一種來源于大腸桿菌的離子通道基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明將一種來源于大腸桿菌的離子通道基因ENHX2基因轉入植物并使得這種轉基因植物能夠具備增加植物抗鹽性的作用。所述離子通道基因ENHX2含1650個堿基，編碼的氨基酸549個；所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?NO2所示。本發(fā)明中來源于釀離子通道蛋白基因ENHX2采用人工方法合成，轉基因植物具備較高的抗鹽性。
【專利說明】一種來源于大腸桿菌的離子通道基因及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于作物遺傳育種領域，具體涉及一種來源于大腸桿菌的離子通道基因的 序列，利用農桿菌將該基因轉化到植物中，使植物耐鹽能力得到提高。

【背景技術】
[0002] 鹽漬化土壤是廣泛分布的不利于植物生長的一種土地，鹽分脅迫嚴重影響著植物 的正常生長發(fā)育。土壤鹽堿化問題引起了世界各地學者的日益關注，成為現(xiàn)代土壤學研究 的熱點。所謂鹽土是指土壤飽和提取液中電導率（EC)高于4 ds / m，并且可交換性鈉百分 數(shù)（ESP)的含量低于15%的土壤，這些土壤的pH -般為中性偏堿，當ESP高于15 %、pH大 幅上升時的鹽土又稱為鹽堿土。鹽堿土在陸地生態(tài)系統(tǒng)上分布廣泛，全世界鹽漬土面積約 10億公頃。在全球的干旱和半干旱地區(qū)，約有50%的灌溉土地受到鹽堿化的影響，區(qū)域內 的非灌溉土地同樣會發(fā)生鹽堿化。在我國從濱海到內陸，從低地到高原都分布著不同類型 的鹽堿土壤，鹽漬土面積約3 460萬公頃，鹽堿化耕地760萬公頃，即近1 / 5耕地發(fā)生鹽 堿化。
[0003] 人們就逆境對植物影響的認識和研究，首先是從表觀生理指標一般性描述開始， 其次研究植物在各種逆境下產生的生理生化、生態(tài)變化和生理調節(jié)機制，最后發(fā)展到分子 水平，進一步探討植物對不同逆境的感應、信號傳導、基因表達與調控、蛋白質組裝和細胞 膜功能獲得。為更深入了解植物對不同逆境響應的分子機理和研究人工調控的生物技術等 方面展示出良好前景。
[0004] 抗鹽能力因種而異，抗鹽性強的植物原生質膜具有極低的透性，在同種鹽漬條件 下，吸收鹽類明顯少于抗鹽弱的品種，在一定程度上加強了拒鹽的作用。所以可利用生理生 化指標鑒定、組織培養(yǎng)、轉基因等技術培育新的抗鹽作物品種，使其適應鹽堿土環(huán)境 本項發(fā)明利用PTDS法合成了來源于大腸桿菌的離子通道基因，將該基因轉化擬南芥， 進而提高了轉基因擬南芥的抗鹽能力，該基因對于培育植物抗鹽的植物品種非常重要，具 有重要的理論意義和現(xiàn)實意義。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題在于將一種來源于大腸桿菌的離子通道基因 iJWC 轉入植物體內，并對該轉基因植物進行功能驗證，以證明它具有提高植物的耐鹽性的功能。
[0006] 一種來源于大腸桿菌的離子通道基因烈，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示， 其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0007] 所述來源于大腸桿菌的離子通道基因烈ffiU長1650bp，編碼的氨基酸549個。 [0008] 所述來源于大腸桿菌的離子通道基因 iJWC通過農桿菌介導轉入擬南芥，應用于 植物耐鹽性。
[0009] 所述來源于大腸桿菌的離子通道基因采用人工方法合成，具體包括以下步驟： 的人工合成 依照PTDS(PCR_based two-step DNA synthesis，PTDS)方法進行源自大腸桿菌的離子 通道基因進行化學合成，在保持iJWC基因的氨基酸序列不變的基礎上，設計引物合成了 基因。
[0010] 2 ) 農桿菌雙元載體的構建 萬船恐基因植物雙元載體在pcAMBIA-1301載體的基礎上構建而成，在pCAMBIA-1301 載體的多克隆位點處插入兩端附加了煙草的染色質附著SAR序列的外源基因的表達單元， 這有利于轉基因的穩(wěn)定遺傳；在外源基因的表達單元內，我們在目的基因的兩側導入了 BamHI和Sacl酶切位點，便于外源基因的插入，外源基因的表達由雙CAMV355啟動子+TMV omega leader sequence 控制 3)電擊法轉化農桿菌 參照 MicroPulser? Electroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide (BIO-RAD公司）制備農桿菌GV3101感受態(tài).并且將構建好的農桿菌 雙元載體經電擊法轉入到農桿菌中。
[0011] 4)農桿菌介導轉化擬南芥 利用蘸花法將構建好的農桿菌轉入擬南芥體內.首先將擬南芥的花苔浸入滲透液中， 輕輕攪動約3?5秒后取出，全部轉化完畢后，托盤中加入PNS營養(yǎng)液，以黑色塑料袋套盆 封口，保持濕潤環(huán)境，置于22°C培養(yǎng)室，低光強度下生長24小時，即可正常培養(yǎng)。生長約兩 個月后，收集種子，4 °C冰箱貯存待用。
[0012] 5)擬南芥轉化植株種子的篩選 將得到的種子進行篩選，包括GUS組織化學染色分析和轉基因陽性植株的PCR檢測得 到轉入EWC基因的擬南芥。
[0013] 6)轉基因擬南芥耐鹽性驗證 將轉化植物自交純合3代，獲得純合轉化株，收取種子。播種后，在22°C生長兩個星 期。然后將野生型和轉基因培養(yǎng)皿小苗用于耐鹽抗性實驗。F分別用不同濃度的NaCl溶液 處理野生型和轉基因擬南芥株系。鹽處理14d，結果顯示在150、200 mmol/L NaCl處理下 野生型生長明顯受抑制，葉片發(fā)黃，而轉基因株系抑制較小。結果說明iJWC基因明顯提高 了擬南芥的耐鹽性。
[0014] 本發(fā)明實現(xiàn)的有益效果 本發(fā)明采用PTDS法合成了來源于大腸桿菌的離子通道基因，為了進一步分析該基因 在鹽堿逆境中的作用與功能，我們比較了轉原基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株 的耐鹽性。結果表明，野生型和轉iJWC基因擬南芥植株在表型上有很大的差異。結果顯示 在150mmol/L NaCl處理下野生型生長明顯受抑制，葉片發(fā)黃，而轉基因株系抑制較小。結 果說明βνΛΚ?基因明顯提高了擬南芥的耐鹽性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是用于擬南芥轉化的植物表達載體示意圖。
[0016] 圖2是獲得的轉基因擬南芥的⑶S染色圖。
[0017] 圖3是轉原辦^基因擬南芥與野生型擬南芥的耐鹽表型圖。
[0018]

【具體實施方式】
[0019] 以下結合附圖詳細描述本發(fā)明的技術方案。應當說明的是，所述實施例僅用以說 明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的 普通技術人員應當理解，可以對發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明 技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍中。
[0020] 本發(fā)明所用的試驗材料及其來源包括： 野生型擬南芥)生態(tài)型擬南芥，23 °C人工氣候室培 養(yǎng)，16 h光照培養(yǎng)。
[0021] 克隆載體pMD-18-Simple T、各類限制性內切酶、Taq聚合酶、連接酶、dNTP、 10XPCR buffer和DNA marker購自寶生物工程大連有限公司。所有的化學試劑都從美國 西格瑪化學公司和上海國藥化學試劑購買。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA測序試劑 盒購自美國應用系統(tǒng)公司。
[0022] 本發(fā)明所用的試劑若未明確指明，則均購自西格瑪一奧德里奇（Sigma - Aldrich)。
[0023] 本發(fā)明涉及分子生物學實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書（J.薩 姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994,科學出版社)。
[0024] 實施例1 大腸桿菌基因的人工合成 根據(jù)Genbank登錄的大腸桿菌ENHX2基因序列（ABJ03869)，用以基因合成方法 【Nucleic Acids Research, 2004，32，e98】，在不改變基因編碼的氨基酸序列的前提下， 按以下原則進行合成基因編碼區(qū)的設計：（一)優(yōu)化基因密碼子，提高基因翻譯效率。（二)消 除基因內部的常用限制性內切酶的識別位點，便于表達盒構建。（三)消除逆向重復序列、莖 環(huán)結構和轉錄終止信號，使基因內部的GC/AT均衡，提高RNA的穩(wěn)定性。（四)使基因編碼蛋 白符合N端原則（Tobias 1991)，以提商翻譯蛋白的穩(wěn)定性。（五）設計提商基因5'端的自 由能，以提商基因翻譯起始效率。
[0025] 擴增條件為：94°C 預熱 1 min ;94°C，30 s，50°C，30 s，72°C，2 min，使用的 Taq DNA聚合酶為KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本)，共25個循環(huán)。
[0026] PCR結束后，1%瓊脂糖膠回收，取10 μ?直接與T/A克隆載體相連(大連寶生物 公司）。4°C連接過夜，高效轉化DH5 α感受態(tài)中。獲得陽性克隆。
[0027] 實施例2 農桿菌雙元載體的構建 上述人工合成的烈ffiU基因的陽性克隆用引物SP1基因0RF經PCR擴增后頭尾分別加 入Bam HI和Sac I切點，經Bam HI + Sac I雙酶切，回收DNA片段與相應酶切的載體相連， 經酶切鑒定和測序后得到正確的雙元載體(見圖1)。
[0028] 實施例3 電擊法轉化農桿菌 1)制備農桿菌 GV3101 感受態(tài)，方法參照 MicroPulser? Electroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide (BIO-RAD 公司）((Raineri et al., Bio. Tech·, 1990， 8: 33-38)。
[0029] 2)取50yL GV3101感受態(tài)細胞，加入lyL DNA，轉入0.2 cm電擊杯轉化（400Ω， 2. 5KV，25y f)。加入1 mL含有1%甘露醇的LB培養(yǎng)基恢復培養(yǎng)2小時（28°C，250rpm)。分 別取10 μ L、100 μ L涂LB平板(利福平50 μ g/mL，慶大霉素50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/mL)。
[0030] 3)挑取幾個克隆，堿法抽提農桿菌質粒，酶切鑒定，PCR檢測。
[0031] 實施例4 農桿菌介導轉化擬南芥 A擬南芥的培養(yǎng) 1)擬南芥種子在4°C進行2 - 3天的春化處理，目的是有利于種子的一致萌發(fā)和花期 的提前。
[0032] 2)將蛭石、黑土、珍珠巖按9 :3 :0. 5的比例拌勻，經高溫滅菌后裝于10cm的塑料 小盆，以營養(yǎng)液PNS浸濕待用。
[0033] 3)以牙簽將擬南芥種子點播于濕潤的基質上，保鮮膜封口。放置于22°C暗培養(yǎng) 2 - 3天，待種子萌發(fā)后，揭開保鮮膜，置于22°C培養(yǎng)室中進行16小時光照培養(yǎng)。
[0034] 4)擬南芥抽苔后及抽苔后兩周以及轉化后需再以PNS營養(yǎng)液浸濕一次。中途可視 情況適當澆水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生長，當次生苔長至2 - 10cm(少 數(shù)已經開花）可用于轉化(何玉科，鞏振輝，細跑生物學雜志，1991，13(3) :97-101 )。
[0035] B農桿菌的準備 1) 挑取農桿菌單菌接種于5mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/mL) 中，28°C，250rpm 培養(yǎng) 20 小時。（Rashid et al·，1996) 2) 取lmL菌液轉接入20 - 30mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/mL) 中，28°C，250rpm 培養(yǎng)約 12 小時，測 0D600 ~ L 5。
[0036] 3) 8000rpm，4°C，10min離心收集菌體，重懸于農桿菌轉化滲透液（5%鹿糖，0· 05% Silwet L-77)并稀釋至 0D600 ?0· 8。
[0037] C擬南芥蘸花法轉化 1)將擬南芥的花苔浸入滲透液中，輕輕攪動約3?5秒后取出，全部轉化完畢后，托盤 中加入PNS營養(yǎng)液，以黑色塑料袋套盆封口，保持濕潤環(huán)境，置于22°C培養(yǎng)室低光強度下生 長24小時，即可正常培養(yǎng)。
[0038] 2)初次轉化四天后，可再進行一次轉化，重復兩次，總共轉化三次，這樣可以在花 發(fā)育的不同時期進行轉化，提高轉化效率。
[0039] 3)生長約兩個月后，收集種子，4°C冰箱貯存待用。
[0040] 實施例5 擬南芥轉化植株種子的篩選 1)稱25 - 30mg種子放入1. 5mL離心管。
[0041] 2) lmL 75%乙醇消毒lmin (不停搖晃振蕩），8000rpm離心5秒，去上清。
[0042] 3)加入lmL過濾后的漂白粉消毒15min (不停搖晃振蕩，充分消毒），8000rpm離 心5秒，去上清。
[0043] 4)無菌水洗滌3 - 4次。
[0044] 5)將種子均勻的播撒到1/2MS平板（Hyg 50yg/mL)上，Parafilm膜封口，4°C冰 箱放置兩天，22°C，16小時光照培養(yǎng)6天。
[0045] 6)將抗性植株移栽到盆中培養(yǎng)，苗稍大后，進行GUS活性檢測，選出陽性植株（T1) 繼續(xù)培養(yǎng)，并收集種子進行T2代和T3代篩選。
[0046] 實施例6 轉基因陽性植株的檢測 按Jefferson (1978)的方法，將待測擬南芥葉片樣品與X-Gluc染色反應液（50m mol/ L NaH2P04，pH7.0 ;0· 5m mol/L K4[Fe(CN)6]，0.1% Triton X-100,20% 甲醇，0.5mg/mL X-Gluc [X-glucuronide])于37°C保溫2 - 4小時后，用75%乙醇脫色觀察(見圖2)。
[0047] 實施例7 大腸桿菌離子通道iJWZJ?基因轉化植物后的耐鹽分析 將轉化植物自交純合3代，獲得純合轉化株，收取種子。播種后，在22°C生長兩個星 期。然后比較了轉iJWC基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株的耐鹽性。結果表明，野 生型和轉烈ffiU基因擬南芥植株在表型上有很大的差異。結果顯示在150mmol/L NaCl處 理下野生型生長明顯受抑制，葉片發(fā)黃，而轉基因株系抑制較小。結果說明iJWC基因明顯 提高了擬南芥的耐鹽性（圖3)。
[0048]
【權利要求】
1. 一種來源于大腸桿菌的離子通道基因基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2. 根據(jù)權利要求1所述的來源于大腸桿菌的離子通道基因，其特征在于，其氨基酸序 列如SEQ ID NO 2所示。
3. 權利要求1或2所述的來源于大腸桿菌的離子通道基因采用人工方法制備而成。
4. 權利要求1或2所述的來源于大腸桿菌的離子通道基因采用農桿菌蘸花法轉化擬南 芥。
5. 權利要求1或2所述的來源于大腸桿菌的離子通道基因轉基因植物在抗鹽性中的應 用。
【文檔編號】C12N15/82GK104140970SQ201310163235
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年5月7日 優(yōu)先權日:2013年5月7日
【發(fā)明者】薛永, 殷浩, 蔣小輝, 侯曉光, 吳順霞, 侯曙光, 周惠, 王瑞, 伍光彩, 張揚 申請人:南京博歐生物科技有限公司