專利名稱：新的人蛋白及其編碼序列,以及制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)。更具體地說，本發(fā)明的多肽被推斷鑒定為Ena/VASP蛋白家族的一個(gè)新成員。
Gertler等人于1995年最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)并克隆得到了Ena基因(Gertler1995，Genes Dev.9，521-533)；同年，Haffner等人在小鼠中發(fā)現(xiàn)了VASP基因；果蠅的Ena基因及鼠的VASP基因同屬于Ena/VASP蛋白家族的成員(Haffner 1995，EMBOJ.14，19-27)。1996年，Gertler等人又在小鼠中分離得到了Ena/VASP蛋白家族兩個(gè)新成員，Mena及Evl(Frank B.Gertler 1996，Cell，87，227-239)。1997年，Shoichiro Ohta等人分離得到了一個(gè)新的大鼠基因RNB6(Shoichiro Ohta 1997，Biochem & Biophys Res.Commun.，237，307-312)。RNB6與Ena/VASP蛋白家族的成員Ena、VASP、Mena、Evl均有較高的同源性，同為Ena/VASP蛋白家族的成員，且具有相似的生物學(xué)功能。
然而，在本發(fā)明之前，還沒有公開或報(bào)道過屬于Ena/VASP家族的人蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼Ena/VASP蛋白家族的一個(gè)新成員，本發(fā)明新的人類基因被命名為HNB基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的Ena/VASP蛋白家族成員，該蛋白被命名為HNB蛋白。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人HNB蛋白的方法。
本發(fā)明還涉及這種人HNB蛋白核酸序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人HNB蛋白蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸33-1289位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸33-1289位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸33-1289位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的HNB蛋白多肽，它包括具有SEQ IDNO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有HNB蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有HNB蛋白蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成HNB蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸33-1289位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成HNB蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)HNB蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有HNB蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為1352個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于33-1289位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“HNB蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有HNB蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中33-1289位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框33-1289位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中33-1289位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地，在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸33-1289位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸33-1289位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人HNB蛋白相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“HNB蛋白多肽”指具有HNB蛋白活性的SEQ ID NO.4<p>質(zhì)譜質(zhì)譜實(shí)施例 R2RJ％收率 計(jì)算值 觀測值(M+H)
本發(fā)明還包括一種可用作探針或引物的核苷酸分子，該分子通常具有HNB蛋白核苷酸序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼HNB蛋白的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測HNB蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于HNB蛋白多肽的編碼序列，可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對HNB蛋白DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于HNB蛋白基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與HNB蛋白基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制HNB蛋白蛋白的分子，也包括那些并不影響HNB蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的HNB蛋白基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的HNB蛋白基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)HNB蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Jmmunol.6292，1976；Hammerling等人，InMonoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷HNB蛋白功能的抗體以及不影響HNB蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用HNB蛋白基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與HNB蛋白基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的人HN核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸全長為1352個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于33-1289位核苷酸。該多核苷酸是如此獲得的，以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物A15′-CTCAGGGTTCCCTGTGCTGCCAC -3′和反向引物B15′-GGGCTTCTGGCTGTCCTCTGTCG-3′進(jìn)行PCR，獲得1352bp的目的片段。測序后得到SEQ ID NO.3的全長cDNA序列。
根據(jù)同源比較的結(jié)果，本發(fā)明的核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列與不同來源的Ena/VASP蛋白家族的成員顯示了顯著的同源性，因此，這表明它是Ena/VASP蛋白家族的一個(gè)新成員，并且具有Ena/VASP蛋白家族蛋白的一些重要功能。
Ena/VASP蛋白家族的成員均通過它們的GP5花式結(jié)構(gòu)與肌動(dòng)蛋白抑制蛋白結(jié)合，通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白微絲的聚集來控制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)Ena/VASP家族的大多數(shù)成員均在生物胚胎發(fā)育過程中，在腦中表達(dá)逐漸增強(qiáng)，并于生物出生后的第一天達(dá)到最高峰，而后便逐步減少。對大鼠的RNB6蛋白研究表明，其不僅在腦中表達(dá)，而且在脾、胸腺及睪丸中也表達(dá)。Ena/VASP蛋白家族的成員主要通過對神經(jīng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)來控制中心神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育(shoichiro Ohta 1997，Biochem &amp; BiophysRes.Commun.237，307-312)。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人HNB(HNBP)與小鼠Evl蛋白(EVLP)的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用“|”標(biāo)出，相似的氨基酸用“·”標(biāo)出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
圖2為本發(fā)明的人HNB(HNBP)與大鼠RNB6蛋白(RNB6P)的氨基酸序列的同源比較圖。
圖3為本發(fā)明的人HNB、小鼠Evl蛋白及大鼠RNB6蛋白3種蛋白的氨基酸序列同源比較圖。其中，相同的氨基酸在序列下方用“*”標(biāo)出，相似的氨基酸用“·”標(biāo)出。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1HNB蛋白的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴(kuò)增以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15′-CTCAGGGTTCCCTGTGCTGCCAC-3′(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸B15′-GGGCTTCTGGCTGTCCTCTGTCG-3′(SEQ ID NO.2)為反向引物，進(jìn)行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、70℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片斷約為.4Kb的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑷缟汐@得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1352bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于33-1289位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出HNB蛋白的氨基酸序列，共418個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.4。
實(shí)施例2同源比較用HNB蛋白的全長cDNA序列及其編碼蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與Ena/VASP蛋白家族成員顯示了較高的同源性，如用PCGENE軟件分析，它與小鼠的Evl蛋白在蛋白水平上顯示了93.9％的同一性和97.5％的相似性(圖1)；又如，它與大鼠的RNB6蛋白在蛋白水平上顯示了93.6％的同一性和96.9％的相似性(圖2)。
特別的是Ena/VASP蛋白家族成員的氨基酸序列中均存在一個(gè)由六個(gè)氨基酸組成的脯氨酸花式結(jié)構(gòu)Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro(GP5)；這一脯氨酸花式結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是Ena/VASP蛋白家族成員的特征性序列，其可能在Ena/VASP蛋白家族的成員與肌動(dòng)蛋白抑制蛋白相結(jié)合，調(diào)節(jié)控制肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過程中起著重要的作用(Shoichiro Ohta 1997，Biochem &amp; Biophys Res.Commun.，237，307-312)。在本發(fā)明的蛋白中符合上述模式的序列片段是Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro(SEQ ID NO.4中183-188位)。另外，Ena/VASP蛋白家族成員的氨基酸組成還含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域EVH1及EVH2(圖3)。本發(fā)明的人HNB蛋白的氨基酸序列中也含有兩個(gè)與之相對應(yīng)的結(jié)構(gòu)域，它們分別是SEQ ID NO 4中1-114位和SEQ ID NO 4中224-412位(FrankB.Gertler 1996，Cell，87，227-239)。這進(jìn)一步表明了本發(fā)明的HNB蛋白也為Ena/VASP蛋白家族中的一個(gè)成員，并具有與Ena/VASP蛋白家族中其他成員相似的功能。
Ena/VASP蛋白家族的成員均通過它們的GP5花式結(jié)構(gòu)與肌動(dòng)蛋白抑制蛋白結(jié)合，通過對肌動(dòng)蛋白微絲聚集的調(diào)節(jié)來控制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。
Northern及免疫研究表明，果蠅的Ena、小鼠的VASP蛋白及大鼠的RNB6蛋白分別在果蠅及鼠胚胎發(fā)育過程中，在腦中的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，并于出生后的第一天達(dá)到最高峰，而后便逐步減少。組織分布研究發(fā)現(xiàn)，大鼠的RNB6蛋白不僅在腦中表達(dá)，而且在脾、胸腺及睪丸中也表達(dá)。組織化學(xué)研究表明，VASP蛋白、RNB6蛋白及Ena蛋白主要通過對神經(jīng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)來控制中心神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育(shoichiro Ohta 1997，Biochem &amp; Biophys Res.Commun.237，307-312)。
本發(fā)明的HNB蛋白與Ena/VASP蛋白家族的成員均有著較高的同源性，其為Ena/VASP蛋白家族的新成員，因此認(rèn)為其也具有與上述各蛋白相似的功能，即在生物胚胎中心神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中起著重要的作用。
本發(fā)明的人HNB除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人HNB還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人HNB的N端與大鼠RNB6的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人HNB的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人HNB核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人HNB的表達(dá)水平或者抑制人HNB的過度表達(dá)。本發(fā)明的人HNB蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人HNB缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例3HNB蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)編碼HNB蛋白的cDNA序列以實(shí)施例1中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A1/B1為模板，用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列為5′-TGCAGGATCCATGGCCACAAGTGAACAGAG-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，接之是由起始密碼子開始的HNB蛋白編碼序列的20個(gè)核苷酸；3’寡核苷酸引物序列為5’-GTTCGTCGACTTACGTGGTGCTGATCCCAC-3’(SEQ ID NO.6)，該引物含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，一個(gè)翻譯終止子和HNB蛋白的編碼序列。
限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamHI和SalI消化pQE-9載體，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。抽提質(zhì)粒，用PstI酶切鑒定插入片段大小及方向，測序驗(yàn)證結(jié)果表明HNB蛋白的cDNA插入片段已正確裝入載體。
過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的HNB蛋白。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫HNB蛋白?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。首先，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白可以結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為45KDa。
此外，用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例4HNB蛋白在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，將編碼HNB蛋白的cDNA序列以實(shí)施例1中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A1/B1為模板，用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，以合成插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TGACAAGCTTATGGCCACAAGTGAACAGAG-3′(SEQ ID NO.7)，該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，接之是由起始密碼子開始的HNB蛋白編碼序列的20個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5’-GTTCGGATCCTTACGTGGTGCTGATCCCAC-3’(SEQ ID NO.8)該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和Ena/VASP蛋白的編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(fl ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用HindIII、BamHI消化pcDNA3載體，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用PstI酶切鑒定插入片段大小及方向，測序驗(yàn)證結(jié)果表明HNB蛋白的cDNA插入片段已正確裝入載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時(shí)后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為45KDa。
此外，用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體如下。將重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀Ena/VASP蛋白基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生沉淀。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人復(fù)旦大學(xué)(ii)發(fā)明名稱新的人蛋白及其編碼序列，以及制法和用途(iii)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1CTCAGGGTTC CCTGTGCTGC CAC 23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2GGGCTTCTGG CTGTCCTCTG TCG 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度1352bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNACTCAGGGTTC CCTGTGCTGC CACTTTTCAG CCATGGCCAC AAGTGAACAG AGTATCTGCC 60AAGCCCGGGC TTCCGTGATG GTCTACGATG ACACCAGTAA GAAATGGGTA CCAATCAAAC 120CTGGCCAGCA GGGATTCAGC CGGATCAACA TCTACCACAA CACTGCCAGC AACACCTTCA 180GAGTCGTTGG AGTCAAGTTG CAGGATCAGC AGGTTGTGAT CAATTATTCA ATCGTGAAAG 240GGCTGAAGTA CAATCAGGCC ACGCCAACCT TCCACCAGTG GCGAGATGCC CGCCAGGTCT 300ACGGCTTAAA CTTTGCAAGT AAAGAAGAGG CAACCACGTT CTCCAATGCA ATGCTGTTTG 360CCCTGAACAT CATGAATTCC CAAGAAGGAG GCCCCTCCAG CCAGCGTCAG GTGCAGAATG 420GCCCCTCTCC TGATGAGATG GACATCCAGA GAAGACAAGT GATGGAGCAG CACCAGCAGC 480AGCGTCAGGA ATCTCTAGAA AGAAGAACCT CGGCCACAGG GCCCATCCTC CCACCAGGAC 540ATCCTTCATC TGCAGCCAGC GCCCCCGTCT CATGTAGTGG GCCTCCACCG CCCCCCCCAC 600CCCCAGTCCC ACCTCCACCC ACTGGGGCTA CCCCACCTCC CCCACCCCCA CTGCCAGCCG 660GAGGAGCCCA GGGGTCCAGC CACGACGAGA GCTCCATGTC AGGACTGGCC GCTGCCATAG 720CTGGGGCCAA GCTGAGAAGA GTCCAACGGC CAGAAGACGC ATCTGGAGGC TCCAGTCCCA 780GTGGGACCTC AAAGTCCGAT GCCAACCGGG CAAGCAGCGG GGGTGGCGGA GGAGGCCTCA 840TGGAGGAAAT GAACAAACTG CTGGCCAAGA GGAGAAAAGC AGCCTCCCAG TCAGACAAGC 900CAGCCGAGAA GAAGGAAGAT GAAAGCCAAA TGGAAGATCC TAGTACCTCC CCCTCTCCGG 960GGACCCGAGC AGCCAGCCAG CCACCTAACT CCTCAGAGGC TGGCCGGAAG CCCTGGGAGC 1020GGAACAACTC GGTGGAGAAG CCTGTGTCCT CGATTCTGTC CAGAACCCCG TCTGTGGCAA 1080AGAGCCCCGA AGCTAAGAGC CCCCTTCAGT CGCAGCCTCA CTCTAGGATG AAGCCTGCTG 1140GGAGCGTGAA TGACATGGCC CTGGATGCCT TCGACTTGGA CCGGATGAAG CAGGAGATCC 1200TAGAGGAGGT GGTGAGAGAG CTCCACAAGG TGAAGGAGGA GATCATCGAC GCCATCAGGC 1260AGGAGCTGAG TGGGATCAGC ACCACGTAAG GGGCCGGCCT CGCTGCGCTG ATTCGTCGAG 1320CCCATCCGGC GACAGAGGAC AGCCAGAAGC CC 1352(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度418個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Ala Thr Ser Glu Gln Ser Ile Cys Gln Ala Arg Ala Ser Val 15Met Val Tyr Asp Asp Thr Ser Lys Lys Trp Val Pro Ile Lys Pro 30Gly Gln Gln Gly Phe Ser Arg Ile Asn Ile Tyr His Asn Thr Ala 45Ser Asn Thr Phe Arg Val Val Gly Val Lys Leu Gln Asp Gln Gln 60Val Val Ile Asn Tyr Ser Ile Val Lys Gly Leu Lys Tyr Asn Gln 75Ala Thr Pro Thr Phe His Gln Trp Arg Asp Ala Arg Gln Val Tyr 90Gly Leu Asn Phe Ala Ser Lys Glu Glu Ala Thr Thr Phe Ser Asn 105Ala Met Leu Phe Ala Leu Asn Ile Met Asn Ser Gln Glu Gly Gly 120Pro Ser Ser Gln Arg Gln Val Gln Asn Gly Pro Ser Pro Asp Glu 135Met Asp Ile Gln Arg Arg Gln Val Met Glu Gln His Gln Gln Gln 150Arg Gln Glu Ser Leu Glu Arg Arg Thr Ser Ala Thr Gly Pro Ile 165Leu Pro Pro Gly His Pro Ser Ser Ala Ala Ser Ala Pro Val Ser 180Cys Ser Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Val Pro Pro Pro 195Pro Thr Gly Ala Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Ala Gly 210Gly Ala Gln Gly Ser Ser His Asp Glu Ser Ser Met Ser Gly Leu 225Ala Ala Ala Ile Ala Gly Ala Lys Leu Arg Arg Val Gln Arg Pro 240Glu Asp Ala Ser Gly Gly Ser Ser Pro Ser Gly Thr Ser Lys Ser 255Asp Ala Asn Arg Ala Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Met 270Glu Glu Met Asn Lys Leu Leu Ala Lys Arg Arg Lys Ala Ala Ser 285Gln Ser Asp Lys Pro Ala Glu Lys Lys Glu Asp Glu Ser Gln Met 300Glu Asp Pro Ser Thr Ser Pro Ser Pro Gly Thr Arg Ala Ala Ser 315Gln Pro Pro Asn Ser Ser Glu Ala Gly Arg Lys Pro Trp Glu Arg 330Asn Asn Ser Val Glu Lys Pro Val Ser Ser Ile Leu Ser Arg Thr 345Pro Ser Val Ala Lys Ser Pro Glu Ala Lys Ser Pro Leu Gln Ser 360Gln Pro His Ser Arg Met Lys Pro Ala Gly Ser Val Asn Asp Met 375Ala Leu Asp Ala Phe Asp Leu Asp Arg Met Lys Gln Glu Ile Leu 390Glu Glu Val Val Arg Glu Leu His Lys Val Lys Glu Glu Ile Ile 405Asp Ala Ile Arg Gln Glu Leu Ser Gly Ile Ser Thr Thr 418(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TGCAGGATCC ATGGCCACAA GTGAACAGAG 30(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6GTTCGTCGAC TTACGTGGTG CTGATCCCAC 30(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TGACAAGCTT ATGGCCACAA GTGAACAGAG 30(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8GTTCGGATCC TTACGTGGTG CTGATCCCAC 30
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人HNB蛋白蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸33-1289位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸33-1289位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸33-1289位的核苷酸序列。
4.一種分離的HNB蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.一種產(chǎn)生具有HNB蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有HNB蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成HNB蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸33-1289位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成HNB蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)HNB蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有HNB蛋白活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求4所述的HNB蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的Ena/VASP基因家族的成員HNB(Human Neonatal Brain,簡稱HNB)。本發(fā)明提供了該新HNB蛋白的cDNA編碼序列、該序列編碼的多肽,以及利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人HNB蛋白的方法。本發(fā)明還提供了這種新的人HNB蛋白的應(yīng)用。
文檔編號C12P21/02GK1264739SQ99102448
公開日2000年8月30日 申請日期1999年2月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月26日
發(fā)明者余龍, 張宏來, 趙勇, 傅強(qiáng), 趙壽元 申請人:復(fù)旦大學(xué)