專利名稱：牛FcγRI、FcγRⅢ和CD14的cDNA序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子和細胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及牛的DNA序列，特別是涉及對牛FcγRI，F(xiàn)cγRIII和CD14的cDNA序列分析。眾所周知，人和動物對病原體的抵抗力(免疫力)有特異性和非特異性之分，采取一些人為的措施和手段例如接種疫苗，注射免疫球蛋白，服用中草藥免疫增強劑等都可以引起機體的免疫反應(yīng)，從而達到提高人和動物的免疫能力的目的。免疫反應(yīng)包括細胞免疫和體液免疫兩種應(yīng)答形式。當(dāng)機體遇到病原細菌感染時，即產(chǎn)生以抗體為主的體液免疫；若人和動物體遇到病毒、霉形體或寄生蟲等病原體感染時，產(chǎn)生以細胞因子為主的細胞免疫應(yīng)答，但二者不是單獨作用，而是相輔相成并有機地結(jié)合在一起，共同對付病原體。事實證明，免疫球蛋白G(IgG)是抗體的主要成份，當(dāng)體內(nèi)免疫反應(yīng)啟動時，IgG通過與細胞表面的Fc受體結(jié)合，激活靶細胞，使后者產(chǎn)生并釋放細胞因子及其它活性物質(zhì)，誘發(fā)機體一系列免疫反應(yīng)，最終將病原體殺死或清除。由此看來，存在于白細胞表面的IgG的Fc受體在機體的免疫反應(yīng)中扮演著極其重要的角色。
免疫球蛋白G的Fc受體(FcγR)包括牛FcγRI、FcγRII和FcγRIII，它們分別被稱為CD64、CD32和CD16。其主要功能是參與機體對異物的識別和清除，ADCC、抗原的處理和提呈、抗體和細胞因子產(chǎn)生的調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，在機體細胞免疫和體液免疫中起橋梁作用。CD14為革蘭氏陰性細菌細胞壁主要成份脂多糖(LPS)及脂多糖結(jié)合蛋白復(fù)合物(LBP)的受體，也是一種白細胞分化抗原，它在機體細胞因子產(chǎn)生調(diào)控方面，尤其在病原體為革蘭氏陰性菌的疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸方面起著重要作用。因此，研究這些受體和CD14的結(jié)構(gòu)不但在理論上有助于理解其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，闡明它在體內(nèi)的作用機制，還可以從實踐中進一步探索提高機體免疫能力的方法。
近年來對IgG Fc受體的研究已成為分子免疫學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點。據(jù)我們查新檢索，與本研究相關(guān)的文獻國外有3篇，國內(nèi)尚無此類報道。1992年英國學(xué)者Symons用分子雜交方法獲得了牛FcγRI的部分編碼基因(約0.7kb)，但不是全長基因，未能反映出FcγRI的全部基因結(jié)構(gòu)；另外，Collins等英國學(xué)者在1997年發(fā)表了用RT-PCR方法獲得來源于牛腸系膜淋巴結(jié)單核細胞的牛FcγRIII的編碼基因，全長為0.75kb，我們獲得的牛FcγRIII的編碼基因為0.5kb，和Collins等報道的差異較大，可能屬于另一類型；日本學(xué)者Ikeda等在1997年發(fā)表了牛CD14的全長基因序列，但他們是從染色體基因中獲得的，在其編碼序列中含有內(nèi)含子，我們是從反轉(zhuǎn)錄后的cDNA文庫中調(diào)取的編碼牛CD14的全長基因，不含有內(nèi)含子，更能反映牛CD14mRNA的真實結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的目的在于以牛做為反芻動物的代表對其IgG Fc受體FcγRI、FcγRIII及CD14的編碼基因進行克隆和序列分析。
本發(fā)明的技術(shù)方案是用健康牛的肺巨噬細胞構(gòu)建牛的cDNA文庫，采用標(biāo)記磁微粒技術(shù)結(jié)合PCR方法對構(gòu)建的牛肺巨噬細胞cDNA文庫進行篩選，分別克隆到了牛的FcγRI，F(xiàn)cγRIII和CD14的編碼基因。
其具體的做法是(1)首先構(gòu)建牛的cDNA文庫。用PBS將肺泡中的巨噬細胞洗出，用尼龍膜過濾除去沉淀后制成細胞懸液，用CsCl作墊層進行超速離心以提取牛肺巨噬細胞的總RNA，再用OLIGO(dT)柱層析方法分離出mRNA，用隨機引物將提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。加T4DNA聚合酶補平，再將含有BstXI酶切質(zhì)粒pCDM8，回收大片段，然后用修飾過的cDNA與pCDM8大片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061/P3，構(gòu)成牛的cDNA文庫。
(2)將一定數(shù)量的COS-7細胞鋪到培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)至50％連成片時(約24h)，每孔各加進一定量的牛肺巨噬細胞cDNA文庫和轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染24h后，倒掉培養(yǎng)液，用不含血清的DMEM洗一次，加EDTA消化COS-7細胞，并收集到離心管中。
(3)分別用雞的卵清蛋白或抗牛CD14單克隆抗體按要求標(biāo)記磁微粒。取適量標(biāo)記磁微粒加到所收集的COS-7細胞中，混勻并在室溫下孵育，將管子放在一塊磁鐵上片刻，待磁微粒沉淀后棄上清，重復(fù)洗3次，然后提取沉淀細胞中的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
(4)參考牛FcγRI和FcγRIII的已知基因片段序列，以及人和小鼠CD14基因中的保守序列，用引物分析軟件設(shè)計一對引物，隨機挑取轉(zhuǎn)化子，按每10個為一組，混合培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA并進行PCR擴增，待有特異性DNA條帶時，再用PCR擴增該組的單個菌落的質(zhì)粒DNA，直到篩選到單個的陽性菌落為止。
(5)提取單個陽性菌落的質(zhì)粒DNA，將插入片段亞克隆至克隆載體中，用自動序列測定系統(tǒng)，進行熒光素標(biāo)記測序。


圖1為牛FcγRIcDNA的核苷酸序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列。從圖1中可以看出，牛FcγRI的cDNA序列共1.4kb，其中含有編碼基因1047bp，共編碼349個氨基酸，含有16個氨基酸組成的信號肽序列和有23個氨基酸組成的穿膜區(qū)以及5個可識別的N-連接糖基化位點，另有6個半胱氨酸組成的三個環(huán)狀胞外結(jié)構(gòu)域。
圖2為牛FcγRIII的cDNA序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列。從圖2中可以看出，牛FcγRIII cDNA序列共590bp，其中含有編碼基因504bp，共編碼168個氨基酸，它含有16個氨基酸組成的信號肽序列，22個氨基酸組成的穿膜區(qū)和3個可識別的N-連接糖基化位點，另有一個C2環(huán)狀胞外結(jié)構(gòu)域。
圖3為牛CD14的cDNA序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列。從圖3中可以看出，牛CD14的cDNA序列共有1166bp，含有編碼基因1119bp，共編碼373個氨基酸。其中含有20個氨基酸構(gòu)成的信號肽序列和3個可識別的N-連接糖基化位點。
實施例一，牛FcγRI cDNA序列的克隆方法及測序。
用上述方法構(gòu)建牛cDNA文庫，將一定數(shù)量的COS-7細胞(購自中國科學(xué)院上海細胞學(xué)研究所)鋪到培養(yǎng)孔中，在37℃培養(yǎng)至50％連成片時，約24h，每孔各加入2μg牛肺巨噬細胞cDNA文庫和20μl轉(zhuǎn)染試劑(Gibco公司，美國)，轉(zhuǎn)染24h，倒培養(yǎng)液，用不含血清的DMEM(Gibco公司，美國)洗一次，加0.02％的EDTA消化COS-7細胞，并收集到E ppendorf管中。
用雞卵清蛋白(華美生物工程公司)按說明書要求標(biāo)記磁微粒[DynabeadsM450(Tosylactivated)購自挪威Dynal A.S公司]后，再加?？闺u卵清蛋白的血清吸附標(biāo)記的磁微粒，然后取該磁微粒100μl(1∶10稀釋)加到COS-7細胞中，混勻并在室溫下孵育30min，將存放有細胞的Eppendorf管放于一磁鐵上片刻，等到磁微粒沉淀后棄上清液，再加適量PBS，重復(fù)洗3次，然后按Hirt法提取沉淀細胞中的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061/P3(購于Invitrogen公司)。
采用Symons等發(fā)表的編碼牛FcγRI的部分基因片段，用引物分析軟件設(shè)計一對PCR引物，F(xiàn)1為5′CGATGACAGTGGTGAATA，F(xiàn)2為5′-GGCTGCGCTTGATAAGAT。隨機挑取轉(zhuǎn)化子，按每10個為一組，混合培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA并進行PCR擴增，反應(yīng)程序為94℃變性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，共進行30個循環(huán)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，待有特異性DNA條帶時，再用PCR擴增該組的單個菌落的質(zhì)粒DNA，直到篩選到單個的陽性菌落為止。提取單個陽性菌落的質(zhì)粒DNA，將插入片段亞克隆至pUC19(購自華美生物工程公司)，用ABI公司的373A自動序列測定系統(tǒng)進行熒光素標(biāo)記測序，可獲得前面公布圖1的核苷酸序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列及分析結(jié)果。
序列分析表明，牛FcγRI由349個氨基酸構(gòu)成，其氨基酸序列與人和小鼠FcRI的同源性分別為64.8％和61.9％。
實施例二，牛FcγRIII cDNA序列的克隆方法及測序。
1、牛肺巨噬細胞cDNA文庫的構(gòu)建同實施例一，不重述。
2、PCR引物的設(shè)計及合成參照Collins等發(fā)表的從牛腸系膜淋巴結(jié)的單核細胞中獲得的FcγRIII的基因序列，用OLIGO引物分析軟件(4.1版)設(shè)計一對引物上游引物為5′-CACTCTAACACACAGCATGT，下游引物是5′-TGGGTGAAGGATCCTCAGAT，后者含有BamHI酶切位點，引物由中國科學(xué)院微生物研究所合成。
3、PCR擴增條件及其產(chǎn)物的鑒定取牛cDNA文庫4μl，加dNTP至終濃度為200μM，MgCl2為1.5mM，上下游引物各為0.2μM，Taq酶1.5U，總體積50μl，反應(yīng)條件為94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，共進行30個循環(huán)，然后進行瓊脂糖凝膠電泳和酶切鑒定。
4、PCR產(chǎn)物的克隆和序列分析，先用Wizard PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Promega公司，美國)按說明書要求對PCR產(chǎn)物進行純化，再將PCR產(chǎn)物用Klenow酶補平，用BamHI酶切后，與Puc19-SmaI-BamhI連接，構(gòu)成pUR3.
5、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選重組子，將酶切鑒定過的重組子用Qiagen試劑盒(GmbH公司，德國)提取并純化后，再用373A自動序列測定系統(tǒng)進行熒光素標(biāo)記測序，可獲得前面公布圖2的牛FcγRIII的cDNA核苷酸序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列及分析結(jié)果。
實施例三，牛CD14 cDNA序列的克隆方法及測序。
按上述方法構(gòu)建牛肺巨噬細胞cDNA文庫。COS-7細胞、磁微粒、大腸桿菌MC1061/P3、穿梭質(zhì)粒pCDM8和質(zhì)粒pUC19，其來源同實施例一或二，不再注明。
單克隆抗體CC-G33的制備用Tritonx-100裂解分離的牛外周血白細胞，離心取上清，再用Sepharose柱進行親和層析，取純化物免疫SPF Balb/c小鼠制備單克隆抗體，用FACSan技術(shù)鑒定單抗的特異性。
磁微粒的抗體標(biāo)記取4×107個Dyhabeads，加單克隆抗體CC-G33約5μg，按說明書要求進行標(biāo)記。
陽性細胞的篩選按1×105個/孔的數(shù)量將COS-7細胞鋪到6孔培養(yǎng)板(35mm)中，37℃培養(yǎng)至50％連成片時(約24h)，按Lipofectin試劑盒(GibcoBRL公司，美國)說明書要求進行轉(zhuǎn)染，每孔加2μg cDNA文庫和20μl轉(zhuǎn)染劑。轉(zhuǎn)染24h后倒去培養(yǎng)液，用不含血清的DMEM洗一次，加0.02％的EDTA消化COS-7細胞，并收集到Eppendorf管中，洗后加標(biāo)記磁微粒100μl(1∶10稀釋)，混勻并在室溫下孵育30min，將管子放于一磁鐵上片刻，待磁粒沉淀后棄上清，再加適量PBS，重復(fù)3次，然后按Hirt法提取沉淀細胞中的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1063/P3。
PCR引物的設(shè)計和重組質(zhì)粒的鑒定參考人和小鼠CD14基因中的保守序列，用OLIGO引物分析軟件(4.1版)設(shè)計一對引物，hu2(5′-GAGCATTGCCCAAGCACACT)和Hu3(5′-GCCCAGCGAACGACAGATTG)，擴增長度為308bp。隨機挑取轉(zhuǎn)化子，按每10個為一組，混合培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA并進行PCR擴增，反應(yīng)條件為94℃變性1min，60℃退火1min和72℃延伸1min，共進行30個循環(huán)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，待有特異性DNA條帶時，再用PCR擴增該組的單個菌落的質(zhì)粒DNA，直到篩選出單個的陽性菌落為止。
牛CD14基因的克隆和序列分析用HindIII和XbaI雙酶切重組質(zhì)粒，回收插入片段，亞克隆至pUC19中，再用373A自動序列測定系統(tǒng)(ABI，美國)進行熒光素標(biāo)記測序。獲得前面公布圖3的核苷酸序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列及分析結(jié)果。
牛CD14與人及鼠的CD14同源性比較通過序列比較發(fā)現(xiàn)，牛CD14基因的核苷酸序列與人及小鼠的CD14的同源性分別為78％和69％，所推導(dǎo)的氨基酸序列與人CD14的同源性為73.5％，而與鼠CD的同源性僅為61.4％，三者之間的氨基酸序列的同源性為55％。
權(quán)利要求
1.一種牛FcγRI的cDNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cDNA序列，含有核苷酸序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cDNA序列，核苷酸序列中含有編碼基因1047個堿基對(bp)，共編碼349個氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cDNA序列，所推導(dǎo)的氨基酸序列中含有16個氨基酸組成的信號肽序列、23個氨基酸組成的穿膜區(qū)和5個可識別的N-連接糖基化位點，另有6個半胱氨酸組成的三個環(huán)狀胞外結(jié)構(gòu)域。
5.一種牛FcγRIII的cDNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的cDNA序列，含有核苷酸序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的cDNA序列，核苷酸序列中含有編碼基因504bp，共編碼168個氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的cDNA序列，所推導(dǎo)的氨基酸序列中含有16個氨基酸組成的信號肽序列、22個氨基酸組成的穿膜區(qū)和3個可識別的N-連接糖基化位點，另有一個C2環(huán)狀胞外結(jié)構(gòu)域。
9.一種牛CD14的cDNA序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的cDNA序列，含有核苷酸序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的cDNA序列，核苷酸序列中含有編碼基因1119bp，共編碼373個氨基酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的cDNA序列，所推導(dǎo)的氨基酸序列中含有20個氨基酸構(gòu)成的信號肽序列和3個可識別的N-連接糖基化位點。
全文摘要
本發(fā)明涉及牛的DNA序列,特別是涉及對牛FcγRI,FcγRⅢ及CD14進行分子克隆和cDNA序列分析。采用健康牛肺巨噬細胞構(gòu)建牛cDNA文庫,用標(biāo)記磁微粒技術(shù)結(jié)合PCR方法對構(gòu)建牛cDNA文庫進行篩選,分別克隆到了牛FcγRI,FcγRⅢ和CD14的編碼基因。牛FcγRIcDNA序列含有核苷酸1.4kb,其中含有編碼基因1047bp,共編碼349個氨基酸;牛FcγRⅢcDNA序列590bp,其中含有編碼基因504bp,共編碼168個氨基酸;牛CD14cDNA序列1166bp,含有編碼基因1119bp,共編碼373個氨基酸。
文檔編號C12N15/12GK1266900SQ99103330
公開日2000年9月20日 申請日期1999年3月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月16日
發(fā)明者閻玉河, 張改平, 鄧瑞廣, 李培慶, 楊艷艷, 李學(xué)伍, 郭軍慶, 李青梅, 王愛萍 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所