫。這些步驟為從適當(dāng)數(shù)量的器官或組織出發(fā)分別制備每一種器官或組織的文庫并使之初步均質(zhì)化，對(duì)每個(gè)文庫再分別進(jìn)行專門的均質(zhì)化。
其次，作為本發(fā)明的發(fā)明點(diǎn)之二，本發(fā)明方法在構(gòu)建了足夠多的高質(zhì)量cDNA起始基因文庫的基礎(chǔ)上，提出了對(duì)這種高質(zhì)量的cDNA起始庫在足夠多不同的Cot值下進(jìn)行均質(zhì)化，從而使某一特定正常組織的或典型病理組織的所有cDNA分布在足夠多的不同的均質(zhì)化小庫中，每個(gè)這種小庫都代表了均質(zhì)化程度更高，針對(duì)性更強(qiáng)的一類cDNA集合。來源于同一特定正常組織或典型病理組織cDNA起始庫的這些均質(zhì)化小庫的總和就構(gòu)成該特定正常組織或典型病理組織cDNA的總和。
此外，還可通過差減化步驟可得到只在或主要在該特定正常組織或典型病理組織表達(dá)的多種均質(zhì)化小庫。如上所述，差減化可包括用已測(cè)過的cDNA克隆所制備的探針對(duì)cDNA起始庫或小庫雜交以去除已測(cè)過的cDNA克隆。
已有技術(shù)中，，研究人員往往期望找到極少的幾個(gè)最佳Cot值來解決問題，而實(shí)際上并未成功。他們往往把雜交當(dāng)作簡單的二級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，并且預(yù)計(jì)，當(dāng)混合物中最稀有組分有50％復(fù)性時(shí)，最豐富組分在單鏈DNA中的表現(xiàn)度將不超過最稀有的組分的兩倍。實(shí)際上的雜交情況則遠(yuǎn)比這復(fù)雜。最豐富的組分雜交比預(yù)期的要快。在一些早期的實(shí)驗(yàn)中，最豐富組分在單鏈DNA中表現(xiàn)度甚至顯著低于較稀有的組分。這一效應(yīng)主要原因很可能是雙鏈片段與剩下的單鏈cDNA繼續(xù)雜交。因此，現(xiàn)有技術(shù)中的解決方法是選擇合適的復(fù)性時(shí)間以及復(fù)性反應(yīng)物的濃度，以便將上述效應(yīng)減少到一個(gè)尚能讓人接受的水平。此外，在反應(yīng)的不同階段加入羥基磷灰石以去除雙鏈產(chǎn)物的方法，則可使該效應(yīng)進(jìn)一步降低。但即便如此，取極少的幾個(gè)Cot值進(jìn)行均質(zhì)化和差減化的方法仍只能部分解決問題，效果仍不能令人滿意。
此外，Smith，M.J.，Brititen，R.J.& Davidson，E.H.(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA72，4805-4809.；Marrow，J.F.(1974)Doctoral thesis(Stanford Univ.，Stanford，CA)，pp，101-190.Mol.Cell.Biol.10，243-253.的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與通過二級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)規(guī)律而對(duì)復(fù)性反應(yīng)作出的預(yù)測(cè)有兩點(diǎn)不符。其一，豐度最高的cDNA減少的速率比預(yù)期的要快，且它們?cè)趩捂溄M分的絕對(duì)數(shù)量上可以低于某些低豐度類群。其二，即使是在最短的復(fù)性時(shí)間里，從雙鏈組分中仍可找到相當(dāng)數(shù)量的稀有種類cDNA(這兩點(diǎn)是與預(yù)測(cè)不符的兩點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果)。對(duì)第一個(gè)反常規(guī)現(xiàn)象的解釋在該文獻(xiàn)上有所討論(Smith，M.J.，Brititen，R.J.& Davidson，E.H.(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72，4805-4809.；Marrow，J.F.(1974)Doctoral thesis(Stanford Univ.，Stanford，CA)，pp，101-190.Mol.Cell.Biol.10，243-253.)。這是因?yàn)樵趶?fù)性過程中，如果存在同源區(qū)，則來自同一種類的mRNA的長片段與短片段就會(huì)復(fù)性而產(chǎn)生出一條單鏈尾巴。這樣一種結(jié)構(gòu)能夠與剩余的單鏈DNA中的同源片段繼續(xù)配對(duì)，從而使反應(yīng)不在遵循二級(jí)動(dòng)力學(xué)的機(jī)制。這樣的動(dòng)力學(xué)行為導(dǎo)致了單鏈DNA向雙鏈DNA組分的額外轉(zhuǎn)化。于是，即使是象c-myc與TCR這樣罕有的mRNA也會(huì)在任一復(fù)性時(shí)間下同時(shí)出現(xiàn)在單鏈DNA組分與雙鏈DNA組分之中。
Soares，et al(Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.91，pp.9228-9232，)在兩個(gè)相差不大的Cot值(即5.5和2.5)下分別構(gòu)造了兩個(gè)人嬰腦文庫(1NIB文庫和2NIB文庫)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)某些克隆在1NIB文庫中出現(xiàn)頻率減少但在2NIB文庫中卻增加了。這說明不同Cot值對(duì)不同豐度的mRNA在cDNA文庫中的出現(xiàn)頻率有形成。
以腦為例，基于腦的mRNA豐度估計(jì)值的計(jì)算表明，最佳富集程度在COt為5-10時(shí)獲得，但是也只是相對(duì)多的部分cDNA而已。如果COt太小(小于等于1)，則僅有極高豐度(第一類)mRNA被富集；而中度豐度(第二類)mRNA不能被富集。另一方面，如果COt值過高(大于等于50)，則第一類mRNA的富集程度會(huì)變得不那么顯著，因?yàn)榇藭r(shí)復(fù)雜性高的(第三類)mRNA的表現(xiàn)度也變得高了。因此，本發(fā)明提出對(duì)于cDNA起始文庫，只有根據(jù)不同的材料來源和/或測(cè)序需要取多個(gè)不同的Cot值構(gòu)建一系列的均質(zhì)化庫。才能確保所有的cDNA都被分布在不同的均質(zhì)化庫中。
作為，本發(fā)明的發(fā)明點(diǎn)之三，是在對(duì)均質(zhì)化cDNA庫每次挑取克隆測(cè)序后，都對(duì)前一步驟中的均質(zhì)化cDNA庫進(jìn)行循環(huán)性雜交差減，從而除去已測(cè)序克隆，并保留未測(cè)序克隆，供下一輪測(cè)序之用。因此顯著提供了測(cè)序效率，大大降低了重復(fù)測(cè)序的可能性。
具體地說，本發(fā)明方法可包括以下主要步驟(1)構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA起始庫。
構(gòu)建cDNA的一般方法參見上文，較佳地，本發(fā)明方法在對(duì)mRNA進(jìn)行擴(kuò)增形成其相應(yīng)cDNA時(shí)宜選用選自下組的一種或多種技術(shù)混合逆轉(zhuǎn)錄酶技術(shù)(使用FD耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶。復(fù)旦學(xué)報(bào)37(2)225-228；中國生物化學(xué)和分子生物學(xué)報(bào)14(2)170-174，1998)、SMART PCR技術(shù)(Clontech，SMARTM*PCR cDNALibrary Construction Kit User Manual(PT3000-1)、核苷酸加帽技術(shù)等(KazuoMaruyama and Sumio Sugano(1994)Oligo-cappinga simple methods to replace thecap structure of eukaryotic mRNAs with oligoribonucleotides.Gene 138，171-174.Carninci，P.et al.(1996)High-efficiency full-length cDNA cloning by biotinylatedCAP trapper.Genomics 37，327-336.)，這樣可以提高產(chǎn)物中全長cDNA的比例。其次，為了確保cDNA起始文庫中全長cDNA克隆的比例，在擴(kuò)增出cDNA后，宜分離具有所需長度(通常至少200bp)的擴(kuò)增產(chǎn)物，例如通過走電泳割膠或凝膠層析柱純化收集0.5-3.0Kb的cDNA片段，然后再克隆進(jìn)合適的載體中。最后形成的的載體過HPLC反向柱，并分離出比載體增加插入片段長度(如0.5-3.0-2kb)的峰，收集質(zhì)粒然后轉(zhuǎn)化進(jìn)合適的菌體，就得到了高質(zhì)量的cDNA起始庫。
通過以上步驟，可以使得到的高質(zhì)量cDNA起始庫中的“垃圾”克隆所占的比例少到可忽略不計(jì)的程度。
一種有利的策略是盡可能得到某一種生物體足夠多的不同的正常組織或典型病理組織的高質(zhì)量的cDNA起始文庫，這樣就可以獲得覆蓋該生物體幾乎全部或全部表達(dá)基因的cDNA起始文庫。
(2)按Cot值分檔進(jìn)行均質(zhì)化接著，按已有均質(zhì)化方法，對(duì)前一步驟構(gòu)建好的高質(zhì)量cDNA起始庫分別進(jìn)行均質(zhì)化，不同點(diǎn)在于，將Cot值進(jìn)行分檔，按不同的Cot值分別進(jìn)行均質(zhì)化。因?yàn)椴淮嬖谝粋€(gè)所謂的“最佳Cot值”，按此“最佳Cot值”既可以實(shí)現(xiàn)均質(zhì)化又可保留對(duì)應(yīng)于各種豐度cDNA克隆。相反，只有在不同Cot值下構(gòu)建一系列的均質(zhì)化庫才能確保所有的cDNA都被分布在不同的均質(zhì)化庫中。
具體操作時(shí)可根據(jù)不同來源的cDNA起始庫需要取不同足夠多個(gè)Cot值(Cot定義Co代表總DNA濃度，單位是以核苷酸數(shù)計(jì)的摩爾每升；t代表時(shí)間，單位是秒。)。
例如，把Cot值分為高、中、低三檔，每一檔中再取若干個(gè)不同的Cot值，使同一cDNA起始庫分別形成三大類均質(zhì)化庫，即高重復(fù)cDNA均質(zhì)化庫(Cot值≤1)、中度重復(fù)cDNA均質(zhì)化庫(Cot值＝1-50)、低重復(fù)或稀有cDNA均質(zhì)化庫(Cot值≥50)，每一大類均質(zhì)化還可根據(jù)需要進(jìn)一步細(xì)分出更小的均質(zhì)化庫。這一過程簡單圖示如

圖1所示。
(3)預(yù)先雜交差減該預(yù)先雜交差減步驟是可選的。為了更有針對(duì)性地或更快速地找到目的基因，可以對(duì)均質(zhì)化文庫進(jìn)行預(yù)先雜交差減。例如在不同組織類型(如腦和肝臟)的相同豐度(如高豐度)cDNA均質(zhì)化文庫之間進(jìn)行雜交差減，以便快速測(cè)定表達(dá)存在差異的cDNA?；蛘?，在同一組織(如腦組織)的正常組織和病理組織的cDNA均質(zhì)化文庫之間進(jìn)行預(yù)先雜交差減?；蛘咴谕唤M織的正常組織的不同豐度的cDNA均質(zhì)化文庫(如高豐度cDNA均質(zhì)化庫和低豐度cDNA均質(zhì)化庫)之間進(jìn)行預(yù)先雜交差減(從而差減掉高豐度cDNA)，以便著重測(cè)定低豐度的cDNA。
因此，按已有均質(zhì)化方法，在不同的cDNA庫之間進(jìn)行預(yù)先差減性均質(zhì)化后，可以得到差減化的均質(zhì)化庫。
這一過程如圖2所示。其中用非A cDNA起始庫(包括B起始庫，C起始庫……)作模板合成DNA或RNA片段作為驅(qū)逐片段(Driver即與始文庫雜交的片段，可以是單鏈DNA或RNA)。
(4)挑選克隆進(jìn)行測(cè)序按本領(lǐng)域常規(guī)的測(cè)序方法，對(duì)上述步驟得到的未經(jīng)過或經(jīng)過預(yù)先雜交差減處理的cDNA均質(zhì)化文庫或，隨機(jī)地挑選5-500個(gè)克隆進(jìn)行大規(guī)模cDNA測(cè)序，判斷是否為新的cDNA克隆。如果是新的，做5’端完整性分析，直到拿到全長序列。
(5)雜交差減所有已測(cè)出的較長cDNA克隆形成了已測(cè)序cDNA庫，并以此為基礎(chǔ)合成探針，與前一步驟得到的cDNA起始庫或均質(zhì)化庫或差減化的均質(zhì)化文庫雜交。結(jié)果排除上一步驟文庫中已測(cè)過的cDNA克隆，并保留未測(cè)過的克隆，因此進(jìn)一步顯著了提高大規(guī)模測(cè)序的效率。保留下的未測(cè)序克隆構(gòu)成了差減化處理過的均質(zhì)化cDNA庫，用于下一循環(huán)的測(cè)序。
(6)重復(fù)上述的(4)測(cè)序和(5)雜交差減步驟通過重復(fù)測(cè)序和(5)雜交差減步驟，便可以高效地測(cè)得新序列，并且又保留未測(cè)序cDNA供下一步測(cè)序。重復(fù)該循環(huán)的次數(shù)沒有限制，通常為1-5000次?？梢园磳?shí)際情況和需要決定循環(huán)次數(shù)，例如根據(jù)是否獲得了所需基因，每個(gè)循環(huán)中被測(cè)序克隆的數(shù)目等。
這一過程的示意圖參見圖3。
以下通過不起限定作用的實(shí)施例進(jìn)一步測(cè)序本發(fā)明，這些實(shí)施例僅用于闡述目的。
實(shí)施例通用方法(A)、HPLC反相層析反相層析(Reversed phase chrometography，RPC)分辨率高，而且因材料耐壓，可在高壓液相層析柱上使用，使分離高效、快速，因此在核酸分離純化中應(yīng)用越來越普遍，并且具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)分離不同大小的寡核苷酸分辨率好，在分離10-130的共聚腺嘌呤核苷酸時(shí)，可將相差一個(gè)核苷酸的片段分開，而且回收率高，回收樣品純度也好。
(2)分離DNA限制性內(nèi)切酶片段可分離大小僅相差4個(gè)堿基的片段。
(3)分離純化質(zhì)粒DNA cc型分子質(zhì)粒DNA粗制品在RPC柱上分離時(shí)，可得到純化的cc分子。
此外，HPLC柱可用于分離純化質(zhì)粒，它可除掉污染性的蛋白和其它核酸(如高分子量RNA)，并可使相差一兩百堿基對(duì)的不同質(zhì)粒得到較好的分離。通?？蛇x用如下操作條件柱Bio-Gel質(zhì)粒柱柱大小50 7.8mm
Cetolog號(hào)碼125-0537樣品PUC18100ug流動(dòng)相A0.02M磷酸鉀，50％甲酰胺，pH6.7B0.02M磷酸鉀，50％甲酰胺，pH6.7 1.5MKCl梯度50％B 10min，50-70％B 30min流速1.0ml/min檢測(cè)1uv@270nm(B)、羥基磷灰石柱層析以羥基磷灰石分離單鏈DNA與雙鏈DNA的方法，在文獻(xiàn)中有詳細(xì)記載(Britten，R.J.，Graham，D.E.& Neufeld，B.R.(1974)Methods Enzymol.29，363-418.)。用于洗脫DNA單鏈組分與雙鏈組分的磷酸二氫鈉濃度分別為0.1M與0.35M。但是，小于200bp的雙鏈DNA與實(shí)驗(yàn)中經(jīng)HaeIII酶切M13mp13DNA而得的各種長度的單鏈組分一樣，都會(huì)被濃度為0.1M的磷酸緩沖液洗脫。為了避免這類極小雙鏈DNA片段對(duì)單鏈DNA洗出液造成污染，所有的均質(zhì)化實(shí)驗(yàn)過程均采用大于400bp的DNA組分。
將伯樂公司(Bio-Rad)生產(chǎn)的羥基磷灰石(型號(hào)為DNA-grade Bio-Gel HTP)按1∶10的比例懸浮于含0.1％SDS的0.01M磷酸二氫鈉溶液(pH7.0)中。將這一勻漿灌入帶有水夾套的層析柱中(床體積為1.0ml)，洗脫液流速定為8-10ml/hr。其結(jié)合與洗脫的特性已通過M13mp18單鏈DNA的HaeIII酶切產(chǎn)物以及(life Technologies公司出品的)1Kb雙鏈DNA序列梯度(用作雙鏈DNA參照物)而完成了測(cè)試。使用Neslab生產(chǎn)的循環(huán)式水浴裝置將層析柱溫度保持在60℃。單鏈及雙鏈DNA洗脫條件的校準(zhǔn)工作是通過使用其濃度從0.05M至0.4M，以每級(jí)濃度0.02M遞增的一系列分級(jí)梯度磷酸二氫鈉緩沖液而完成的。所有緩沖液中均含有0.1％SDS。
(C)、洗脫液(峰)的脫鹽和濃縮從羥基磷灰石柱上洗脫下來的單鏈DNA并不適于直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這是因?yàn)?i)洗出液中存在高濃度的磷酸二氫鈉及SDS，將會(huì)抑制TaqDNA多聚酶的活性。(ii)洗出液中單鏈DNA的濃度太低。為此可選用以下幾種方法解決問題，即(Centricon-30過濾，Glassmilk純化(生產(chǎn)商提供手冊(cè))，正丁醇與異丁醇濃縮，冰凍干燥后透析等等之中，作者選擇Centricon-30過濾法來使微量的單鏈DNA回收(Stafford，D.W.& Bieber，D.(1975)Biochem.Biophys.Acta 378，18-21.)。因?yàn)檫@一方法有高達(dá)90％的回收率并能徹底地將鹽分除去。
將層析柱洗出液以離心的方法使其在Centricom-30型濾膜上過濾，從而把洗出液體積由開始時(shí)的10-12ml濃縮為100-200ul，并用無菌水或TE緩沖液(10mMTris.HCl，pH8.0/1mM EDTA)對(duì)其清洗至少三次。實(shí)施例1構(gòu)建來源于人正常組織或典型病理組織的高質(zhì)量的cDNA起始庫以及只在正常人嬰兒腦中表達(dá)的均質(zhì)化和差減化cDNA小庫并進(jìn)行大規(guī)模cDNA測(cè)序在本實(shí)施例中用于構(gòu)建cDNA起始庫的構(gòu)建材料包括下列材料(隨著測(cè)序的不斷深入，或者根據(jù)需要還可增加構(gòu)建來源于其它正常組織或典型病理組織材料的cDNA起始庫)人嬰兒腦，人胎肝脾，人足孕胎盤，人8-9周胎盤，人乳房，成人腦，人視網(wǎng)膜，人松果體腺，人卵巢癌，人黑素細(xì)胞，人胎心，人甲狀旁腺癌，人衰老成纖維細(xì)胞，人多發(fā)性硬化病灶，人胎肺。
具體地，這些材料是(1)、人嬰腦是來自一個(gè)死于脊柱肌肉萎縮的72天的女性嬰兒。
(2)、人肝脾來自一個(gè)胚胎20周的正常女性胎兒。
(3)、所有的細(xì)胞Poly(A)+mRNA來自乳房整形手術(shù)取出的正常乳房組織。
(4)、所有成人腦的RNA來自于一個(gè)死于主動(dòng)脈瘤破裂的55歲的男子，腦組織(包括左右大腦、頂骨部、顳部、枕部皮層皮層下白質(zhì)、基底神經(jīng)節(jié)、丘腦、小腦、中腦、腦橋、延髓)取自其死后17-18小時(shí)。
(5)、所有的人正常視網(wǎng)膜細(xì)胞的RNA來自一個(gè)55歲的男性高加索人種。
(6)、正常人的松果體取自三個(gè)不同的人種1、48歲的男性高加索人，2、18歲的女性高加索人，3、20歲的美州黑人。
(7)、所有人卵巢癌細(xì)胞的mRNA來自一個(gè)36歲的三期乳頭狀囊腺癌病人，已發(fā)生表面擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。
(8)、所有人黑色細(xì)胞DNA取自正常包皮。
(9)、正常胎心、胎肺取自胚胎19周的標(biāo)本。
(10)、人甲狀旁腺瘤取自偶發(fā)性腺瘤。
(11)、胞質(zhì)mRNA取自人正常衰老成纖維細(xì)胞，該細(xì)胞由表皮正常的成纖維細(xì)胞質(zhì)代其細(xì)胞表型為胞體增大、扁平、停止分裂(加5-溴尿嘧啶，(48小時(shí)后摻入率小于2％)。
在構(gòu)建過程中，人嬰兒腦用Lamda(λ)BA載體構(gòu)建，其余材料均用pT7T3-Pac載體構(gòu)建cDNA文庫。胚胎肝/脾cDNA文庫的克隆位點(diǎn)在PacI和EcoR I酶切點(diǎn)之間，嬰兒腦文庫的克隆位點(diǎn)在NotI和HindIII之間，其余的均在NotI和EcoR I之間。
以正常女嬰腦的cDNA文庫為例，其構(gòu)建過程如下從正常女嬰腦(72天)中提取Poly(A)+RNA用于構(gòu)建cDNA文庫(IB)。合成寡聚核苷酸5’-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAAT18-3’作為合成單鏈cDNA的引物，這段寡聚核苷酸含有一個(gè)NotI位點(diǎn)的(下劃線部分)。采用核苷酸加帽技術(shù)擴(kuò)增，這樣可以提高產(chǎn)物中全長cDNA的比例。走電泳割膠收集2.0Kb的cDNA片段，然后將cDNA與HindIII接頭連接，然后經(jīng)NotI酶切與含有HindIII和NotI位點(diǎn)的噬菌體L-BA連接，載體L-BA由pEMBL-9(+)衍生而來(Dente，L.，Cesareni，G.&Cortese，R.(1983)Nucleic Acids Res.11，1645-1655.)。L-BA帶有氨芐抗性基因，質(zhì)粒和f1噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)及多克隆位點(diǎn)(5’HindIII-BamHI-NotI-EcoRI3’)。將重組噬菌體與輔助噬菌體M13K07(Vieira，J.and J.Messing.1987.Production of single-strandedplasmid DNA.Methods Enzymol.1533-11.)感染進(jìn)入細(xì)菌，使雙鏈DNA轉(zhuǎn)變成含cDNA插入片段的單鏈環(huán)狀DNA。
按與構(gòu)建正常女嬰腦的cDNA文庫相同的方式構(gòu)建上述其他材料的cDNA文庫，不同點(diǎn)僅在于用其他材料替換正常女嬰腦，用載體pT7T3-Pac代替Lamid BA，以及用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶(PacI/EcoR I或NotI/EcoR I)代替NotI/HindIII。
單鏈cDNA起始文庫的DNA的制備將從IB文庫中得到的質(zhì)粒DNA經(jīng)過HPLC反向柱和親和柱純化后，通過電穿孔法轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5αF’菌株。菌體與37℃在含Ap(即氨卞青霉素)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值為0.2，將含量超過20倍的輔助噬菌體進(jìn)行超感染，過4小時(shí)即可獲得單鏈DNA(Vieira，J.et al.1987，同上)。
為了減少雙鏈復(fù)制型(RF)DNA的出現(xiàn)，將得到的20μg樣品DNA用PvuII酶切(PvuII只切雙鏈DNA)，然后用酚/氯仿抽提，加入2ml的加樣緩沖液(0.12M磷酸納緩沖液，pH6.8/10mM EDTA/1％SDS)進(jìn)行稀釋，并通過羥基磷灰石(HAP)層析柱在60℃進(jìn)行純化，柱用相同緩沖液(1ml柱床體積，0.4HAP)進(jìn)行預(yù)平衡。用6ml的加樣緩沖液進(jìn)行洗柱，這部分溶液與通過柱的分餾物結(jié)合。對(duì)樣品用水飽和2-丁酮抽提兩次，用無水的2-丁酮抽提一次，用水飽和酚抽提一次(每次抽提加3倍體積抽提液)。過Nensorb柱(DuPont/NEN)脫鹽離子，用乙醇沉淀，最后走低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠電泳，以便去掉輔助噬菌體DNA和任何在純化時(shí)由于RNase A消化所引進(jìn)tRNA和寡聚核糖核苷酸，然后切下膠上含單鏈文庫DNA的區(qū)域，用β-瓊脂糖酶(New EnglishBiolabs)酶切消化，最后DNA進(jìn)行純化及用乙醇沉淀。
以上構(gòu)建好的高質(zhì)量的腦等材料的cDNA文庫(IB)，具有如下特點(diǎn)cDNA插入片段的平均長度為1.7Kb，通常從5’端測(cè)序即能獲得編碼區(qū)域的遺傳信息；代表mRNA poly(A)尾的長度短，從3’端測(cè)序便得到較多的有用信息；非重組克隆出現(xiàn)的頻率極低(0.1％)；對(duì)大于2000個(gè)克隆單輪測(cè)序表明，未曾發(fā)現(xiàn)有嵌合cDNA出現(xiàn)。
構(gòu)建cDNA均質(zhì)化文庫一般認(rèn)為，3’非編碼區(qū)與其轉(zhuǎn)錄物的匹配幾乎是唯一的，因此可以預(yù)料，在退火時(shí)3’非編碼區(qū)僅與其互補(bǔ)鏈配對(duì)。相反，由于編碼區(qū)多代表寡基因或多基因家族的成員，因此編碼區(qū)間的交叉雜交常導(dǎo)致在均質(zhì)化過程中文庫中稀少的cDNA減少。而作者的方法防止了這種可能性。在開始時(shí)，以單鏈環(huán)狀cDNA為模板從cDNA 3’端合成一段短的互補(bǔ)鏈，并在受控條件下將鏈長度控制在很小的范圍內(nèi)(200±20nt)。由于腦mRNA 3’非編碼區(qū)的平均長度為750nt(Hawkins，J.D.(1988)Nucleic Acids Res.16，9893-9908.)，因此大多數(shù)的參與退火反應(yīng)的合成的互補(bǔ)鏈應(yīng)缺少編碼區(qū)序列。然而，經(jīng)過這種部分延伸步驟后有必要通過羥基磷灰石層析進(jìn)行純化產(chǎn)物，其目的是IB文庫中因缺少poly(A)尾而不能進(jìn)行引物合成的單鏈DNA在第一輪過柱時(shí)約有0.1％的DNA會(huì)與柱非特異性結(jié)合。
方法包括以下的步驟解鏈、退火，接著通過羥基磷灰石層析對(duì)未締合環(huán)狀DNA(均質(zhì)化文庫)進(jìn)行純化并電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌。為了通過有限度的延伸合成大約200nt的核苷酸鏈，加了9pmol的寡聚核苷酸引物5’-GGCCGCAGGAAT15-3’于4.5pmol的單鏈IB文庫DNA中，反應(yīng)體系體積為150ul，含30mM Tris.Hcl(pH7.5)；50mM NaCl；15mM MgCl2；1mM DTT；0.1mM dNTPs；2.5mM ddATP，ddCTP，和ddGTP以及微量[α32P]dCTP的混合物于60℃水浴5分鐘，然后50℃水浴15分鐘，溫度降至37℃，加入75單位Klenow DNA多聚酶(United States Biochemical)，并水浴30分鐘，加入EDTA(20mM)終止反應(yīng)，并用酚/氯仿抽提，然后用含50ug經(jīng)超聲處理的變性的鮭魚精子DNA載體(salmon sperm DNA carrier)的2ml HAP加樣緩沖液進(jìn)行稀釋，并通過羥基磷灰石層析柱(如上所述)，用6ml的洗脫液(0.4M磷酸納緩沖液，pH6.8/10mM EDTA/1％ SDS)將結(jié)合于羥基磷灰石上的部分雙鏈DNA洗脫，加含50ug DNA載體的14ml水，使洗脫液中的磷酸濃度為0.12M，重復(fù)以上層析步驟。最后得到的洗脫液用上面介紹的方法進(jìn)行抽提和脫鹽，并用乙醇沉淀DNA。沉淀物(112ng)用2.5ul甲酰胺溶解，加一滴礦物油，在80℃加熱3分鐘，使DNA鏈解離，然后加入0.5ul Tris.Hcl(pH7.5)，0.1M EDTA，0.5ul 5M NaCl，1ul(5ug)(dT)25-30，0.5ul(0.5ug)延伸引物，使反應(yīng)體系總體積為5ul，進(jìn)行退火反應(yīng)，最后兩種成份用于封阻腺嘌呤殘基(即初始poly(A)尾)和單鏈環(huán)狀DNA上的寡聚核苷酸鏈的延伸。
退火的混合物在42℃保溫，在下述不同時(shí)間后各取出2.5ul樣品1小時(shí)后取出2.5ul樣品(計(jì)算COt＝0.42)；(A1+++)2.36小時(shí)后取出2.5ul樣品(計(jì)算COt＝1)。(A2+++)2.5ul樣品分別利用羥基磷灰石層析法使未雜交的單鏈環(huán)狀DNA與重新結(jié)合的部分雙鏈DNA分開，后者分別轉(zhuǎn)化形成兩個(gè)高重復(fù)cDNA均質(zhì)化小庫(即A1+++和A2+++)。并從洗脫峰中得到單鏈環(huán)狀DNA(方法如上所述)。得到的單鏈環(huán)狀DNA用分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，從復(fù)以上步驟。
退火的混合物在42℃保溫，在下述不同時(shí)間后各取出1.5ul樣品13小時(shí)后取出1.5ul樣品(計(jì)算COt＝5.5)；(A1++)23.6小時(shí)后取出1.5ul樣品(計(jì)算COt＝10)。(A2++)70.8小時(shí)后取出1.5ul樣品(計(jì)算COt＝30)。(A3++)2.5ul樣品分別利用羥基磷灰石層析法使未雜交的單鏈環(huán)狀DNA與重新結(jié)合的部分雙鏈DNA分開，后者分別轉(zhuǎn)化形成三個(gè)中度重復(fù)cDNA均質(zhì)化小庫(即A1++、A2++和A3++)并從洗脫峰中得到單鏈環(huán)狀DNA(方法如上所述)。得到的單鏈環(huán)狀DNA用分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，從復(fù)以上步驟。
退火的混合物在42℃保溫，在下述不同時(shí)間后各取出2.5ul樣品118小時(shí)后取出2.5ul樣品(計(jì)算COt＝50)；(A1+)188小時(shí)后取出2.5ul樣品(計(jì)算COt＝80)。(A2+)2.5ul樣品分別利用羥基磷灰石層析法使未雜交的單鏈環(huán)狀DNA與重新結(jié)合的部分雙鏈DNA分開，后者分別轉(zhuǎn)化形成兩個(gè)低重復(fù)cDNA均質(zhì)化小庫(即A1+和A2+)。并從洗脫峰中得到單鏈環(huán)狀DNA(方法如上所述)，按下述方法分別轉(zhuǎn)化形成兩個(gè)稀有cDNA均質(zhì)化小庫(即A1-和A-2)。由于部分雙鏈DNA的電穿孔轉(zhuǎn)換效率比單鏈環(huán)狀DNA要高100倍(Rubenstein，J.L.R.，Brice，A.E.J.，Ciaranello，R.D.，Denney，D.，Porteus，M.H.& Usdin，T.B.(1990)Nucleic Acids Res.18，4833-4842.)，于是加入隨機(jī)六堿基順序和T7DNA多聚酶(Sequenase version II；United States Biochemical)進(jìn)行引物延伸，從而使單鏈環(huán)狀DNA變成部分雙鏈DNA，其反應(yīng)混合物體積為10-20ul，含1mM dNTPs。加EDTA(終濃度為20mM)終止反應(yīng)，經(jīng)過酚抽提，乙醇沉淀，得到的cDNA溶于10mM Tris.HCl，pH 7.5/1mM EDTA，然后電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)DNA(DH10，GIBCO/BRL)。為了測(cè)定轉(zhuǎn)化子數(shù)目，在電穿孔后1小時(shí)，將10ul菌液涂于含75ug/ml氨芐的LB平板上(測(cè)定顯示可獲得含2.5×106個(gè)克隆的均質(zhì)化文庫)，用Qiagen質(zhì)粒試劑盒(Qiagen，Chatsworth，CA)可抽提獲得超螺旋質(zhì)粒DNA。
構(gòu)建只在正常人嬰兒腦中表達(dá)的均質(zhì)化和差減化cDNA小庫與上述均質(zhì)化步驟相同，但以下列cDNA起始庫作為模板合成片斷與前面構(gòu)建好的人嬰兒腦A1+++和A2+++作差減均質(zhì)化處理人胎肝脾，人足孕胎盤，人8-9周胎盤，人乳房，成人腦，人視網(wǎng)膜，人松果體腺，人卵巢癌，人黑素細(xì)胞，人胎心，人甲狀旁腺癌，人衰老成纖維細(xì)胞，人多發(fā)性硬化病灶，人胎肺。
退火的混合物在42℃保溫后分別取Cot值為0.42和1，構(gòu)建兩個(gè)均質(zhì)化小庫，這樣富集在HAP柱上的是同時(shí)在上述cDNA起始庫中都高度表達(dá)的cDNA，而穿透峰則為只在A+++(A即人嬰兒腦)中表達(dá)的高豐度cDNA，表示為spA1+++、spA2+++。
同樣方法與A++庫差減性均質(zhì)化處理，但退火的混合物在42℃保溫后分別取Cot值為5.5，10，30。收集穿透峰轉(zhuǎn)化可得只在A中(即人嬰兒腦)表達(dá)的中等豐度的三個(gè)均質(zhì)化小庫，表示為spA1++、spA2++、spA3++。
同樣方法分別與A+和A-庫差減性均質(zhì)化處理，但退火的混合物在42℃保溫后分別取Cot值為50，80。收集穿透峰轉(zhuǎn)化可得只在A中(即人嬰兒腦)表達(dá)的低等豐度的兩個(gè)均質(zhì)化小庫，表示為spA1+、spA2+以及稀有豐度的兩個(gè)均質(zhì)化小庫，表示為spA1-和spA2-。
對(duì)每一上述步驟得到的小庫進(jìn)行大規(guī)模cDNA測(cè)序，判斷是否為新的cDNA克隆。如果是新的，做5’端完整性分析，直到拿到全長序列。所有已測(cè)出的較長的cDNA克隆形成已有cDNA庫，并以此合成探針，與前述步驟得到的cDNA起始庫及均質(zhì)化等步驟形成的小庫雜交，排除已測(cè)過的cDNA克隆，保留為測(cè)過的克隆，以進(jìn)一步提高大規(guī)模測(cè)序的效率。這一過程簡單圖示3所示。雜交方法見下文。
菌落雜交將雙層尼龍膜(duplicate nylon filters)geneScreenPlus；DuPont/NEN)按方法(Grunstein，M.& Hogness，D.(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72，3961-3965.)進(jìn)行處理，讓菌落在膜上生長以便篩選文庫。雜交在42℃下進(jìn)行，反應(yīng)體系為50％甲酰胺，5×Denhardt’s溶液，0.75M NaCl，0.15M Tris.HCl，pH7.5，0.1M磷酸納，2％SDS，其中含經(jīng)剪切和變性的100ug/ml的鮭魚精子DNA，放射性探針用Prime-it II試劑盒(Stratagene)通過合成引物制備(Feinberg，A.P.& Vogelstein，B.(1983)Anal.Biochem.132，6-13.Feinberg，A.P.& Vogelstein，B.(1984)Anal.Biochem.137，266-267)。
DNA測(cè)序用Wizard Minipreps DNA純化系統(tǒng)(Promega)制備雙鏈質(zhì)粒DNA模板，用通用的順向和反向M13熒光引物從兩端測(cè)序，用Biomek 1000 workstation(Beckman)測(cè)定反應(yīng)物，然后將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到PCR儀(Perkin-Elmer/Cetus)上進(jìn)行循環(huán)測(cè)定。用370A DNA自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Bios)對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行分析。在國家生物技術(shù)信息中心(the National Center for Biotechnology Information)服務(wù)器上用BLASTalgorithm(Altschul，S.F.，W.Gish，W.Miller，E.Myers，and D.J.Lipman.1990.Basic localalignment search tool.J.Mol.Biol.215403-410.)對(duì)核酸和蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。實(shí)施例2構(gòu)建只在或主要在脊髓肌萎縮癥嬰腦(72天)中表達(dá)的均質(zhì)化和差減化cDNA小庫并進(jìn)行大規(guī)模cDNA測(cè)序構(gòu)建來源于人不同組織細(xì)胞的高質(zhì)量cDNA起始庫根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書，可用Oligotex mRNA試劑盒從脊髓肌萎縮癥嬰腦(72天)等細(xì)胞中的RNA純化Poly(A)+RNA(用于分離胞質(zhì)RNA的衰老成纖維細(xì)胞除外)，但要進(jìn)行二次純化。，cDNA文庫的構(gòu)建非常重要。在典型的反應(yīng)中，1ug的Poly(A)+RNA在37℃條件下與兩倍分子的帶有NotI標(biāo)記的(dT)18[對(duì)肝/脾文庫則帶有PacI標(biāo)記的PacI]過量的引物退火。然后在37℃條件下用上標(biāo)反轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；或者Poly(A)+RNA可在45℃條件下用四倍過量的帶NotI標(biāo)記的(dT)25引物退火，并在45℃條件下反轉(zhuǎn)錄。標(biāo)記是一個(gè)2-6個(gè)核苷酸的序列，對(duì)不同的文庫有不同的特異性，可用于鑒定不同的文庫。除了嬰兒腦、胎兒肝/脾和足孕胎盤的文庫外，其它所有文庫的第一鏈cDNA合成均以以下寡聚核苷酸為引物TGTTACCAATCTGAAG-TGGGAGCGGCCGC-標(biāo)記-(dT)18或25。對(duì)于胎心、腦和足孕的胎盤文庫的第一鏈cDNA合成用AACTGGAAGAATTAATTAAAG-ATCT(dT)18(Pharmacia)為引物。寡聚核苷酸AACTGGAAGAAT-TAATTAAAGATCT(dT)18用于胎兒肝/脾cDNA第一鏈的合成引物。將雙鏈cDNA用柱長64cm，直徑0.2cm的聚丙烯酰氨凝膠柱按分子大小進(jìn)行凝膠過濾分離，然后用500到1000倍分子過量的接頭連接。嬰兒腦cDNA帶有HindIII酶切位點(diǎn)的接頭，然后用NotI酶切，用聚丙烯酰氨凝膠柱進(jìn)行第二次分離，再定向克隆到載體LafmidBA的NotI和HindIII切點(diǎn)之間(Soares，M.B.1994.Construction of directionally clonedcDNA libraries in phagemid vectors.In Automated DNA sequencing and analysis(ed.M.D.Adams，C.Fields and J.C.Venter)，pp.110-114.Academic Press，New York，NY.USA74，1020-1023.)。胚胎肝/脾cDNA用帶EcoR I切點(diǎn)的接頭連接，如上分離，然后用PacI酶切，定向克隆到pT7T3-Pac載體的PacI和EcoR I的位點(diǎn)之間。其它所有種類的cDNA用帶EcoR I切點(diǎn)的接頭連接，如上分離后，用NotI酶切，再定向克隆到pT7T3-Pac載體的NotI和EcoR I的位點(diǎn)之間(Pharmacia)。pT7T3-Pac與pT7T3-Pac18D(Pharmacia)大體相同，帶有一個(gè)修飾過的多位點(diǎn)接頭。分別轉(zhuǎn)化E.coli得到來源于人不同組織細(xì)胞的最初cDNA文庫。分別將從這些最初cDNA文庫中得到的質(zhì)粒DNA經(jīng)過HPLC反向柱和親和柱純化后，通過電穿孔法轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5αF’菌株，按以下方法可得各種單鏈和雙鏈高質(zhì)量cDNA起始文庫。
以下是pT7T3-Pac的多接頭序列和側(cè)翼序列5’-CACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATM13反向測(cè)序引物GACATGATTACGAATTTAATACGACTCACTATAGGGAATTTGGCCT7啟動(dòng)子CTCGAGGCCAAGAATTCCCGACTACGTAGTCGGGGATCCGTCTTSfiIEcoRI SnaBI BamHIAATTAAGCGGCCGCAAGCTTATTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTPact NotI HindIII T3啟動(dòng)子TAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAM13測(cè)序引物AACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAG-3’。
體外構(gòu)建純化的高質(zhì)量的單鏈環(huán)狀DNA起始文庫利用GeneII(噬菌體F1的內(nèi)切酶)和E.coli外切核酶酶III(Exo III)的聯(lián)合作用，可將雙鏈?zhǔn)删wDNA轉(zhuǎn)化成單鏈，應(yīng)按廠商的說明進(jìn)行操作(Life Technologies公司，目錄號(hào)10356-020)。如前所述(Soares，M.B.1994.Construction of directionallycloned cDNA libraries in phagemid vectors.In Automated DNA sequencmg andanalysis(ed.M.D.Adams，C.Fields and J.C.Venter)，pp.110-114.Academic Press，NewYork，NY.USA 74，1020-1023.)，得到的單鏈環(huán)狀DNA可用HAP層析方式(Bio-Rad)從剩余的雙鏈質(zhì)粒DNA純化。噬菌體F1復(fù)制的起始蛋白是一種位點(diǎn)特異性的核酸內(nèi)切酶，它能與噬菌體載體的F1起始點(diǎn)相結(jié)合并在超螺旋DNA上造一個(gè)切口。切口鏈以后被Exo III從3′端切掉，產(chǎn)生單鏈環(huán)(Hoheisel，J.D.1993.On the activities ofEscherichia coil exonuclease III.Anal.Biochem.209238-246.)，由于Gene II將超螺旋轉(zhuǎn)變成松弛質(zhì)粒的作用不完全，所以必需用HAP純化單鏈環(huán)。Gene II的反應(yīng)是在30℃的條件下進(jìn)行1小時(shí)，典型的反應(yīng)包括4ulcDNA文庫的超螺旋質(zhì)粒，1ulGeneII(Life Technologies)，2ul 10×GeneII緩沖液(Life Technologies)，總體積為20ul。隨后，在65℃溫度下5分鐘使GeneII失活，冰冷卻后加2ul Exo III(LifeTechnologies，目錄號(hào)18013-011，65單位/ul)，在37℃條件下保溫30分鐘。再用蛋白酶K(Boehringer Mannheim)將GeneII和Exo III酶切，反應(yīng)條件為50℃，15分鐘，反應(yīng)總體積100ul，包括10mM Tris(PH7.8)，5mM EDTA，0.5％SDS，和136ul蛋白酶K。然后用等體積的酚、氯仿、異戊醇(25∶24∶1)抽提，再用乙醇使DNA沉淀，接著用PvuII在37℃下酶切2小時(shí)。這樣做是為了使剩余的超螺旋質(zhì)粒轉(zhuǎn)換成線性DNA分子，以提高其在實(shí)驗(yàn)條件下與HAP親和力。因?yàn)镻vuII無法切割單鏈所以在載體上有兩個(gè)PvuII切點(diǎn)。加2ul加樣緩沖液
稀釋該反應(yīng)，并在60℃溫度下HAP親合層析，應(yīng)當(dāng)用同樣的緩沖液預(yù)平衡層析柱(床體積為1ml，0.4g HAP)。用6ml的加樣緩沖液清洗過后，將洗后的緩沖液與流通組分合并，然后樣品用水飽和的二丁醇抽兩次，無水二丁醇抽一次，水飽和的乙醚抽一次(每次抽提用3倍的體積)。殘余的乙醚用真空吹干，用Nensorb柱(DuPont/NEN)依照廠商的特別說明進(jìn)行脫鹽，最后濃縮到0.35ml，并用乙醇沉淀。應(yīng)當(dāng)指出用GeneII和Exo III制備的單鏈環(huán)DNA與體內(nèi)噬菌質(zhì)粒產(chǎn)生的單鏈DNA極性相反(互補(bǔ)鏈)。
體內(nèi)產(chǎn)生高質(zhì)量的共價(jià)閉合單鏈cDNA起始文庫如文獻(xiàn)(Vieira，J.& Messing，J.(1978)Methods Enzymol.153，3-11.)所述，用電穿孔方法將原始文庫的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入到E.coli DH5αFi菌中，在37℃氨芐青霉素選擇培養(yǎng)到OD600為0.2，用10-20倍過量的輔助噬菌體M13KO7(Pharmacia)進(jìn)行超感染，培養(yǎng)4小時(shí)后收集，得到單鏈環(huán)狀質(zhì)粒。
單鏈環(huán)轉(zhuǎn)為雙鏈質(zhì)粒乙醇沉淀單鏈環(huán)(＜50ug)，并在11ul水中重懸浮。然后加4ul 5×測(cè)序酶緩沖液(USB)和1ul的引物(1ug)，將混合物在65℃保溫5分鐘，37℃3分鐘，然后加入1ul的測(cè)序(2.0版本，USB公司)，1ul0.1M的DTT，2ul混合dNTP(每種脫氧核苷酸的終濃度在10mM)，在37℃下保溫30分鐘。再加入10mM Tris(PH8.0)和1mM EDTA(TE)，使四種物質(zhì)的總?cè)萘考拥?00ul，并用酚、氯仿、異戊醇(25∶24∶1)抽提一次。
用乙醇沉淀質(zhì)粒DNA并溶于3ul TE。下列寡聚核苷酸用于這個(gè)引物延伸反應(yīng)(1)M13反向測(cè)序引物(5i-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3i)，它與體外制備的單鏈互補(bǔ)。(2)寡聚Amp(5′-GACTGGTGAGTACTCAA-CCAAGTC-3′)，它與體內(nèi)制備的單鏈pT7T3-Pac或單鏈Lafmid BA質(zhì)粒的氨芐青霉素抗性基因互補(bǔ)。
以上構(gòu)建好的各種高質(zhì)量cDNA起始文庫，具有如下特點(diǎn)cDNA插入片段的平均長度為1.7Kb，通常從5’端測(cè)序即能獲得編碼區(qū)域的遺傳信息；代表mRNApoly(A)尾的長度短，從3’端測(cè)序便得到較多的有用信息；非重組克隆出現(xiàn)的頻率極低(0.01％)；對(duì)大于2000個(gè)克隆單輪測(cè)序表明，未曾發(fā)現(xiàn)有嵌合cDNA重組克隆出現(xiàn)。
構(gòu)建cDNA均質(zhì)化小文庫這也是一個(gè)基于復(fù)性動(dòng)力學(xué)的方法。該方法是將由PCR產(chǎn)生的20倍過量的cDNA插入片段與以單鏈環(huán)狀形式存在的文庫本身雜交，然后用HAP純化剩余的單鏈質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)為雙鏈，用電穿孔法導(dǎo)人DH10B細(xì)菌中，最后用氨芐青霉素選擇繁殖。cDNA插入片段的PCR擴(kuò)增是在高保真放大PCR系統(tǒng)(Boehringer Mannheim)中按說明書方法進(jìn)行的，這個(gè)放大系統(tǒng)含有Taq和Pwo DNA酶(Barnes，W.M.1994.PCRamplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambdabacteriophage templates.Proc.Natl.Acad.Sci.912216-2220.)的酶混合物組成。將1ul(2.5-5.0ug)DNA模板[雙鏈質(zhì)粒(脊髓肌萎縮癥嬰腦、胎兒肺、甲狀旁腺瘤、衰老的成纖維細(xì)胞cDNA起始文庫)或離體制備的單鏈環(huán)狀DNA(胎兒心臟、胎兒肝/脾cDNA起始文庫]與2uldNTP貯備液(每一種貯備液在反應(yīng)中的終濃度均為200Um)，5ul 20uM的T7引物(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′)，5ul 20uM的T3引物(5′-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3′)，10ul 10×1高保真放大系統(tǒng)的緩沖液，0.75ul高保真放大系統(tǒng)的酶混合物(2.6單位)，76.25ul的水混合物，然后加入50ul的礦物油，反應(yīng)在一個(gè)Perkin Elmer熱循環(huán)器中進(jìn)行，擴(kuò)增循環(huán)條件如下，先在7分鐘內(nèi)將溫度從室溫升到94℃，然后在94℃保溫1分鐘，55℃2分鐘，72℃3分鐘，72℃7分鐘，按此過程循環(huán)20次。PCR擴(kuò)增的片段依照說明書由高純度PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，純化后的PCR產(chǎn)物用乙醇沉淀，溶于5ulTE中，然后將1.5ul(0.5ug)PCR產(chǎn)物與5ul(50ug)的基因DNA(離體制備的單鏈環(huán)狀DNA)混合，在混合液中加上去離子甲酰胺，0.5ul(10ug)5′封阻寡聚AV-1(5′-CCTCGTGCCGAATTCTTGGCCTCGAGGGCCAAATTCCCTATAGTGAGTGTATTA-3′)，0.5ul(10ug)3′-封阻寡聚AR(5′-ATTAACCCT-CACTAAA-GGGAATAAGCTTGCGGCCGCT20-3i，用于除胎兒肝脾文庫之外的所有基因文庫或0.5ul(10ug)3′封阻寡聚AV-2(5′-ATTAACCCTCACTAAAGGGAATAAGCTTGCGGCCGCTTAATTAAAGATCT19-3′，僅用于胎兒肝/脾文庫)，再后用10ul礦物油封口，于80℃下加熱3分鐘，再加入1ul 10×緩沖液-A[1.2MNaCl，0.1M Tris(pH8.0)和50mM EDTA，用于脊髓肌萎縮癥嬰腦、胎兒肺、胎兒心臟、甲狀旁腺瘤、衰老成纖維細(xì)胞cDNA起始文庫]或加入1ul 10×緩沖液-B[1.2MNaCl，0.1M Tris(pH8.0)和50mM EDTA和10％的SDS，用于14Nb2HFL20W-胎兒肝/脾cDNA起始文庫]，再加入1.5ul水，雜交反應(yīng)在30℃下進(jìn)行，時(shí)間分別如下文所述(分別計(jì)算所得的COt值)，剩余的單鏈環(huán)狀DNA由HAP層析純化，轉(zhuǎn)為雙鏈，然后用電穿孔法導(dǎo)入的DH10B(Life Technologies)細(xì)菌中，如前所述。
以下B代表脊髓肌萎縮癥嬰腦細(xì)胞cDNA起始文庫，并以此為例具體說明cDNA均質(zhì)化小文庫的構(gòu)建過程。前述退火的混合物在30℃保溫，在下列不同時(shí)間后各取出2.5ul樣品0.17小時(shí)后取出2.5ul樣品(計(jì)算COt＝0.42)；(B1+++)0.4小時(shí)后取出2.5ul樣品(計(jì)算COt＝1)。(B2+++)2.5ul樣品分別利用羥基磷灰石層析法使未雜交的單鏈環(huán)狀DNA與重新結(jié)合的部分雙鏈DNA分開，后者分別轉(zhuǎn)化形成兩個(gè)高重復(fù)cDNA均質(zhì)化小庫(即B1+++和B2+++)。并從洗脫峰中得到單鏈環(huán)狀DNA(方法如上所述)。得到的單鏈環(huán)狀DNA用分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，重復(fù)以上步驟。
退火的混合物在42℃保溫，在下述不同時(shí)間后各取出1.5ul樣品2.2小時(shí)后取出1.5ul樣品(計(jì)算COt＝5.5)；(B1++)4小時(shí)后取出1.5ul樣品(計(jì)算COt＝10)。(B2++)12小時(shí)后取出1.5ul樣品(計(jì)算COt＝30)。(B3++)1.5ul樣品分別利用羥基磷灰石層析法使未雜交的單鏈環(huán)狀DNA與重新結(jié)合的部分雙鏈DNA分開，后者分別轉(zhuǎn)化形成三個(gè)中度重復(fù)cDNA均質(zhì)化小庫(即B1++、B2++和B3++)
并從洗脫峰中得到單鏈環(huán)狀DNA(方法如上所述)。得到的單鏈環(huán)狀DNA用分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，重復(fù)以上步驟。
退火的混合物在42℃保溫，在下述不同時(shí)間后各取出2.5ul樣品20小時(shí)后取出2.5ul樣品(計(jì)算COt＝50)；(B1+)32小時(shí)后取出2.5ul樣品(計(jì)算COt＝80)。(B2+)2.5ul樣品分別利用羥基磷灰石層析法使未雜交的單鏈環(huán)狀DNA與重新結(jié)合的部分雙鏈DNA分開，后者分別轉(zhuǎn)化形成兩個(gè)低重復(fù)cDNA均質(zhì)化小庫(表示為B1+和B2+)。并從洗脫峰中得到單鏈環(huán)狀DNA(方法如上所述)，按下述方法分別轉(zhuǎn)化形成兩個(gè)稀有cDNA均質(zhì)化小庫(表示為B1-和B-2)。由于部分雙鏈DNA的電穿孔轉(zhuǎn)換效率比單鏈環(huán)狀DNA要高100倍(Rubenstein，J.L.R.，Brice，A.E.J.，Ciaranello，R.D.，Denney，D.，Porteus，M.H.& Usdin，T.B.(1990)Nucleic Acids Res.18，4833-4842.)，于是加入隨機(jī)六堿基順序和T7DNA多聚酶(Sequenase version II；UnitedStates Biochemical)進(jìn)行引物延伸，從而使單鏈環(huán)狀DNA變成部分雙鏈DNA，其反應(yīng)混合物體積為10-20ul，含1mM dNTPs。加EDTA(終濃度為20mM)終止反應(yīng)，經(jīng)過酚抽提，乙醇沉淀，得到的cDNA溶于10mM Tris.HCl，pH 7.5/1mM EDTA，然后電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)DNA(DH10，GIBCO/BRL)。為了測(cè)定轉(zhuǎn)化子數(shù)目，在電穿孔后1小時(shí)，將10ul菌液涂于含75ug/ml氨芐的LB平板上(測(cè)定顯示可獲得含2.5 106個(gè)克隆的均質(zhì)化文庫)，用Qiagen質(zhì)粒試劑盒(Qiagen，Chatsworth，CA)可抽提獲得超螺旋質(zhì)粒DNA。
構(gòu)建只在或主要在脊髓肌萎縮癥嬰腦細(xì)胞中表達(dá)的cDNA均質(zhì)化小庫以下是對(duì)前面構(gòu)建好的脊髓肌萎縮癥嬰腦細(xì)胞cDNA均質(zhì)化小庫分別進(jìn)行差減化處理。按照說明書，用Olagen Midi-prep的試劑盒可以制備雙鏈質(zhì)粒DNA。這些DNA來自人正常嬰腦，成人腦，人胎肝脾，人足孕胎盤，人8-9周胎盤，人乳房，人視網(wǎng)膜，人松果體腺，人卵巢癌，人黑素細(xì)胞，人胎心，人甲狀旁腺癌，人衰老成纖維細(xì)胞，人多發(fā)性硬化病灶，人胎肺等高質(zhì)量的cDNA起始文庫，然后將雙鏈質(zhì)粒DNA在體外轉(zhuǎn)為單鏈環(huán)狀DNA，如前所述，單鏈環(huán)狀DNA用HAP層析純化，作為采用T7和T3引物的PCR擴(kuò)增的模板，將總量為1.5ug的cDNA起始文庫群中(再4ul去離子甲酰胺中)得到的經(jīng)PCR擴(kuò)增的DNA插入片段，分別與來自以上構(gòu)建好的脊髓肌萎縮癥嬰腦細(xì)胞cDNA均質(zhì)化小庫的單鏈環(huán)狀混合(在2ul去離子甲酰胺中)，加入2.1ul(42ug)的5’封阻寡聚AV-1，和2.1ul(42ug)的3’封阻寡聚AV-2，然后加入10ul礦物油，在80℃下加熱反應(yīng)30分鐘，再加入1.2ul 10×緩沖液B和0.6ul水，雜交反應(yīng)在30℃下及如下文所述不同時(shí)間(分別計(jì)算所得的COt值)進(jìn)行，將未雜交的單鏈環(huán)狀DNA由HAP純化，轉(zhuǎn)為雙鏈，用電穿孔法導(dǎo)入DH10B細(xì)菌，然后用氨芐青霉素選擇繁殖，以得到差減的只在或主要在脊髓肌萎縮癥嬰腦細(xì)胞中表達(dá)的cDNA均質(zhì)化小庫。與HAP結(jié)合的DNA也作同樣的處理和純化，用于控制實(shí)驗(yàn)。
以上與B1+++和B2+++在30℃保溫退火，時(shí)間分別為0.73小時(shí)和1.8小時(shí)，相應(yīng)的Cot值分別為0.42和1，這樣富集在HAP柱上的是同時(shí)在上述cDNA起始庫中都高度表達(dá)的cDNA，而穿透峰則為只在B+++中表達(dá)的高豐度cDNA，表示為spB1+++、spB2+++。
同樣方法與B++庫差減性均質(zhì)化處理，但退火的混合物在30℃保溫后時(shí)間分別為9.7小時(shí)，17.7小時(shí)和53.3小時(shí)，相應(yīng)的Cot值為5.5，10和30。收集穿透峰轉(zhuǎn)化可得只在B中表達(dá)的中等豐度的三個(gè)均質(zhì)化小庫，表示為spB1++、spB2++和spB3++。
同樣方法分別與A+和A-庫差減性均質(zhì)化處理，但退火的混合物在30℃保溫后時(shí)間分別為88.9小時(shí)和142小時(shí)，相應(yīng)的Cot值為50和80。收集穿透峰轉(zhuǎn)化可得只在B中表達(dá)的低等豐度的兩個(gè)均質(zhì)化小庫，表示為spB1+、spB2+以及稀有豐度的兩個(gè)均質(zhì)化小庫，表示為spB1-和spB2-。
對(duì)每一上述步驟得到的小庫進(jìn)行大規(guī)模cDNA測(cè)序，判斷是否為新的cDNA克隆。如果是新的，做5’端完整性分析，直到拿到全長序列。所有已測(cè)出的較長的cDNA克隆形成已有cDNA庫，并以此合成探針，與前述步驟得到的cDNA起始庫及均質(zhì)化等步驟形成的小庫雜交，排除已測(cè)過的cDNA克隆，保留為測(cè)過的克隆，以進(jìn)一步提高大規(guī)模測(cè)序的效率。這一過程簡單圖示3所示。雜交方法見下文。
菌落雜交將雙層尼龍膜(duplicate nylon filters)geneScreenPlus；DuPont/NEN)按方法(Grunstein，M.& Hogness，D.(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72，3961-3965.)進(jìn)行處理，讓菌落在膜上生長以便篩選文庫。雜交在42℃下進(jìn)行，反應(yīng)體系為50％甲酰胺，5×Denhardt’s溶液，0.75M NaCl，0.15M Tris.HCl，pH7.5，0.1M磷酸納，2％SDS，其中含經(jīng)剪切和變性的100ug/ml的鮭魚精子DNA，放射性探針用Prime-it II試劑盒(Stratagene)通過合成引物制備(Feinberg，A.P.& Vogelstein，B.(1983)Anal.Biochem.132，6-13.Feinberg，A.P.& Vogelstein，B.(1984)Anal.Biochem.137，266-267)。
DNA測(cè)序用Wizard Minipreps DNA純化系統(tǒng)(Promega)制備雙鏈質(zhì)粒DNA模板，用通用的順向和反向M13熒光引物從兩端測(cè)序，用Biomek 1000 workstation(Beckman)測(cè)定反應(yīng)物，然后將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到PCR儀(Perkin-Elmer/Cetus)上進(jìn)行循環(huán)測(cè)定。用370A DNA自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Bios)對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行分析。在國家生物技術(shù)信息中心(the National Center for Biotechnology Information)服務(wù)器上用BLASTalgorithm(Altschul，S.F.，W.Gish，W.Miller，E.Myers，and D.J.Lipman.1990.Basic localalignment search tool.J.Mol.Biol.215403-410.)對(duì)核酸和蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。
重復(fù)測(cè)序和差減循環(huán)50次，測(cè)得新序列的效率遠(yuǎn)大于10％。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種cDNA測(cè)序方法，其特征在于，它包括以下步驟(1)以生物體的組織為材料，構(gòu)建cDNA起始文庫，其中該文庫中的插入片段長度為0.5-3.0kb；(2)按設(shè)定的分檔Cot值，對(duì)步驟(1)的cDNA起始文庫進(jìn)行均質(zhì)化，從而得到對(duì)應(yīng)于分檔Cot值的cDNA均質(zhì)化文庫，其中Co是總DNA濃度，單位是以核苷酸數(shù)計(jì)的摩爾每升而t是復(fù)性時(shí)間，單位是秒；(3)對(duì)于前一步驟的各cDNA均質(zhì)化庫，分別挑選5-500個(gè)克隆進(jìn)行DNA測(cè)序；(4)用已測(cè)序的cDNA克隆來合成對(duì)應(yīng)于已測(cè)序列的探針，并將該合成的探針與前一步驟中的cDNA均質(zhì)化庫進(jìn)行雜交差減，從而從該cDNA庫中除去已測(cè)序的cDNA克隆，并形成差減化處理過的均質(zhì)化cDNA庫；(5)重復(fù)步驟(3)和(4)1-5,000次。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(1)和(2)中，以該生物體不同組織為材料，構(gòu)建不同組織的cDNA起始文庫；并分別均質(zhì)化以得到不同組織的均質(zhì)化庫；在不同組織的cDNA均質(zhì)化庫之間進(jìn)行雜交差減，以形成雜交差減化的均質(zhì)化cDNA庫。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的不同的組織包括同一生物體的不同類型的組織、同一生物體不同發(fā)育階段的組織、同一生物體的正常組織和病理組織、和不同生物體的組織。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中還包括，根據(jù)已知的cDNA序列信息人工合成探針，或者利用其他已有的測(cè)序過的克隆來合成相應(yīng)的探針；并將該合成的探針與前一步驟中的cDNA均質(zhì)化庫進(jìn)行雜交差減。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，DNA測(cè)序包括對(duì)于測(cè)定的序列片段，判斷是否是新的cDNA克?。粚?duì)于新的cDNA克隆，進(jìn)行5′端完整性分析；對(duì)于5′端完整的新cDNA克隆，繼續(xù)測(cè)序直到獲得全長序列。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，分檔Cot值被分成3-8檔。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，該Cot被分成如下的三檔0＜Cot≤1；Cot＝1-50；和Cot≥50，從而得到選自下組的均質(zhì)化庫(a)高重復(fù)cDNA均質(zhì)化庫；(b)中等重復(fù)cDNA均質(zhì)化庫；和(c)低重復(fù)cDNA均質(zhì)化庫。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中，cDNA起始文庫的構(gòu)建步驟包括抽提mRNA，通過選自下組的技術(shù)對(duì)mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，以形成相應(yīng)的cDNA混合逆轉(zhuǎn)錄酶技術(shù)、SMART PCR技術(shù)、核苷酸加帽技術(shù)和它們的組合；分離收集0.5-3.0kb的cDNA片段；將分離的cDNA片段克隆入合適的載體；分離含0.5-3.0kb插入片段的載體；轉(zhuǎn)化合適的菌體，得到cDNA起始文庫。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中，cDNA起始文庫的構(gòu)建步驟包括抽提mRNA，通過選自下組的技術(shù)對(duì)mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，以形成相應(yīng)的cDNA混合逆轉(zhuǎn)錄酶技術(shù)、SMART PCR技術(shù)、核苷酸加帽技術(shù)和它們的組合；分離收集0.5-3.0kb的cDNA片段；將分離的cDNA片段克隆人合適的載體；分離含0.5-3.0kb插入片段的載體；轉(zhuǎn)化合適的菌體，得到cDNA文庫；從該cDNA文庫中抽提重組DNA，并過Poly(T)10-25親和柱，收集與Poly(T)10-25結(jié)合的重組DNA，轉(zhuǎn)化合適的菌體，得到cDNA起始文庫。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，分離收集0.5-3.0kb的cDNA片段是通過電泳割膠或凝膠層析柱純化技術(shù)；而分離含0.5-3.0kb插入片段的載體是通過HPLC反相層析。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種cDNA循環(huán)差減測(cè)序方法,它包括步驟:(1)以生物體的組織為材料,構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA起始文庫;(2)按設(shè)定的分檔C
文檔編號(hào)C12N15/10GK1264744SQ99102450
公開日2000年8月30日 申請(qǐng)日期1999年2月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月26日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅 申請(qǐng)人:上海生元基因開發(fā)有限公司