專利名稱：人尿苷酸-胞苷酸激酶及其編碼序列,以及制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人尿苷酸-胞苷酸激酶(UMP-CMP激酶，UCK)的cDNA序列，其編碼的蛋白是豬UMP-CMP激酶的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
單磷酸核苷酸激酶(EC 2.7.4.-)是一個(gè)分布十分廣泛的酶，它普遍存在于各種原核生物和真核生物中。單磷酸核苷酸激酶能夠催化三磷酸核苷酸與單磷酸核苷酸間可逆的磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移，它在生物核苷酸合成的補(bǔ)救途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而有著重要的生物學(xué)意義。其反應(yīng)一般可以表示為ATP+NMP←→ADP+NDP根據(jù)對(duì)底物的選擇性的差異，可以把單磷酸核苷酸激酶進(jìn)一步分為腺苷酸激酶(AMP kinase，AK)、尿苷酸/胞苷酸激酶(UMP/CMP kinase，UCK)、鳥苷酸激酶(GMP kinase)和胸苷酸激酶(TMP kinase)。其中，AK是研究最為深入的一個(gè)酶。根據(jù)AK結(jié)構(gòu)及其它生物學(xué)特性的差異，又可以的AK類激酶劃分為AK1、AK2和AK3亞類。其中AK1位于脊椎動(dòng)物的胞質(zhì)區(qū)，AK2位于線粒體膜間區(qū)和胞質(zhì)中，而AK3位于線粒體基質(zhì)中。并且AK3更傾向于高效地利用GTP作為磷酸基團(tuán)的供體(Nakazawa，A.et al. Progr.Clin.Biol.Res.334495-514，1990)。通常，雖然單磷酸核苷酸激酶對(duì)磷酸基團(tuán)供體的選擇性并不是很高，但卻更傾向使用ATP為供體。另外，AK2和AK3較之其它成員的蛋白質(zhì)序列長了近30個(gè)殘基，這一差別源于在一個(gè)所謂“LID區(qū)”的長度不同。
UCK(EC 2.7.4.14)是一種在進(jìn)化上與AK相關(guān)的激酶。
生物體內(nèi)的核苷酸的合成除能以簡單前體物質(zhì)進(jìn)行所謂的“從頭合成”以外，尚能由預(yù)先形成的堿基和核苷合成核苷酸，即通過所謂“補(bǔ)救途徑”。這其中，嘧啶核苷酸的通過核苷酸激酶的補(bǔ)救途徑對(duì)于生物來說尤為重要，這其中UCK起著關(guān)鍵的作用。
迄今為止，已有15個(gè)來源不同的UCK蛋白的全長或部分的氨基酸/核苷酸序列被公布。早在1989年，Liljielund，P.等人就從釀酒酵母中分離到了UCK的cDNA順序(Liljielund，P.et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.165464-473，1989)。1990年，Wiesmuller，L.等又從粘菌(Dictyostelium discoideum)的lambdagt11 cDNA文庫中得到了一個(gè)編碼UCK的cDNA克隆(Wiesmuller，L.et al.J.Biol.Chem.265(11)6339-6345，1990)。哺乳動(dòng)物中第一個(gè)UCK來自豬，它是Okajima，T.等從豬腦的lambda gt11 cDNA文庫中分離到的(Okajima，T.et al.J.Biochem.117(5)980-986)。豬的UCK蛋白序列與來自酵母和粘菌的UCK蛋白序列有約50％的一致性。人的UCK蛋白部分序列(N端1-19aa)也已公布(SP|P30085)，然而，其全長蛋白及核酸序列尚未見報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼UMP-CMP激酶家族的一個(gè)新成員，本發(fā)明的UMP-CMP激酶家族成員被命名為人UCK。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的UMP-CMP激酶家族成員即人UCK，該蛋白被命名為人UCK蛋白。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人UCK激酶的方法。
本發(fā)明還提供了這種人的UMP-CMP激酶核酸序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人UCK蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸57-647位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸57-647位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸57-647位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人UCK蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人UCK蛋白活性的多肽的方法，該方法包括
(a)將編碼具有人UCK蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人UCK蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸57-647位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人UCK蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人UCK蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人UCK蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為781個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于57-647位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人UCK蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人UCK蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中57-647位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框57-647位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中57-647位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸57-647位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸57-647位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少85％，更佳地至少95％，最佳至少98％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人UCK相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人UCK蛋白多肽”指具有人UCK蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人UCK相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人UCK蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人UCK DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人UCK多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人UCK多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人UCK多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人UCK多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人UCK蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人UCK多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人UCK保守性變異多肽”指與SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明還包括人UCK多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)人UCK的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人UCK多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼人UCK的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測(cè)人UCK核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于人UCK多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人UCK DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人UCK基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人UCK基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人UCK蛋白的分子，也包括那些并不影響人UCK蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人UCK基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人UCK基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人UCK或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人UCK功能的抗體以及不影響人UCK功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人UCK基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人UCK基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的人UCK核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，人UCK的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人腎λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物——A5’-GCCTTAGCTTCCTGCTGCAGACC-3′為正向引物，寡核苷酸B5′-GTTTTACCATGTACTTTCCAGCCAC-3’為反向引物，進(jìn)行PCR。測(cè)序后得到SEQ ID NO.3的全長cDNA序列。
UCK能夠催化ATP與UMP或CMP之間的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)換反應(yīng)，其結(jié)果是生成UDP或CDP。這一反應(yīng)是生物體內(nèi)的嘧啶類物質(zhì)再循環(huán)利用(即所謂嘧啶核苷合成的補(bǔ)救途徑)的重要環(huán)節(jié)，對(duì)于胞嘧啶來說更是如此。因此，UCK對(duì)于生物體來說具有重要的生物學(xué)意義

圖1為本發(fā)明的人UCK(humUCK)與豬UCK(pigUCK)的氨基酸序列的同源比較圖。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人UCK的cDNA序列的克隆和測(cè)定1.引物擴(kuò)增以人腎λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物——A5’-GCCTTAGCTTCCTGCTGCAGACC-3’(SEQ ID NO1)為正向引物，寡核苷酸B5’-GTTTTACCATGTACTTTCCAGCCAC-3’(SEQ ID NO2)為反向引物，進(jìn)行PCR。A/B的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、66℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)得到約800bp的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測(cè)序?qū)⑸鲜鯬CR擴(kuò)增產(chǎn)物AB與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對(duì)插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對(duì)缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測(cè)序試劑盒(Epicentre Technologies)對(duì)依次截短的缺失子進(jìn)行測(cè)序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共781bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO3，其中開放讀框位于57-647位核苷酸。
根據(jù)得到的全長基因組序列推導(dǎo)出人UCK的氨基酸序列，共196個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO4。
實(shí)施例2同源比較用本發(fā)明的人UCK的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中，用BLAST程序進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們與UCK和AK基因及其編碼蛋白具有廣泛的同源性，特別是與豬的UCK的氨基酸一致性達(dá)到了97％(圖1)。
生物體內(nèi)的核苷酸的合成除能以簡單前體物質(zhì)進(jìn)行所謂的“從頭合成”以外，尚能由預(yù)先形成的堿基和核苷合成核苷酸，即通過所謂“補(bǔ)救途徑”。但是在生物體內(nèi)，除腺苷酸激酶外缺乏其它嘌呤核苷酸激酶。顯然在嘌呤類物質(zhì)的再利用過程中，核苷酸激酶途徑即使不能排除，也是不重要的。然而嘧啶核苷酸激酶在嘧啶的補(bǔ)救途徑中卻起著重要作用。尿嘧啶核苷酸可以以兩種形式的補(bǔ)救途徑合成1)與5-磷酸核糖焦磷酸反應(yīng)；2)尿嘧啶與1-磷酸核糖反應(yīng)產(chǎn)生尿嘧啶核苷，后者在UCK作用下被磷酸化而形成尿嘧啶核苷酸。而胞嘧啶不能直接與5-磷酸核糖焦磷酸反應(yīng)生成胞嘧啶核苷酸，但它能被UTK催化而生成胞嘧啶核苷酸。
本發(fā)明的人UCK除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人UCK還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明的人UCK的N端與豬UCK的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對(duì)本發(fā)明人UCK的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人UCK核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人UCK的表達(dá)水平或者抑制人UCK的過度表達(dá)。本發(fā)明的人UCK蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人UCK缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例3人UCK在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B為模板，將編碼人UCK的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人UCK cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGGGATCCATGAAGCCGCTGGTCGTGT-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人UCK編碼序列的19個(gè)核苷酸；3′端引物序列為
5’-TTGGAAGCTT TTAGCCTTCCTTGTCAAAAAT-3’(SEQ ID NO.6)，該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人UCK的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc..Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamHI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證人UCK的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人UCK。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人UCK?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘撸褂猛肝霾襟E除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為約22KDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例4人UCK在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B為模板，將編碼人UCK的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人UCK cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGAAGCTTATGAAGCCGCTGGTCGTGT-3′(SEQ ID NO.7)該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人UCK編碼序列的19個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5’-TTGGGGATCCTTAGCCTTCCTTGTCAAAAAT-3’(SEQ ID NO.8)該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和人UCK的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(fl ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用HindIII和BamHI消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證人UCK的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測(cè)定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對(duì)混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時(shí)后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTrisáHCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對(duì)表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為22Da。
此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人UCK基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白特異性地發(fā)生沉淀。
實(shí)施例6酶活性測(cè)定按Toshihide，O.等人報(bào)導(dǎo)的方法(J.Biochem.117，980-986，1995；FEBS lett.334，86-88，1993)，在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試混合液(87mM三乙醇胺-HCl(pH 7.5)，10mMMgCl2，100mM KCl，1mM磷酸烯醇丙酮酸，0.16mM NADH，1mM ATP，1mM UMP，20單位的丙酮酸激酶和20單位乳酸脫氫酶)中，對(duì)實(shí)施例3中分離到的人UCK蛋白進(jìn)行酶活性測(cè)定。通過吸光度測(cè)量發(fā)現(xiàn)，在加有人UCK蛋白的反應(yīng)體系中，ATP被消耗，從而證實(shí)人UCK可以催化如下反應(yīng)ATP+UMP←→ADP+UDP在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人復(fù)旦大學(xué)(ii)發(fā)明名稱人尿苷酸-胞苷酸激酶及其編碼序列，以及制法和用途(iii)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1GCCTTAGCTTCCTGCTGCAG ACC 23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度25堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2GTTTTACCAT GTACTTTCCA GCCAC 25(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度781bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO.3GCCTTAGCTT CCTGCTGCAG ACCCGCCGGC CGATTCTCCT CTGCTCTCCA CGTCTCATGA 60AGCCGCTGGT CGTGTTCGTC CTCGGCGGCC CCGGCGCCGG CAAGGGGACC CAGTGCGCCC 120GCATCGTCGA GAAATATGGC TACACACACC TTTCTGCAGG AGAGCTGCTT CGTGATGAAA 180GGAAGAACCC AGATTCACAG TATGGTGAAC TTATTGAAAA GTACATTAAA GAAGGAAAGA 240TTGTACCAGT TGAGATAACC ATCAGTTTAT TAAAGAGGGA AATGGATCAG ACAATGGCTG 300CCAATGCTCA GAAGAATAAA TTCTTGATTG ATGGGTTTCC AAGAAATCAA GACAACCTTC 360AAGGATGGAA CAAGACCATG GATGGGAAGG CAGATGTATC TTTCGTTCTC TTTTTTGACT 420GTAATAATGA GATTTGTATT GAACGATGTC TTGAGAGGGG AAAGAGTAGT GGTAGGAGTG 480ATGACAACAG AGAGAGCTTG GAAAAGAGAA TTCAGACCTA CCTTCAGTCA ACAAAGCCAA 540TTATTGACTT ATATGAAGAA ATGGGGAAAG TCAAGAAAAT AGATGCTTCT AAATCTGTTG 600ATGAAGTTTT TGATGAAGTT GTGCAGATTT TTGACAAGGA AGGCTAATTC TAAACCTGAA 660AGCATCCTTG AAATCATGCT TGAATATTGC TTTGATAGCT GCTATCATGA CCCCTTTTTA 720AGGCAATTCT AATCTTTCAT AACTACATCT CAATTAGTGG CTGGAAAGTA CATGGTAAAA 780C 781(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度196個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Lys Pro Leu Val Val Phe Val Leu Gly Gly Pro Gly Ala Gly 15Lys Gly Thr Gln Cys Ala Arg Ile Val Glu Lys Tyr Gly Tyr Thr 30His Leu Ser Ala Gly Glu Leu Leu Arg Asp Glu Arg Lys Asn Pro 45Asp Ser Gln Tyr Gly Glu Leu Ile Glu Lys Tyr Ile Lys Glu Gly 60Lys Ile Val Pro Val Glu Ile Thr Ile Ser Leu Leu Lys Arg Glu 75Met Asp Gln Thr Met Ala Ala Asn Ala Gln Lys Asn Lys Phe Leu 90Ile Asp Gly Phe Pro Arg Asn Gln Asp Asn Leu Gln Gly Trp Asn 105Lys Thr Met Asp Gly Lys Ala Asp Val Ser Phe Val Leu Phe Phe 120Asp Cys Asn Asn Glu Ile Cys Ile Glu Arg Cys Leu Glu Arg Gly 135Lys Ser Ser Gly Arg Ser Asp Asp Asn Arg Glu Ser Leu Glu Lys 150Arg Ile Gln Thr Tyr Leu Gln Ser Thr Lys Pro Ile Ile Asp Leu 165Tyr Glu Glu Met Gly Lys Val Lys Lys Tle Asp Ala Ser Lys Ser 180Val Asp Glu Val Phe Asp Glu Val Val Gln Ile Phe Asp Lys Glu 195Gly 196(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TCAGGGATCC ATGAAGCCGC TGGTCGTGT 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度31堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6TTGGAAGCTT TTAGCCTTCC TTGTCAAAAAT 31(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TCAGAAGCTT ATGAAGCCGC TGGTCGTGT 29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長度31堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8TTGGGGATCC TTAGCCTTCC TTGTCAAAAA T3權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人UCK蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸57-647位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸57-647位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸57-647位的核苷酸序列。
4.一種分離的人UCK蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.一種產(chǎn)生具有人UCK蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人UCK蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人UCK蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸57-647位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人UCK蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人UCK蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人UCK蛋白活性的多肽。
9.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
10.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了人尿苷酸－胞苷酸激酶(UMP－CMP激酶,UCK)及其編碼cDNA序列,該激酶是豬UMP－CMP激酶的同系物。本發(fā)明還涉及這些多肽和核酸編碼序列的應(yīng)用,以及所述核酸序列和所述多肽的生產(chǎn)方法。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1264740SQ99102449
公開日2000年8月30日 申請(qǐng)日期1999年2月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月26日
發(fā)明者余龍, 趙勇, 傅強(qiáng), 張宏來, 趙壽元 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)